肉类富含多种优质蛋白，可为人体提供多种必需氨基酸，从而提高人们的身体素质[1]。与其他肉类相比，牛肉和羊肉的价格更高，以致于有些不法商家以次充好、以假乱真，将便宜的鸡肉或鸭肉掺入到牛、羊肉中，赚取更高的利润[2-3]。这种行为严重损害了消费者的合法权益，扰乱了市场秩序，甚至可能会造成消费者产生过敏症状，从而危及生命[4]。因此，亟需开发一种快速、简便、稳定性好、实用性强的肉类掺假检测方法。
目前，国内外学者们开发了各种肉类掺假的检测方法，包括以蛋白质和DNA 分子为目标物的方法[5-6]，此外，还可以根据肉类中的脂类、大分子糖类和酚类等代谢物质进行检测[7-9]。DNA 分子基于其热稳定性和高度保守性，在加工处理后仍可稳定存在，因此成为肉制品物种鉴定的主要方法[10-12]。目前，基于DNA 分子的主要鉴定方法包括实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[13-15]、数字PCR[16-17]、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[18-19]、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）[20-21]等。其中，PCR具有特异性强、灵敏度高、应用广泛等优点，但需要昂贵的设备和专业人员，不适用于基层单位的快速检测[22]。LAMP 和RPA 等核酸等温扩增技术具有快速、灵敏、操作简单等优点，但可能存在引物设计困难和假阳性等问题[23-24]。因此，需要开发一种快速、高效、操作简单、成本较低的新型检测技术以应对市场需求。
梯型熔解温度等温扩增技术（ladder-shape melting temperature isothermal amplification，LMTIA）是近两年发展起来的一种核酸等温扩增技术[25]，该技术在反应时不需要温度的变化，反应全程只需要一个恒定的温度，还具有反应时间迅速、灵敏度高、针对的靶序列短等优点[26]，因此在食品掺假检测[27-29]和病毒检测[30]等领域已得到成功应用。LMTIA 技术主要利用靶序列上的熔解温度差值来进行解链，而不依赖温度的变化及酶的作用，从而实现核酸的稳定扩增。Proofman 探针（proofreading enzyme-mediated probe cleavage）是一种新型探针[31]，在其序列的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，通过高保真酶的校正作用实现反应的实时监测。本研究将Proofman 探针与LMTIA 技术相结合，建立一种鸡肉源基因的快速检测方法，以期对肉制品中鸡肉源基因进行检测，为市场上肉制品掺假提供一种新的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡肉、鸭肉、猪肉、羊肉、牛肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉：市售。
血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；Nucleo Spin R Food 试剂盒：德国MACHEREY-NAGEL 公司；GPV8 超保真DNA 聚合酶：通用生物系统（安徽）有限公司；Bst II Pro DNA聚合酶大片段：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；通用型LMTIA 反应预混液：德歌生物技术（山东）有限公司。
1.2 仪器与设备
Gentier 96E 全自动PCR 分析系统：西安天隆科技有限公司；Archimed X4 医用荧光定量PCR 仪：鲲鹏（徐州）科学仪器有限公司；F6/10 匀浆机：上海净信科技有限公司；1-15K 高速冷冻离心机：德国Sigma 公司；DH300 干式恒温器：杭州瑞诚仪器有限公司；Nano Drop One 超微量核酸蛋白测定仪：美国Thermo 公司。
1.3 方法
1.3.1 模拟样品的制备
所用样品均为去除表皮、脂肪和骨头后的新鲜肉块，使用匀浆机将肉块打成肉糜，置于-20 ℃保存备用。
参考Chen 等[32]的方法，称取0.1 g 鸡肉与99.9 g的牛肉，将二者混合，并向混合肉糜中加入不影响反应的有色染料，使用匀浆机将二者混合均匀，所制样品即为鸡肉质量分数为0.1%的模拟样品。按照该方法分别制备鸡肉质量分数为0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合样品，每组样品分别制作5 个平行样，所有样品置于-20 ℃备用。
1.3.2 DNA 提取
按照血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒操作说明提取各肉类基因组DNA 和1.3.1 制备的模拟肉样。按照Nucleo Spin R Food 试剂盒操作说明提取玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉和小麦粉等植物淀粉的DNA。提取完成后，使用超微量核酸蛋白测定仪检测所提DNA 的浓度和纯度，确保A260/A280 比值在1.6～2.0 之间，以便进行LMTIA 扩增。将提取的DNA样品置于-20 ℃保存。
1.3.3 LMTIA 引物和Proofman 探针设计
根据GenBank 数据库上公布的鸡源基因，选取鸡细胞核中的高度保守序列prolactin receptor（GenBank ID：KU553470.1）为靶标，使用Oligo 7 软件分析所选序列，选取熔解温度曲线呈梯型且DNA 分子中GC 碱基含量在40%～60%的片段，以该片段为靶序列设计LMTIA 引物，而后根据所设计的LMTIA 环引物设计Proofman 探针。所设计的引物和探针均由通用生物系统（安徽）有限公司合成，序列见表1。
表1 LMTIA 引物及Proofman 探针序列
Table 1 Sequences of LMTIA primers and Proofman probe
引物名称引物序列（5′ - 3′）F 5′-CTCTCTTCCACAACTTTTTTATGGCTTGCCGCTTCTCC-3′B 5′-AAGTTGTGGAAGAGAGTTTTAGCAGAAGGACTTTTGGAGGG-3′LF5′-GGGTCTAGTTGGGCAG-3′LB5′-CAGAAGAACCCCCAC-3′Probe5′BHQ1-GGGTCTAGTTGGGCAA-FAM3′
1.3.4 反应温度优化
使用提取的鸡肉基因组DNA 作为阳性对照对所设计的LMTIA 引物和探针进行温度筛选，反应程序设置：温度区间为53、54、55、56 ℃，90 s 采集一次荧光信号，40 个循环，反应结束后观察并分析扩增结果，确定所建Proofman-LMTIA 方法的最适温度。
1.3.5 灵敏度测定
为确定所建立的Proofman-LMTIA 检测方法的灵敏度，将鸡肉基因组DNA 梯度稀释至10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，以优化好的反应体系进行检测。由于样品新鲜度、人为因素误差和DNA 降解等原因可能会对检测结果产生一定的影响，为保证检测结果具有可重复性，每组试验重复进行5 次以验证方法的准确性。
1.3.6 特异性测定
为验证所建方法能否区分不同肉类及肉类中可能掺入的淀粉类制品，以1.3.2 中提取的猪肉、鸭肉、牛肉、羊肉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉、绿豆淀粉、小麦粉等基因组DNA 作为对照，H2O 为阴性对照、鸡肉基因组DNA 为阳性对照，以优化的反应体系进行测试，观察并分析测试结果。每组试验重复进行5 次以保证方法的准确性。
1.3.7 模拟样品检测限测定
为验证所建方法的最低检测限，制备混合模拟肉样，配制LMTIA 反应体系，将制备的鸡肉质量分数为0%、0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的模拟样品DNA 进行测试，试验结束后观察并分析结果。每组试验重复进行5 次以保证方法的准确性。
1.4 数据处理
使用Gentier 96E 全自动医用PCR 分析系统（V1）和Archimed Analyzer 实时荧光定量PCR 仪软件（v1.4.4）对检测结果和扩增曲线进行分析，再使用Excel、PowerPoint 软件对结果和扩增图进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 检测原理
基于Proofman 探针的LMTIA 方法检测鸡肉源基因的原理如图1 所示。
图1 Proofman 探针原理
Fig.1 Proofman probe principle diagram
Proofman 探针根据LMTIA 的环引物所设计，如图1 所示，标记荧光基团的错配碱基设计Proofman 探针的3′端，Proofman 探针的5′端设计一个淬灭基团。反应未开始时，3′端荧光基团发出的荧光被5′端淬灭基团所吸收，故反应无荧光信号产生。反应开始时，Proofman 探针的3′端错配碱基被超保真DNA 聚合酶切除，荧光基团被释放，仪器通过采集产生的荧光信号实现对目标物质的实时监测。
2.2 反应温度优化结果
图2 为Proofman-LMTIA 的温度优化结果。
图2 Proofman-LMTIA 温度优化结果
Fig.2 Proofman-LMTIA reaction temperature optimization
由图2 所示，在反应温度为53、54、55、56 ℃时，只有鸡肉基因组DNA 出现扩增反应，阴性对照未扩增。反应温度为54 ℃时，扩增效率和重复性都比较好，所以选择54 ℃作为所建方法的最适温度。
2.3 灵敏度测试结果
Proofman-LMTIA 灵敏度检测结果如图3 所示。
图3 Proofman-LMTIA 灵敏度结果
Fig.3 Sensitivity determination of Proofman-LMTIA assay
由图3 可知，在反应温度54 ℃，反应进行40 循环时，梯度稀释的10 ng/μL 和1 ng/μL 的鸡肉基因组DNA 出现扩增，而0.1、0.01、0.001 ng/μL 和阴性对照均未出现扩增。说明该方法能检测到DNA 质量浓度为1 ng/μL 的样品，即Proofman-LMTIA 方法的灵敏度为1 ng/μL。
2.4 特异性结果分析
Proofman-LMTIA 特异性检测结果如图4 所示。
图4 Proofman-LMTIA 特异性结果
Fig.4 Specificity determination of the Proofman-LMTIA assay
由图4 可知，在反应进行到40 循环时，只有加入的鸡基因组DNA 出现扩增，而阴性对照及其它物种DNA 均未出现扩增。说明所建方法的特异性较强，与其他物种无交叉反应，能够特异区分鸡源基因和其它物种DNA，能够对肉制品中鸡肉源基因掺假进行检测。
2.5 模拟样品检测限测试结果
鸡肉模拟样品Proofman-LMTIA 方法检测限测试结果如图5 所示。
图5 Proofman-LMTIA 模拟肉样结果
Fig.5 Simulated meat sample results of Proofman-LMTIA
1～6.鸡肉质量分数分别为100.0%、20.0%、10.0%、5.0%、1.0%、0.1%的混合肉样；7.阴性对照及鸡肉质量分数为0%的混合肉样。
由图5 可知，在54 ℃反应的40 循环内，阴性对照及鸡肉质量分数为0%的肉样未出现扩增，鸡肉质量分数为0.1%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、100.0%的混合模拟样品均在20 循环内出现扩增。因此，该方法能够在30 min 内检测出鸡肉含量为0.1%及以上的样品，即可检测出1 000 kg 肉制品中掺入1 kg 鸡肉。
3 结论
本研究建立了一种用于快速检测肉制品中鸡肉成分的Proofman-LMTIA 检测方法。选取鸡细胞核中单拷贝且特异性强的prolactin receptor 基因为靶序列设计引物及Proofman 探针。通过对反应体系的优化，在反应温度为54 ℃时对鸡肉基因组DNA 的检测灵敏度为1 ng/μL，与所测试的肉制品中常见的可掺假物种无交叉反应，可在30 min 内检测出肉制品中掺入的0.1%及以上的鸡肉，为检测肉制品中鸡肉掺假提供了一个快速、准确的方法，该方法操作简单、灵敏度高、特异性强、反应时间短、适用范围广，为规范肉制品市场秩序提供技术支持。
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