从复杂基质里有效识别非目标物质，仍然面临挑战。一旦识别出的物质，可以更详细地解释其潜在构效和量效关系等生物学信息。为了明确识别物质信息，需要依托色谱法、质谱法、X 射线衍射法、核磁共振波谱法等分析方法[1]。葡萄酒是一种复杂体系，体系中含有与品质、品种关联的非目标物质，涉及食品质量和食品安全，因而需要有效的检测技术来验证葡萄酒的地道性和真实性[2-3]。较常规非目标分析方法，核磁共振波谱法具有快速、无损的优势[4]，可以应用于食品生产线开展大规模检测。
就样品制备而言，核磁共振波谱法比高效液相色谱、气相色谱-质谱连用等检测方法更简单快捷，核磁共振波谱法是检测非紫外吸收属性物质，比如糖类物质的首选方法，该方法使葡萄酒中的非紫外吸收物质检测成为可能[6]。葡萄酒中高含量水、低含量添加剂等因素干扰谱图的解析[7]，但是核磁共振氢谱法能压制水峰，提高非目标物质信息的灵敏度。葡萄酒具有一定的商品经济价值，需要检测和监测它的品质，为消费者提供物质成分的信息，因而需要可操作的、无损的核磁共振技术实施鉴定、评价[8-12]。本文采用核磁共振标准压制水峰方法和标准加入法，定性、定量获得葡萄酒中非目标物质信息，以期实现葡萄酒的日常检测和生产过程的质量监控。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
通山红原浆山葡萄酒（样品记为TT，标示成分为山葡萄、白砂糖、食品添加剂，酒精度7%vol）：通化通天酒业有限公司；通化原汁山水果配制酒[样品记为TH，标示成分为水、葡萄汁、果葡糖浆、食用酒精、食品添加剂（柠檬酸、柠檬酸钠、甜蜜素、三氯蔗糖、糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、焦糖色、苋菜红）、食用香精，酒精度2%vol、糖度≤200 g/L]：通化通池山葡萄酒有限公司；重水（氘含量99.9%）：Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
AV300 NEO 核磁共振波谱仪、5 mm BBO 探头：Bruker BioSpin 公司；QP2010PLUS 气相色谱质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：日本岛津公司；Vortex-Genie2 涡旋振荡器：Scientific Industries 公司；高硼硅玻璃核磁管：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.3 测定条件
核磁共振谱仪观察频率为300.130，脉冲序列采用topspin 4.02 参数组，激发脉冲角度30°，时间域数据点32 k，累计采样次数16 次，扫描宽度32 768，弛豫延迟时间64 s，探头温度25 ℃，频率域数据点16 k。选择标准压制水峰脉冲序列zgcpfqpr（zero go composite pulse frequency presaturation）[13]。
GC-MS：HP-5MS 石英毛细管柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m），载气为氦气，流速为1 mL/min，进样口温度为280 ℃，分流比为50∶1，采用程序升温。电子撞击离子源，电子能量70 eV，离子温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，倍增管电压1.6 kV，质量扫描范围m/z 35～550。
1.4 葡萄酒的前处理和测试流程
在200 mL 圆底烧瓶中分别加入葡萄酒和蒸馏水各50 mL，浸泡在油浴中，用50 mL 量筒接纳50 mL 馏分。
取10 μL 馏分，分别加入10、20、30、40、50 μL 甲醇，加入装有600 mL 重水的5 mm 核磁管中，涡旋振荡器振荡5 min，测试核磁共振氢谱[14]。
葡萄酒样品加水蒸馏，核磁管中用重水制样，然后核磁共振仪上机测试，最后进行谱图解析，测试流程见图1。
图1 测试流程
Fig.1 Testing flow
取1 mL 未前处理的葡萄酒于10 mL 异辛烷中，配制成500 mg/L 溶液，并稀释至5 mg/L 用于GC-MS 定性、定量测试。
1.5 数据分析
数据和图像处理采用Topspin 4.02、Origin 8.1、ChemOffice 14.0、MestReNova 6.1 等软件。
2 结果与分析
不同品质的葡萄酒的核磁共振氢谱中氢信号种类、强度上有所不同，这为根据核磁共振氢谱判断其化学成分的种类、变化提供了可能性[15]。国家标准GB/T 15037—2006《葡萄酒》中，要求葡萄酒中的甲醇含量应该控制在400 mg/L 以下。通常情况甲醇等杂醇超标较多，无法通过人工品尝来准确定量，因此参考GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》，对葡萄酒中甲醇的定量开展方法学研究，考虑标示成分对核磁共振氢谱的干扰，因此加入与待测葡萄酒同量的蒸馏水，并蒸馏出等量的馏分，在获得核磁共振氢谱中，依据取样量与氢谱中积分强度的关系，获得葡萄酒中甲醇的含量信息，并判定是否能够进入市场进行流通。TH 和TT 两种葡萄酒处理后的核磁共振氢谱见图2。
图2 两种葡萄酒蒸馏后馏分的核磁共振氢谱图
Fig.2 NMR hydrogen spectrum of distillation fractions of TT and TH wines
由图2 中可以看出，两种葡萄酒核磁共振氢谱中，氘代溶剂重水残余水峰化学位移4.97，甲醇中甲基吸收峰化学位移3.21（单峰），表明两种葡萄酒中都含有一定量的甲醇，依据甲醇甲基与重水残余氢的积分强度，可以判断两种酒的甲醇含量是有差异的，而葡萄酒中甲醇含量一旦超标，会引起头痛、恶心、呕吐、视线模糊、脑神经受到破坏、肾衰竭等不良反应，因此有必要对葡萄酒中的甲醇进行定量，葡萄酒中的水会影响定量的效果，利用液体核磁共振样品流动性和无损性的优点，定量考察葡萄酒中甲醇及其含量。
依据液体核磁共振样品要求，基于标准加入法思路，在10 μL 葡萄酒蒸馏馏分中，加入不同体积甲醇的核磁共振氢谱图，相应的加入量与积分强度关系的标准曲线图和未处理葡萄酒的气相色谱图见图3。
图3 核磁共振氢谱图、拟合标准曲线和未蒸馏葡萄酒的气相色谱图
Fig.3 NMR hydrogen spectrum and fitting curve of standard addition in distillate and gas chromatogram of undistilled wine
如图3B 所示，核磁共振氢谱吸收峰积分强度与甲醇加入量呈线性变化的拟合回归方程为y=-0.005 24+0.005 94x，拟合度为0.989 43，标准加入法结果表明核磁共振定量检测避免了葡萄酒中的水影响定量结果。TT 葡萄酒的核磁共振氢谱中甲醇积分值为0.03，TH 葡萄酒的甲醇积分值为0.56，代入回归方程，可以换算得出两种葡萄酒中甲醇含量均小于400 mg/L，表明两种葡萄酒的甲醇含量低于国家标准。定量核磁得到的TT葡萄酒中甲醇含量结果与图3C 所示的TT 葡萄酒样品气相色谱的归一化测试结果吻合[16-17]。
酒精、糖和葡萄是酿造葡萄酒关键的组分[18-21]，当需要验证葡萄酒是否符合标签说明时，选择合适的判定手段，利于节约检测成本和时间。由于直接测试葡萄酒的核磁共振氢谱，其中水吸收峰掩盖了一些信息，因此葡萄酒的非目标物质核磁共振分析[22-24]中采用标准脉冲序列预饱和压制水峰，两种葡萄酒的压制水峰后的核磁共振氢谱见图4 和图5。
图4 TT 葡萄酒的压制水峰后核磁共振氢谱图
Fig.4 NMR hydrogen spectrum of TT wine after water suppression
图5 TH 葡萄酒的压制水峰后核磁共振氢谱图
Fig.5 NMR hydrogen spectrum of TH wine after water suppression
图5 为完全压制了水峰，去水峰效果好于图4。压制后葡萄酒的核磁共振氢谱信噪比与图1、图2 比得到提高，这有利于葡萄酒中的非目标物质的信息解析。图4 是TT 葡萄酒的核磁共振氢谱，以化学位移4.97 位置处水吸收峰定标，除了水，主要组分乙醇的甲基三重峰化学位移为1.16（偶合常数5 Hz），乙基的四重峰化学位移为3.635（偶合常数5 Hz）。根据GB/T 15037—2006 《葡萄酒》规定的葡萄酒酒精度不低于7%vol，酒精度7%vol 表明20 μL TT 葡萄酒中含0.7 μL（0.55 mg）的乙醇，由于葡萄酒样中乙醇含量不足1 mg，TT 葡萄酒的核磁共振氢谱的乙醇中甲基峰的三重峰呈现卫星峰，化学位移为1.04（三重峰，偶合常数3 Hz）、1.29（三重峰，偶合常数3 Hz）。化学位移2.785（二重峰，偶合常数15 Hz）、2.925（二重峰，偶合常数15 Hz）位置处的两个双重峰是柠檬酸的特征吸收峰，与标示成分中的食品添加剂项对应。化学位移1.98～1.95（多重峰），1.73～1.69（多重峰），1.58～1.54（多重峰），3 组多重峰是来自标示成分中的葡萄汁中脯氨酸的吸收峰。化学位移2.07 处单峰是乙酸的吸收峰，化学位移1.845（二重峰）处是乳酸吸收峰，乙酸和乳酸是风味有关的食品添加剂。根据GB 13104—2014《食品安全国家标准食糖》中白砂糖定义，化学位移5.210（二重峰，偶合常数5 Hz）、4.625（二重峰，偶合常数10 Hz）处两个二重峰分别是白砂糖的端基质子吸收峰，化学位移4.02、3.89、3.86、3.81、3.78、3.68、3.55、3.47 是标示成分的白砂糖的非端基质子吸收峰。化学位移4.09、3.99、3.97、3.70、3.69、3.53、3.43、3.40、3.38、3.22 是标示成分中的葡萄中糖分吸收峰。另外，低场区化学位移高于6的吸收峰来源于葡萄中色素、糖苷、黄酮等。因为核磁共振仪本身较低的灵敏度，不能辨识葡萄酒中添加剂涉及色度、香味等其他成分。综上，TT 葡萄酒核磁共振氢谱信息与其标示成分基本吻合。
如图5 所示，以化学位移4.97 位置处水吸收峰定标，TH 葡萄酒中的乙醇的甲基呈现三重峰化学位移1.16（三重峰，偶合常数5 Hz），乙基呈现四重峰化学位移3.635（四重峰，偶合常数5 Hz），对应TH 葡萄酒标示成分中的食用酒精。酒精度2%vol 表明20 μL TH葡萄酒中含0.2 μL（0.16 mg）的乙醇。因为在TH 葡萄酒中乙醇的量不足1 mg，乙醇中甲基峰也呈现卫星峰，化学位移为1.03（三重峰，偶合常数3 Hz）、1.28（三重峰，偶合常数3 Hz）。化学位移0.87（二重峰，偶合常数10 Hz）、1.115（二重峰，偶合常数5 Hz）、1.365（二重峰，偶合常数5 Hz）位置处的3 个二重吸收峰与标示成分中的甜蜜素对应。化学位移2.785（二重峰，偶合常数15 Hz）、2.925（二重峰，偶合常数15 Hz）位置处2个二重吸收峰对应柠檬酸的特征吸收峰。化学位移2.06（单峰）、2.63（单峰）位置处2 个单峰分别对应乙酸和琥珀酸的吸收峰（未见于标示成分，非目标物质的指认成分）。化学位移5.205（二重峰，偶合常数5 Hz）、4.62（二重峰，偶合常数10 Hz）是典型糖的α，β两种构型的端基质子，结合化学位移3.22（三重峰，偶合常数10 Hz）、3.41、3.48、3.89 处吸收峰，对应着葡萄酒甜度的标示成分中的果葡糖浆。可能受核磁共振仪仪器灵敏度限制，TH 葡萄酒中未见标示成分葡萄汁中的脯氨酸、糖精钠、苯甲酸钠、三氯蔗糖、山梨酸钾的吸收峰。另外，TH 葡萄酒标示糖度≤200 g/L，属于甜葡萄酒，糖度高，使得核磁共振氢谱中的糖部分吸收峰信噪比高（可能是影响图5 比图4 的压制水峰效果好的因素）。TH 葡萄酒核磁共振氢谱信息与其的标示成分大部分吻合，也有一定差异，这为快速、准确判定葡萄酒品质提供依据。
3 结论
综上研究结果表明，对葡萄酒简单前处理后，使用核磁共振仪实现在一次分析过程中对葡萄酒中不具有紫外吸收的一些成分的非目标物质指认，并实现葡萄酒中甲醇定量分析。从核磁共振氢谱中辨识葡萄酒中的酸度添加剂、糖度、葡萄汁液等信息。确认葡萄酒核磁共振氢谱的非目标物质分析，有助于认证不同来源的葡萄酒样品，以区分品种、年份或地理位置信息。
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