火麻仁分离蛋白（hemp seed protein isolate，HPI）具有丰富的必需氨基酸，是公认的优质植物蛋白质资源。虽然我国工业火麻种植量以及火麻仁产量巨大，但缺乏对火麻仁的精深研究与开发利用，市场上火麻仁的高附加值产品也相对匮乏，造成火麻仁资源极大浪费[1]。HPI 中含量较高的二硫键易形成分子间二硫键，能使蛋白质分子在中性条件下聚集沉淀，从而导致其溶解性、持水性、起泡性等功能性较差，限制其在食品工业中的应用[2]。因此，通过对HPI 进行结构修饰以提高其功能性质，有益于HPI 资源在食品工业中的应用。
乳液凝胶体系作为一种典型的食品体系，在食品领域的应用前景广阔。许多常见食品，例如蛋黄酱、冰淇淋、酸奶等均属于乳液凝胶体系[3]。已有文献报道，基于大分子复合物稳定的乳液凝胶，其复合物分子间的静电相互作用有助于形成致密的凝胶网络结构[4]。丁俭等[5]研究发现，天然的大豆蛋白与大豆可溶性多糖结合后乳化性较差，但通过超声预处理可以提高乳化性，同时增强乳液的冻融稳定性。耿肖倩[6]研究发现，天然米渣蛋白溶解性较差，需要先通过酶解的方法得到改性蛋白，再与黄原胶进行复合，所得到的复合物具有较好的稳定乳浊液得能力。Cabezas 等[7]研究发现，加热预处理（90 ℃，15 min）后得到的乳清蛋白与可溶性大豆多糖复合形成的乳液具有更高的冻融稳定性和耐酸稳定性。
动态高压微射流（dynamic high pressure microflu idization，DHPM）是一种新兴的高压物理技术，具有处理时间短、处理温度低、营养损失少、外源物质添加少的优点[8]，近年来常被应用于改善蛋白质等生物大分子的理化性质和功能特性。Ge 等[9]研究发现DHPM 可显著提高杜仲籽粕蛋白的溶解度和乳化特性；敬思群等[10]利用DHPM 对大豆分离蛋白/多糖复合溶液进行处理，发现DHPM 产生的超高压有利于蛋白质与多糖有效结合，形成复合物。目前，基于DHPM 技术修饰改性蛋白质以构建乳液凝胶体系的研究鲜见报道。
本研究采用DHPM 技术对HPI 进行改性，将改性后的蛋白与黄原胶（xanthan gum，XG）进行复配得到HPI/XG 复合物，并将复合物作为乳化剂，以亚麻籽油为油相构建Pickering 乳液凝胶。通过质地、微观结构、流变特性等指标考察HPI/XG 不同复配质量比对所得乳液凝胶理化性质的影响，并进一步揭示乳液凝胶的冻融稳定性与贮藏稳定性的变化规律，为植物蛋白基乳液凝胶的构建及其在食品体系的应用提供新策略。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脱脂火麻蛋白粉（纯度≥75%）：辽宁俏牌生物科技有限公司；亚麻籽油（α-亚麻酸含量约53%）：青岛海智源生命科技有限公司；黄原胶（生物试剂）：上海源叶生物科技有限公司；硫酸亚铁（分析级）：天津市大茂化学试剂厂；硫氰酸铵、硫代巴比妥酸（均为分析级）：国药集团化学试剂有限公司；正丁醇、异丙醇、异辛烷、甲醇、三氯甲烷（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
纳米对撞机（NCJJ7/200）：廊坊通用机械制造有限公司；均质分散机（T25）：德国IKA 公司；高速冷冻离心机（CR22N）：日本HITACHI 公司；多功能酶标仪（M200）：瑞士TECAN 公司；荧光倒置显微镜（Ti-s）：日本Nikon 公司；流变仪（Discovery HR-2）：美国TA公司；紫外可见分光光度计（UV-2100B）：美国安捷伦公司；电热恒温干燥箱（PH-05A）：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 HPI 的制备
HPI 的制备参照Feng 等[11]的方法。脱脂火麻蛋白粉以1∶20（g/mL）的料液比分散于蒸馏水中，用1 mol/L NaOH 溶液调节悬浮液的pH 值至10.0，40 ℃水浴搅拌2 h，室温下8 000×g 离心15 min 收集上清液。用1 mol/L HCl 将收集的上清液调至pH5.0，于4 ℃、8 000×g离心15 min，分离沉淀蛋白。最后将所得样品收集并冻干，待用。
1.3.2 DHPM 处理
将HPI 冻干粉分散于去离子水中（50 mg/mL），室温搅拌过夜，使蛋白质充分水化。利用均质分散机以10 000 r/min 对蛋白溶液进行5 min 预处理，将得到的HPI 悬浮液通过动态高压微射流60 MPa 处理3 个循环。将DHPM 处理后的HPI 样品存放于4 ℃，备用。
1.3.3 HPI/XG 复合物的制备
HPI/XG 复合物的制备参照沈可洁等[12]的方法。DHPM 处理后的HPI 样品配制成5%的悬浮液，将pH值调为3，充分搅拌2 h，保证蛋白质充分水合。用pH值为3 的蒸馏水，配制1%的XG 溶液，室温下搅拌2 h。将充分水合的HPI（60 MPa，5%）溶液与XG（1%）分别按质量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2 混合，于25 ℃、500 r/min搅拌2 h。
1.3.4 Pickering 乳液凝胶的制备
HPI（经DHPM 处理）与XG 质量比分别为5∶1、2∶1、1∶1、1∶2，纯XG 为乳化剂，添加26%的油相，采用均质分散机（10 000 r/min，2 min）制备乳液凝胶[12]。
1.3.5 乳液凝胶微观结构的观察
采用荧光倒置显微镜观察乳液凝胶的微观结构。取少量乳液样品滴至载玻片，放置好盖玻片，倒置于载物台，用20 倍物镜观察乳液液滴的形态。
1.3.6 乳液凝胶流变特性的测定
参照Zhang 等[13]的方法对乳液凝胶流变特性进行测定。
1.3.7 乳液凝胶冻融稳定性的测定
冻融稳定性的测定参考黄子璇等[14]的方法进行。将制得的乳液样品均放置于密闭玻璃管中，进行3 次同样的冷冻-融化循环，并对每次复温样品的微观形态（同1.3.5）及流变特性（同1.3.6）进行测定。
1.3.8 乳液凝胶贮藏稳定性的测定
参照Zeng 等[15]的方法对乳液凝胶的贮藏稳定性进行测定。取10 mL 乳液凝胶置于玻璃管中，60 ℃烘箱中贮藏7 d，取样测定贮藏0、3、5、7 d 的脂肪的过氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）含量、共轭二烯烃（conjugated diolefine，CD）含量、共轭三烯烃（conjugated triene，CT）含量来确定乳液凝胶贮藏稳定性。
1.3.8.1 过氧化值（POV）的测定
参照Zeng 等[15]的方法，测定贮藏过程中POV。
1.3.8.2 硫代巴比妥酸值（TBARS）含量的测定
参照Wang 等[16]的方法测定贮藏期间TBARS 的含量。
1.3.8.3 共轭二烯烃与共轭三烯烃含量的测定
参照Koh 等[17]的方法测定贮藏期间共轭二烯烃（CD）、共轭三烯烃（CT）的含量。0.15 g 乳液样品于5 mL异丙醇中稀释，12 000 ×g 离心5 min，取1 mL 上清液加入到2 mL 异丙醇中，使用紫外可见分光光度计测定233（CD）、268 nm（CT）处的吸光度。
1.4 数据处理
所有指标的测定均重复进行3 次，试验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，采用ANOVA 分析和Tukey's 检验进行统计学分析。不同英文字母表示存在显著性差异（p<0.05）。
2 结果与讨论
2.1 乳液凝胶的形貌
图1 为DHPM 处理后的HPI（60 MPa）、HPI/XG 复合物和纯XG 制备的油相含量为26%的乳液凝胶的直观图。
图1 乳液凝胶外观
Fig.1 Appearance of emulsion gel
由图1 可知，HPI 与5∶1 试验组乳液均呈现较强的流动性。HPI/XG 复合物与纯XG 的乳液凝胶均可观察到固体状外观和良好的自持性能，倒置不流动。
采用荧光倒置显微镜观察乳液凝胶的微观结构，如图2 所示。
图2 乳液凝胶的微观形貌
Fig.2 Microscopic images of emulsion gel
由图2 可以看出，在酸性条件下，DHPM 处理后的HPI 不具备凝胶形态，且液滴絮凝不稳定；纯XG 稳定的乳液凝胶虽具备凝胶特征，但易发生聚集；然而，酸性条件下HPI 与XG 可以通过静电吸引形成复合物，从而极大程度地降低了乳液凝胶的粒径、提高了乳液凝胶稳定性[18]。在HPI 与XG 质量比为5∶1 时，可观测到较大的聚集体，可能是由于XG 与HPI 表面电荷完全中和，形成聚集体。但随XG 添加量增加，视野中的液滴尺寸明显减小、分布更加均匀，原因可能是电荷完全中和后，继续增加XG 添加量，溶液中与HPI 作用的电荷增加，沉淀减少，过量XG 会再次破坏复合物重新形成团聚体[19]。
2.2 乳液凝胶的流变特性分析
乳液凝胶的流变特性如图3 所示。
图3 乳液凝胶的流变特性
Fig.3 Rheological properties of emulsion gel
A.应力扫描；B.频率扫描；C.黏度。
由图3A 可知，随XG 添加量的增加G′明显增大，随着振幅的增加，结构被破坏，表现为储能模量G′和损耗模量G″产生交叉点，主要是应力破坏乳液液滴结构使液滴重排[20]。由图3B 可知，当频率为0.1～10 Hz时，所有样品G′大于G″，说明所有样品均具有以弹性为主导的黏弹性能。随着XG 添加量的增加，乳液样品G′增加，表明乳液凝胶的黏弹性增强，可能是因为XG的加入使液滴减小，单位接触面积增加，增强了液滴间的作用力[21]，促进了乳滴之间形成更强的凝胶网状结构。由图3C 可知，所有乳液的表观黏度均随着剪切速率的增大而降低，呈现典型的剪切变稀现象。可能是由于较高的剪切速率破坏了乳滴之间的非共价相互作用[22]。XG 添加量的增加，增强了乳滴之间相互作用，增强了乳液凝胶的表观黏度和抗剪切的能力。
2.3 乳液凝胶的冻融稳定性分析
图4 为乳液凝胶冻融后的直观图。
图4 乳液凝胶冻融后外观
Fig.4 Appearance of freeze-thaw emulsion gel
由图4 可知，HPI 与XG 以不同质量比（5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）和纯XG 制备的乳液凝胶3 次冻融循环后均未发生明显的破乳或油析现象，仍具备自支撑的凝胶特性，说明添加XG 有助于提升乳液凝胶的冻融稳定性，而纯HPI 制备的乳液1 次冻融循环后即出现了严重的破乳与相分离现象。结果表明，XG 与HPI 复配可以增强乳液凝胶的黏弹性，同时提高乳液凝胶的冻融稳定性。
图5 为乳液凝胶动冻融后的微观形貌。
图5 乳液凝胶动冻融后的微观形貌
Fig.5 Microscopic images of dynamic freeze-thaw emulsion gel
由图5 可知，冻融前后HPI 与XG 复合物（质量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）稳定乳液凝胶的微观结构保持稳定，乳滴排列紧密，未出现较大油滴聚集体。主要的原因有以下3 个方面，首先，随着XG 添加量的增加，分子间静电相互作用和空间相互作用增强，使乳滴粒径减小，有助于提高乳液的凝聚稳定性；其次，由于XG自身具备的黏度，促进油水界面处形成了更致密的界面膜，减小了冻融过程中晶体对界面膜的破坏[23]；最后，XG 含量的增加会提高水相黏度，降低水相结晶速率并减少冰晶的生成数量[24]，HPI 与XG 在酸性条件下的分子间非共价相互作用（静电相互作用、空间相互作用）进一步阻碍了冷冻过程中产生的结晶对自身及相邻乳滴的破坏，减少了乳液的絮凝[25]。
2.4 乳液凝胶冻融后的流变特性分析
由于在冻融过程中纯HPI 组与HPI∶XG=5∶1（质量比）试验组发生了破乳，因此不对这两个试验组进行流变特性分析，冻融后得乳液凝胶的流变特性如图6 所示。
图6 冻融后乳液凝胶的流变特性
Fig.6 Rheological properties of freeze-thaw emulsion gel
A.应力扫描；B.频率扫描；C.黏度。
由图6A 可知，在应力扫描模式中，经过3 次冻融循环处理后，1∶2 试验组的G′和G″交叉点（即临界应力）左移，表明冻融处理后1∶2 试验组抵抗应力变化的能力减弱，推测可能是由于过量的XG 会破坏HPI/XG 复合物，导致稳定性下降。由图6B 可知，所有样品G′仍大于G″，表明冻融后能较好地维持弹性为主导的凝胶网状结构。冻融后，添加XG 的试验组仍能保持良好黏弹性的原因与XG 的加入降低了水的结冰点、增强了分子间非共价作用并且形成的致密的界面膜、减少了结晶对液滴和界面膜的破坏有关[23-25]。结果表明，质量比为1∶1 的HPI 与XG 对维持黏弹性结构效果影响明显。由图6C 可知，所有样品均呈现剪切变稀现象，冻融处理后，XG 与HPI 复合物组稳定的乳液凝胶仍具备较高黏度。
2.5 乳液凝胶的贮藏过程外观
乳液凝胶贮藏期间的外观如图7 所示。
图7 贮藏期间的乳液凝胶外观
Fig.7 Appearance of emulsion gel during storage
由图7 可知，纯HPI 组稳定的乳液凝胶，在贮藏第3 天发生明显的相分离现象，随着贮藏时间的延长，顶部颜色逐渐加深，氧化程度不断增加。但随着XG 的添加，乳液凝胶贮藏期间仍保持稳定，不会发生相分离，且随XG 添加量的增加，乳液颜色变化不明显，表明氧化程度逐渐降低。
2.6 乳液凝胶贮藏过程稳定性分析
为了提高乳液凝胶的营养价值，采用富含多不饱和脂肪酸的亚麻籽油作为油相，但过于丰富的多不饱和脂肪酸会加速脂质氧化。因此测定乳液凝胶贮藏过程中的氧化稳定性具有重要意义。通过检测乳液凝胶贮藏过程中初级氧化产物和次级氧化产物变化，以监测乳液凝胶中脂质的氧化速率[26]。以纯亚麻籽油组作为对照，乳液凝胶贮藏稳定性结果见图8。
图8 乳液凝胶贮藏稳定性
Fig.8 Storage stability of emulsion gel
A.POV；B.TBARS 含量；C.CD 含量；D.CT 含量。
由图8 可知，随着贮藏时间的延长，所有样品中的POV、TBARS 含量、CD 含量和CT 含量明显增加。与纯亚麻籽油相比，乳液凝胶表现出明显的脂质氧化抑制作用。随着XG 添加量的增加，乳液凝胶的抗氧化性增强。当HPI∶XG=1∶1（质量比）时，氧化速率最低，贮藏期间产生POV、TBARS、CD、CT 的速率最慢，乳液凝胶的抗氧化性最强。可能的原因包括3 个方面：1）DHPM处理后的HPI 本身具有自由基清除能力，可清除油水界面的自由基[27]，阻断脂质氧化链式反应，有效抑制脂质氧化；2）当HPI∶XG=1∶1（质量比）时，所形成的乳液凝胶液滴尺寸更小、分布更加均匀，增强了凝胶网状结构，形成了致密的界面层，可以防止油滴与连续相中促氧化剂如金属离子之间的接触[28]；3）游离的XG可以提高连续相的黏度并诱导凝胶网络的形成，降低促氧化剂的转移速率，减少脂质的氧化[29]。随着XG 添加量的增加，致密的物理屏障和更高的连续相黏度，有效地阻止氧自由基的传递和转移，进而明显抑制了乳液凝胶贮藏过程中初级氧化产物、次级氧化产物、共轭二烯烃和酮类物质的产生速率。
3 结论
HPI 与XG 通过静电吸引作用结合，当HPI 与XG复配质量比为1∶1 时，所构建的乳液凝胶具有良好的黏弹性、冻融稳定性和贮藏稳定性。结果表明，HPI 与XG 分子间相互作用增强有助于维持乳液液滴的稳定性、提高乳液凝胶黏弹性；XG 在HPI 表面形成致密的界面膜，阻碍了冻融过程中脂质结晶对自身和相邻乳液液滴的破坏，有效维持冻融后乳液凝胶的黏弹性，而致密的界面膜又可以阻碍脂质与连续相中存在的金属离子等促氧化剂接触，降低自由基的扩散速率以提高乳液氧化稳定性。具备高冻融稳定性、贮藏稳定性的乳液凝胶的成功制备为蛋白质-多糖复合提供理论基础，为拓展低脂乳液凝胶在食品体系中的应用提供新的思路。
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