肥胖是一种由代谢紊乱引起的慢性疾病，会增加罹患一些并发症的风险，如心血管疾病、2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）、高脂血症、高血压、心脏病和动脉粥样硬化等[1-2]。长期食用富含脂肪的食物会导致肥胖，从而引起代谢紊乱和血脂异常，其特征是脂肪堆积、葡萄糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、低度炎症和血脂异常[3]，其中血脂异常的特征是总胆固醇（triglyceride，TC）、甘油三酯（total cholesterol，TG）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平降低[4]，这是能量摄入和能量消耗不平衡的结果[5-7]。2016 年约有19 亿18 岁及以上的成年人超重，据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）估计，到2025 年，大约有1.67 亿人（成人和儿童）将因超重或肥胖而影响身体健康[8]，使引发代谢综合征的风险增加[9]。目前，常见治疗糖尿病的药物有二甲双胍、吡格列酮和磺胺类等，但这些降糖药物普遍存在增加体重、产生耐药性和导致低血糖等副作用[10-12]，因此需寻找有效、副作用低和耐受性更强的抗肥胖剂[13]。
茶碱和可可碱是天然的甲基黄嘌呤生物碱，二者互为同分异构体[14-15]。前者主要存在于茶叶中，后者主要存在于可可种子、豆类和山茶科植物的叶子中[1，16]。茶碱具有强心、利尿、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、兴奋中枢神经和抗炎等作用，可以用于治疗支气管哮喘、肺气肿、支气管炎和心脏性呼吸困难[17-20]。可可碱具有舒张脑血管、利尿、保护牙齿[21]、增加HDL-C[22]和抑制脂肪生成相关基因的表达[23]等作用。研究发现，茶碱有作为治疗胰岛素抵抗和高血糖症候选治疗剂的潜力[24]，但关于茶碱和可可碱对小鼠体质量和胰岛素抵抗影响的研究鲜有报道。因此，本研究使用高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导C57BL/6J 小鼠建立肥胖模型，通过测定茶碱和可可碱对小鼠的体质量、空腹血糖水平和胰岛素抵抗等的影响，为茶碱和可可碱能否降脂减肥和缓解胰岛素抵抗提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶碱（纯度≥99%）：上海麦克林生化科技股份有限公司；可可碱（纯度>98%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；雄性C57BL/6J 小鼠[6 周龄，体质量18～25 g，动物许可证号SCXK（川）2020-030]：成都达硕实验动物有限公司；高脂饲料（D12492，60%热量来源于脂肪）、低脂饲料（D12450J，含10%脂肪的啮齿动物饮食）：美国Research Diets 公司。
葡萄糖粉剂：福州海王福药制药有限公司；胰岛素注射液（H10890001）：江苏万邦生化医药集团有限责任公司。
1.2 仪器与设备
血糖仪（GA3 型）、血糖试纸条：三诺生物传感股份有限公司；分析天平（FA1004N）：上海精密科学仪器有限公司；解剖镊-直（F12029-09）、IRIS 眼科镊-弯（F120007-10）、手术剪-直/尖头（S14014-11）：昆明迪然科技有限公司；低速离心机（SC-36）：安徽中科中佳科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物模型及给药
动物饲养温度（24±1）℃，相对湿度50%～60%，在无病原体设施中12 h 昼/夜循环，可以自由获得食物和水。7 d 适应性喂养后，将小鼠随机分为6 组，3 个低脂饮食（low-fat diet，LFD）组，3 个高脂饮食（high-fat diet，HFD）组。分别为LFD 组（n=8）、LFD+茶碱组（0.5 mg/mL，n=8）、LFD+可可碱组（0.5 mg/mL，n=9）、HFD 组（n=8）、HFD+茶碱组（0.5 mg/mL，n=8）和HFD+可可碱组（0.5 mg/mL，n=9）。将茶碱和可可碱分别加入小鼠饮用水中，配制成0.5 mg/mL 溶液灭菌后给小鼠自由饮用，持续给药16周。每周定期测量小鼠体质量、空腹血糖（禁食13 h，尾部静脉采血测定）、饮水量和食物摄入量[25]。所有动物实验均符合云南农业大学动物实验伦理审查委员会批准的协议。
1.3.2 腹腔葡萄糖耐量试验和腹腔胰岛素耐受试验
第14 周进行腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT），小鼠禁食13 h，注射葡萄糖溶液前测量并记录小鼠的空腹血糖和体质量。葡萄糖溶液（原液浓度0.5 g/mL，注射浓度1 g/kg）在30 min内全部注射完成，用血糖仪测量0、30、60、90 min 和120 min 时的血糖值，分别为y0min、y30min、y60min、y90min、y120min，并根据结果绘制折线图，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）[26-27]，计算公式如下。
A=15×（y0min+2y30min+2y60min+2y90min+y120min）
式中：A 为曲线下面积，min·（mmol/L）。
第15 周进行腹腔胰岛素耐受试验（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT），小鼠不禁食，注射胰岛素溶液（原液浓度40 U/mL，注射体质量0.75 U/kg），并使用血糖仪测量小鼠在0、30、60、90 min 和120 min 时的血糖值，并根据结果绘制折线图，计算AUC[28]。
1.3.3 解剖和采血
第16 周实验结束，收集血液样本，4 ℃静置1 h，5 000 r/min 离心收集上清液。迅速解剖小鼠，取小鼠腹股沟脂肪、附睾脂肪和肝脏，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗干净，再称质量，按如下公式计算小鼠脏器系数，将组织分装至离心管转入-80 ℃保存待用。
I=（G0/G）×100
式中：I 为小鼠脏器系数，%；G0 为小鼠各组织质量，g；G 为小鼠体质量，g。
1.3.4 小鼠血清生化指标检测
小鼠血清送于云南省昆明市第二人民医院进行检测，检测项目为甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）。
1.4 数据统计分析
本试验所有数据均来源于3 个以上重复试验的平均值，采用GraphPad Prism 9.0 和Adobe Illustrator 软件进行数据分析和作图，组间比较采用one-way ANOVA和Tukey's test 分析，p<0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 茶碱和可可碱对小鼠体质量、空腹血糖、饮水量和摄食量的影响
为了探究茶碱和可可碱对小鼠体质量和空腹血糖的影响，每周对各组小鼠体质量和空腹血糖进行检测，结果见图1、图2。
图1 茶碱和可可碱对小鼠体质量的影响
Fig.1 Effects of theophylline and theobromine on body mass of mice
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）；HFD+茶碱组、HFD+可可碱组与HFD组相比，#表示差异显著（p<0.05），##表示差异极显著（p<0.01），###表示差异高度显著（p<0.001）。
图2 茶碱和可可碱对小鼠空腹血糖的影响
Fig.2 Effects of theophylline and theobromine on fasting blood glucose in mice
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）。
C57BL/6J 肥胖小鼠模型建立成功的判断标准是高脂饮食组平均体质量高于对照组20%[29]。由图1 可知，HFD 饮食诱导16 周后，HFD 组小鼠平均体质量高于LFD 组21.05%，证明肥胖模型诱导成功。图1 结果显示，茶碱给药1 周后，对小鼠体质量增长出现了明显抑制作用。在整个实验周期内，与LFD 组相比，LFD+茶碱组降低小鼠体质量的范围在4.89%～16.28%；与HFD 组相比，HFD+茶碱组降低小鼠体质量的范围在7.86%～30.81%，表明茶碱能有效抑制HFD 诱导小鼠的体质量的增加。可可碱对小鼠的体质量无抑制作用，而且从第11 周开始，HFD+可可碱组小鼠体质量超过HFD 组，11～16 周高于HFD 组4.56%～15.59%，表明可可碱可能会导致小鼠体质量增加。由图2 可知，与LFD 组相比，茶碱和可可碱对小鼠的空腹血糖水平没有表现出持续稳定的抑制作用；与HFD 组相比，HFD+茶碱组在8～13 周和15～16周的小鼠空腹血糖水平低于HFD 组，而HFD+可可碱组对小鼠空腹血糖的没有抑制作用。
各组小鼠的食物摄入量和饮水量的结果见图3、图4。
图3 小鼠16 周内平均摄食量
Fig.3 Average feed intake of mice during 16 weeks
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，***表示差异高度显著（p<0.001）。
图4 小鼠16 周内平均饮水量
Fig.4 Average water intake of mice during 16 weeks
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，***表示差异高度显著（p<0.001）；HFD+茶碱组、HFD+可可碱组与HFD 组相比，###表示差异高度显著（p<0.001）。
由图3 可知，与LFD 组相比，LFD+茶碱组的小鼠摄食量高度显著增加13.03%（p<0.001）；与HFD 组相比，HFD+茶碱组小鼠摄食量没有明显差异，表明茶碱降低小鼠体质量与食物摄入多少无关，反映茶碱不是通过抑制小鼠食欲来减肥。由图4 可知，与LFD 组相比，LFD+茶碱组的小鼠饮水量高度显著增加49.26%（p<0.001）；与HFD 组相比，HFD+茶碱组的小鼠饮水量高度显著增加79.14%（p<0.001），表明食用茶碱可能会引起小鼠饥渴，而可可碱对小鼠摄食量和饮水量均无明显影响。
2.2 茶碱和可可碱对小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的影响
肥胖常伴有糖代谢异常，血糖升高的肥胖者中大多存在胰岛素抵抗[30-31]。发生胰岛素抵抗，葡萄糖耐量必然受损，通常伴随着高血糖、高血脂和高血压的发生[32]。因此，研究通过IPGTT 和IPITT 进一步评估茶碱和可可碱对葡萄糖稳态的影响，结果见图5、图6。
图5 茶碱和可可碱对小鼠葡萄糖耐受性的影响
Fig.5 Effects of theophylline and theobromine on glucose tolerance in mice
A.腹腔葡萄糖耐量（IPGTT）；B.腹腔葡萄糖耐量曲线下面积（AUC）。LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01）；HFD+茶碱组、HFD+可可碱组与HFD组相比，##表示差异极显著（p<0.01）。
图6 茶碱和可可碱对小鼠胰岛素敏感性的影响
Fig.6 Effects of theophylline and theobromine on insulin sensitivity in mice
A.腹腔胰岛素耐受（IPITT）；B.腹腔胰岛素耐受曲线下面积（AUC）。LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，**表示差异极显著（p<0.01），***表示差异高度显著（p<0.001）；HFD+茶碱组、HFD+可可碱组与HFD 组相比，#表示差异显著（p<0.05），##表示差异极显著（p<0.01）。
由图5A 可知，在测血糖时间为30 min 时，各组小鼠血糖浓度达到峰值，HFD 组和HFD+可可碱组血糖水平较高。在30 min 和60 min 时，LFD+茶碱组血糖水平分别极显著低于LFD 组26.93%（p<0.01）、26.79%（p<0.01），在90 min 和120 min 时，LFD+茶碱组血糖水平分别显著低于LFD 组20.65%（p<0.05）、25.54%（p<0.05）。在30～120 min 期间，HFD+茶碱组血糖水平明显低于HFD 组（20.99%～38.65%）。由图5B 可知，LFD+茶碱组的葡萄糖耐受AUC 低于LFD 组24.37%；与HFD组相比，HFD+茶碱组的葡萄糖耐受AUC 极显著降低27.18%（p<0.01）。结果表明，茶碱给药组的小鼠机体自身能更快产生胰岛素降低血糖，从而维持自身血糖水平，说明茶碱可以缓解HFD 诱导小鼠的葡萄糖耐受性。而在30～120 min，HFD+可可碱组的IPGTT 血糖水平比HFD 组高，AUC 也比HFD 组高，表明可可碱可能会使HFD 诱导小鼠糖耐量受损更加严重。
由图6A 可知，在30、60 min 和90 min 时，LFD+茶碱组血糖水平分别高度显著低于LFD 组37.92%（p<0.001）、51.73%（p<0.001）和52.85%（p<0.001），在120 min 时，LFD+茶碱组血糖水平极显著低于LFD 组47.36%（p<0.01）。在30 min 和60 min 时，HFD+茶碱组血糖水平分别显著低于HFD 组29.48%（p<0.05）、45.48%（p<0.05），在90 min 时，HFD+茶碱组血糖水平极显著低于HFD 组49.77%（p<0.01）。由图6B 可知，LFD+茶碱组AUC 极显著低于LFD 组38.02%（p<0.01），HFD+茶碱组极显著低于HFD 组36.41%（p<0.01）。结果表明，注射胰岛素后茶碱给药的小鼠血糖水平下降更快，对胰岛素敏感性的反应更迅速，可以有效缓解HFD 诱导小鼠产生的胰岛素抵抗。而HFD+可可碱组血糖水平在30～120 min 期间比HFD 组高，AUC 也比HFD 组高，表明可可碱不仅不能缓解HFD诱导小鼠的胰岛素抵抗，反而会使HFD 小鼠胰岛素抵抗更加严重。
2.3 茶碱和可可碱对小鼠脏器系数的影响
对各组小鼠的器官进行称重，计算小鼠脏器系数，结果见图7。
图7 茶碱和可可碱对小鼠脏器系数的影响
Fig.7 Effects of theophylline and theobromine on organ indexes in mice
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，**表示差异极显著（p<0.01）；HFD+茶碱组和HFD+可可碱组与HFD 组相比，###表示差异高度显著（p<0.001）。
由图7 可知，与LFD 组相比，LFD+茶碱组小鼠的腹股沟脂肪系数降低53.08%，附睾脂肪系数极显著降低57.20%（p<0.01）。与HFD 组相比，HFD+茶碱组小鼠的腹股沟脂肪系数高度显著降低64.16%（p<0.001），附睾脂肪系数降低27.28%。结果表明，茶碱可以降低小鼠腹股沟脂肪和附睾脂肪堆积，且HFD+茶碱组的腹股沟脂肪系数和附睾脂肪系数低于HFD 组，表明茶碱的降脂作用效果很好。可可碱对小鼠腹股沟脂肪和附睾脂肪无抑制作用，与HFD 组相比，HFD+可可碱组的腹股沟脂肪系数和附睾脂肪系数反而有升高的趋势。与HFD 组相比，HFD+茶碱组和HFD+可可碱组降低了小鼠肝脏系数，但效果不显著。
2.4 茶碱和可可碱对小鼠ALT、AST 活力和血脂指标的影响
肥胖常伴随着血脂异常，会引发心血管疾病。因此检测了各组小鼠血脂指标和AST、ALT 活力，结果见图8、图9。
图8 茶碱和可可碱对小鼠血脂指标的影响
Fig.8 Effects of theophylline and theobromine on blood lipid indicators in mice
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，**表示差异极显著（p<0.01），***表示差异高度显著（p<0.001）；HFD+茶碱组、HFD+可可碱组与HFD 组相比，#表示差异显著（p<0.05），##表示差异极显著（p<0.01）。
图9 茶碱和可可碱对小鼠ALT 和AST 活力的影响
Fig.9 Effects of theophylline and theobromine on ALT and AST activity in mice
LFD+茶碱组、LFD+可可碱组与LFD 组相比，*表示差异显著（p<0.05）；HFD+茶碱组、HFD+可可碱组与HFD 组相比，###表示差异高度显著（p<0.001）。
由图8 可知，与LFD 组相比，LFD+茶碱组小鼠血清的TC 和HDL-C 浓度分别高度显著降低31.56%（p<0.001）、24.46%（p<0.001），LDL-C 极显著降低33.33%（p<0.01）；与HFD 组相比，HFD+茶碱组小鼠血清的TG 浓度极显著降低25.65%（p<0.01），TC 和LDL-C 浓度分别显著降低30.38%（p<0.05）、43.09%（p<0.05）。结果表明，茶碱能降低HFD 诱导小鼠血清的TG、TC、LDL-C 浓度，但也会降低HDL-C 浓度，因此，关于茶碱对HFD 诱导小鼠的血脂代谢可能有利也有弊。
由图9 可知，与LFD 组相比，LFD+茶碱组小鼠血清的ALT 活力显著降低46.27%（p<0.05），AST 活力降低16.96%；与HFD 组相比，HFD+茶碱组小鼠血清的ALT 活力高度显著降低45.77%（p<0.001），但对AST 活力无明显影响。结果表明，茶碱可以降低HFD 饮食诱导小鼠血清的ALT 活力，但对AST 活力无影响。可可碱对HFD 饮食小鼠血清的ALT、AST 活力和血脂指标均无抑制作用。
3 讨论与结论
体质量和脂肪系数是反映小鼠肥胖程度的重要指标[31]，在临床大数据中显示肥胖与糖尿病有密切的相关性，血糖升高的肥胖者中大多存在胰岛素抵抗。此类病症想要控制好糖尿病，通过预防糖尿病并发症的发生和减肥是最有效的方法。本研究结果显示，与HFD 组相比，茶碱能抑制HFD 诱导小鼠的体质量增加，并且降低了小鼠的腹股沟脂肪系数和附睾脂肪系数，表明茶碱具有减肥降脂的作用。可可碱虽然和茶碱互为同分异构体，但对小鼠体质量和脂肪系数均无抑制作用。
肥胖是全球公共卫生问题之一，通常与代谢性疾病相关，会增加2 型糖尿病患者的发病率和致死率[33-34]。胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是2 型糖尿病的主要特征，主要表现在胰岛素作用的靶器官对胰岛素敏感性下降，机体为了保持身体的平衡，通过提高胰岛素水平来克服其低下的生物学效应[35]。而胰岛素抵抗的发生与炎症密切相关[36]，炎症因子能干扰胰岛素信号通路传导[37-39]。已有研究证实茶碱具有抗炎的功能[20，40]，并且Gepstein 等[4]的研究表明肥胖是全身胰岛素敏感性降低的主要决定因素，体重增加会降低胰岛素敏感性，而体重减轻会增加胰岛素敏感性。本研究试验结果发现，茶碱能抑制HFD 诱导的小鼠肥胖，并且，通过IPGTT 和IPITT 结果表明，茶碱能缓解HFD诱导小鼠产生的胰岛素抵抗，而可可碱无抑制作用。
肥胖一般伴随着血脂紊乱，容易发生心血管疾病[7]。研究表明茶碱给药16 周后可以改善HFD 诱导小鼠的血脂水平，它可以降低TG、TC 和LDL-C 的水平。可可碱对HFD 诱导小鼠的血脂4 项没有显著影响，这与以往文献报道的不一致[41-43]。除此之外，本研究结果显示，茶碱可以改善HFD 诱导小鼠血清中的ALT 活力，对AST 活力无影响。ALT 和AST 是诊断肝胆系统疾病中应用最广泛的酶，是判断肝细胞受损害程度的敏感指标。因此，未来可以通过研究茶碱对HFD 诱导小鼠肝脏的影响，进一步确定茶碱对非酒精性脂肪肝治疗方面是否有益。而可可碱会升高HFD 诱导小鼠血清中的ALT 和AST 活力，可能会对小鼠肝脏造成一定的损伤。
研究表明，茶碱能减轻HFD 诱导引起的小鼠体质量增加和胰岛素抵抗，但可可碱没有效果，甚至会增加HFD 诱导的小鼠体质量增加和胰岛素抵抗。其次，茶碱能抑制HFD 诱导的小鼠腹股沟脂肪和附睾脂肪堆积，且能抑制HFD 诱导小鼠的TG、TC、LDL-C 和ALT 升高，而可可碱均无抑制作用。对于造成两者功能差异的原因，有待进一步研究。
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