可溶性膳食纤维（soluble dietary fibre，SDF）是影响膳食纤维功能活性的主要因素，与不溶性膳食纤维（insoluble dietary fibre，IDF）相比，其具有更好的持水性、吸油性、膨胀力和金属离子交换能力[1]。SDF 在增强饱腹感、加强胃肠道蠕动、预防和治疗便秘、降血糖、维持人体肠道微生物平衡与渗透压稳定、排毒等方面具有显著作用[2-4]。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）推荐的膳食纤维中，可溶性膳食纤维的含量应大于10%。然而，植物膳食纤维尤其是谷物纤维中SDF 的含量远低于这一推荐值[5]。
小米糠是小米脱壳后的副产物，其纤维含量高达30%～41%，产量大、价格低廉，是良好的膳食纤维原料[6]。然而小米糠膳食纤维中大部分是不溶性膳食纤维，导致其持水力、膨胀性、降糖降脂能力以及金属离子交换能力均较差[7]。因此，有效提高小米糠中可溶性膳食纤维的含量，改善其理化性质与功能活性是小米产业亟待解决的问题。研究表明，羧甲基化和接枝化可以分别将强极性的羧甲基和羧基引入纤维素结构中，有效提高纤维素的极性，从而提高其理化性质和功能活性[8-9]。目前羧甲基化纤维素和接枝化淀粉已经广泛应用于食品工业，是安全、无毒、应用广泛的纤维素改性产品[4，10]。近年来，有学者采用超微粉碎、螺杆挤压、纤维素酶水解与微生物发酵等方法对小米糠纤维进行改性[6，11-14]。同时采用羧甲基化与接枝化对小米糠进行改性的研究鲜有报道。因此，本试验同时采用接枝化和羧甲基化对小米糠膳食纤维进行改性，重点分析不同改性处理对小米糠膳食纤维的化学组成与理化性质的影响，为小米深加工产业提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米糠：市售，为当年新鲜小米脱粒副产物。
糖化酶（1.0×104 U/g）、碱性蛋白酶（1.0×105 U/g）、风味蛋白酶（1.0×104 U/g）：上海玉博生物科技有限公司；冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、乙醇、盐酸、一氯乙酸、丙烯酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
JSM-7500F 型扫描电子显微镜：日本Tokyo 公司；Dor YJA 型电子天平：渡扬精密仪器（上海）有限公司；HHM4 型恒温水浴锅：常州金坛精达仪器制造有限公司；BGX 型恒温干燥箱：上海仪电科技有限公司；TD-4M型离心机：江苏华大离心机制造有限公司；BPH-7200型pH 计：天津市泰斯特仪器有限公司；FS-II 型实验型旋风式粉碎磨：蚂蚁源科学仪器（北京）有限公司；NH310 型色差仪：深圳市三恩驰科技有限公司；BT-2000 E 型激光粒度仪：上海鑫天精密仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 小米糠膳食纤维的制备
将小米糠粉碎并过60 目筛。称取小米糠粉末30 g，加入pH7.4 磷酸缓冲溶液（600 mL、0.1 mol/L），摇匀，加入α-淀粉酶2 g，90 ℃恒温水浴搅拌反应2 h，冷却至50 ℃。用盐酸（0.1 mol/L）调pH 值至8.0，接着加入碱性蛋白酶0.2 g、风味蛋白酶0.2 g，然后50 ℃恒温水浴中搅拌反应3 h，用0.1 mol/L HCl 调节pH 值至2.0。再加入0.5 g 的糖化酶，摇匀后，在60 ℃恒温水浴中搅拌2 h，然后在100 ℃下加热15 min，取出冷却至室温。用滤纸进行过滤后收集滤渣，50 ℃干燥4 h，制得小米糠膳食纤维（millet bran dietary fibre，MBDF）[6]。
1.3.2 接枝化改性
精确称取小米糠膳食纤维1 g，加入120 mL 蒸馏水（distilled water，dH2O），室温连续搅拌10 min。取16 mL NaOH 溶液（1 mol/L）与10 mL 丙烯酸混匀，冷却后加入到反应体系中，搅拌10 min 后，70 ℃恒温反应3 h[8]。冷却，用dH2O 洗涤至中性，再用无水乙醇洗涤。收集沉淀物，45 ℃下干燥8 h，制得接枝化小米糠膳食纤维（grafted millet bran dietary fibre，MBDF-G）。接枝化程度采用Rani 等[15]的方法测定。
1.3.3 羧甲基化改性
精确称取小米糠膳食纤维8 g 于锥形瓶中，加入80 mL、85%乙醇，然后缓慢加入50 mL 氢氧化钠溶液（1 mol/L），混匀后在35 ℃下反应1 h[9]。然后加入30 mL 一氯乙酸和50 mL、85%乙醇溶液，搅拌均匀后在53 ℃下恒温反应3.5 h，冷却至室温。调节反应液pH 值至7.0，4 000×g 下离心15 min，收集沉淀，并用无水乙醇洗涤3～5 次，在45 ℃下干燥4 h，获得羧甲基化小米糠膳食纤维（carboxymethylated millet bran dietary fibre，MBDF-C）。纤维的羧基化程度采用Wang 等[10]的方法进行测定。
1.3.4 小米糠膳食纤维的化学成分测定
水分含量采用恒重法测定，蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，脂肪含量采用索氏抽提法测定，灰分采用马弗炉法测定，可溶性膳食纤维、不可溶性膳食纤维与总膳食纤维含量均采用酶-重量法进行测定[7]，纤维素、半纤维素和木质素的测定均按照Zhu 等[11]的方法进行。
1.3.5 粒径与色泽测定
利用BT-2000 E 型激光粒度仪测定各小米糠纤维的粒径与比表面积（m2/kg），粒径以D3，2（μm）表示，具体步骤参照Zheng 等[7]的方法进行。同时，以未改性的小米糠膳食纤维为对照，用NH310 型色差仪对各改性小米糠膳食纤维的色差（ΔE）进行测定，计算公式见式（1）。
式中：ΔE 为改性小米糠膳食纤维的色差；L*、b*和a*分别为样品的亮度、蓝值和红值；L0*、a0*、b0*分别为未改性小米糠膳食纤维的亮度、蓝值和红值。
1.3.6 傅里叶红外光谱扫描
傅里叶红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR）扫描按照Zheng 等[7]的方法进行。扫描范围为4 000～400 cm-1，狭缝4 cm-1。
1.3.7 表面微观结构的观察
将过100 目筛的小米糠、小米糠膳食纤维、接枝化小米糠膳食纤维和羧甲基化小米糠膳食纤维分别干燥直至恒重后，利用JSM-7500F 型扫描电子显微镜观察表面微观结构，参数设定为放大倍数×5 000、额定电压10 kV、电镜标尺1 μm[9]。
1.3.8 持水力的测定
称量小米糠膳食纤维样品0.500 g（X0）放置于15 mL 的离心管中，称取纤维样品与离心管的总质量（X1），缓慢加入10 mL dH2O，搅拌，在室温下静置12 h后离心（4 000×g，25 min），倒掉上清液，称量带有样品的离心管总质量（X2）[6]。持水力按公式（2）计算。
式中：W 为持水力，g/g。
1.3.9 膨胀力的测定
将0.250 g 小米糠膳食纤维样品（m）装入10 mL量筒内，摇匀，读出体积（Va）[8]。然后加入5 mL dH2O，搅拌、振荡去除产生的气泡后，在室温下静置18 h，读出体积（Vb）。按公式（3）计算膨胀力。
式中：E 为膨胀力，mL/g。
1.3.10 持油力的测定
称取1 g 小米糠膳食纤维（m）放置于干净的离心管内，称量样品与离心管的总质量（X1）[11]。并加10 mL豆油，室温下持续搅拌15 min 后，静置1 h，1 500×g 离心10 min，小心地去除上层豆油，称其质量（X2）。持油力按公式（4）计算。
式中：H 为持油力，g/g。
1.3.11 阳离子交换能力的测定
将小米糠膳食纤维0.500 g（m）置于玻璃三角瓶中，加入20 mL 盐酸溶液（0.1 mol/L），密封、室温下静置12 h，过滤，用dH2O 反复冲洗滤渣，用AgNO3 溶液检测滤液，直到不含Cl-。然后在洗涤后的滤渣中加入100 mL NaCl（5%）,磁力搅拌30 min 后用0.1 mol/L NaOH 滴定，以0.5%酚酞-乙醇溶液为指示剂，直至溶液变色后3 min 内不退色[16]。阳离子交换能力按公式（5）计算。
式中：C 为阳离子交换能力，mmoL/g；Va 为滴定样品所消耗的氢氧化钠溶液体积，mL；Vb 为滴定空白样品所消耗氢氧化钠溶液体积，mL；m 为样品干质量，0.500 g；0.1 为滴定所用氢氧化钠溶液浓度，mol/L。
1.4 数据处理与分析
上述试验重复3 次，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS Version 16.0 软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同改性方法对小米糠膳食纤维化学组成的影响
不同改性方法对小米糠膳食纤维化学组成的影响结果见表1。
表1 不同小米糠膳食纤维的化学组成
Table 1 Chemical composition of different millet bran dietary fibres g/100 g
注：同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
项目水分脂肪蛋白质灰分总膳食纤维可溶性膳食纤维不溶性膳食纤维纤维素半纤维素木质素小米糠2.69±0.13a 6.11±0.56a 3.95±0.04a 5.55±0.35a 69.50±1.20c 1.49±0.32c 68.01±1.50c 15.32±2.33b 46.00±3.19c 6.79±0.47a未改性小米糠膳食纤维2.45±0.07a 5.09±0.37a 2.35±0.11a 5.20±0.11a 84.13±2.34b 1.04±0.43c 87.10±1.97a 19.56±1.44a 57.00±6.23a 10.16±1.29a羧甲基化小米糠膳食纤维3.83±0.06a 3.84±1.33b 1.23±0.07b 5.04±0.34a 89.98±2.80a 10.72±1.94b 74.26±1.47b 15.46±1.84b 44.99±3.94c 8.18±0.43a接枝化小米糠膳食纤维2.24±0.04a 0.60±0.27c 1.58±0.07b 2.70±0.44b 91.73±4.16a 17.00±2.89a 74.73±5.18b 18.26±0.55a 52.12±1.03b 9.66±0.39a
从表1 可以看出，小米糠和未改性小米糠膳食纤维中可溶性膳食纤维含量均较低（1 g/100 g 左右），不溶性膳食纤维是主要成分，且主要是半纤维素，这与已有的研究结果相一致[6，11]。羧甲基化小米糠膳食纤维和接枝化小米糠膳食纤维的可溶性纤维含量约为未改性小米糠纤维的7 倍和11 倍，结果表明，羧甲基化和接枝化对提高小米糠中可溶性膳食纤维含量的效果非常显著。本试验中，采用2 种方法改性后，小米糠膳食纤维的羧甲基化程度与接枝化程度分别为4.12%与1.93%。在改性过程中，小米糠纤维素的晶体结构被破坏，部分羟基暴露出来，在引发剂的帮助下，羧甲基和羧基取代了这些暴露出来的羟基。羧甲基和羧基的极性更强，因此显著提高了小米糠纤维的极性，使其可溶性膳食纤维含量提高[9-10]。同时，羧甲基化和接枝化改性后，小米糠纤维中的脂肪含量、蛋白质含量和灰分含量均明显降低，而总膳食纤维含量升高，这表明改性后的小米糠膳食纤维纯度更高。
王娟等[17]、付晓康等[18]利用高温高压、蒸汽爆破-超微粉碎、超声波等物理改性方法，可以把小米糠可溶性膳食纤维的含量提升至2.37～4.12 g/100 g。姜龙波等[6]利用纤维素酶对小米糠膳食纤维进行改性，结果表明纤维素酶可以将小米糠中可溶性膳食纤维含量提升至3.29 g/100 g。Zhu 等[11]的研究结果表明，利用半纤维素酶水解，可以将小米糠可溶性膳食纤维的含量提升至4.74 g/100 g。然而，这些改性方法的作用效果均不如羧甲基化与接枝化，其原因可能是羧甲基化与接枝化可以直接将极性更强的羧甲基与羧基引入到小米糠多糖链上，从根本上改善了水合性质[9]。
2.2 不同改性方法对小米糠膳食纤维粒径与色泽的影响
不同改性方法对小米糠膳食纤维粒径与色泽的影响结果见表2。
表2 不同改性方法对小米糠膳食纤维粒径与色泽的影响
Table 2 Effects of different modifications on particle size and color of millet bran dietary fibres
注：Control 表示未改性小米糠膳食纤维的色泽；同列不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
?
从表2 可以看出，经羧甲基化和接枝化后，小米糠膳食纤维的粒径显著变小，D3，2由107.24 μm 分别减小至85.34、82.65 μm，其比表面积则显著变大（p＜0.05）。这是因为，在羧甲基化和接枝化中，强碱、加热等处理会使小米糠膳食纤维的晶体结构被破坏、化学键断裂、纤维链变短、纤维结构坍陷，最终使小米糠纤维的粒径变小，比表面积增大[8，14]。粒径与比表面积是膳食纤维理化性质与功能活性的重要影响因素。具有较大比表面积的纤维素在食品体系与人体胃肠道中，与油、水分子等的结合能力更强，表现出更高的功能活性[19]。与未改性的小米糠膳食纤维相比，羧甲基化小米糠膳食纤维和接枝化小米糠膳食纤维均有较大的色差。改性后，小米糠膳食纤维的a*与b*均增大，亮度（L*）显著减小，色泽变深。主要原因是在高温与强碱处理的作用下，纤维发生褐变反应，进而影响小米糠膳食纤维在食品中的应用[17]。
2.3 改性小米糠膳食纤维的傅里叶红外光谱分析
为深入了解羧甲基化与接枝化对小米糠膳食纤维结构的影响，采用傅里叶红外光谱进行分析，结果如图1 所示。
图1 不同小米糠膳食纤维的傅里叶红外光谱
Fig.1 FT-IR spectra of different millet bran dietary fibres
由图1 可知，小米糠膳食纤维与2 种改性小米糠膳食纤维均为典型多糖的傅里叶光谱图，在3 400、1 050、1 650 cm-1 处均有特征吸收峰。其中，3 400 cm-1处的吸收峰是由多糖链中羟基（-OH）的振动引起[12]；1 050、1 650 cm-1 处的吸收峰则分别对应多糖链中的碳氧键（C-O-H）与羧基（-COOH）的不规则振动[5，9]。与小米糠膳食纤维的FT-IR 图谱相比，接枝化和羧甲基化后，吸收峰均发生了明显的红移或蓝移。这表明改性过程中，小米糠膳食纤维多糖链之间的部分氢键被打断，含羧基或羰基的化学基团被接入分子中。对于羧甲基化改性来说（MBDF-C），在2 923.5 cm-1 附近的吸收峰蓝移到了2 916.5 cm-1，而该吸收峰代表甲基（-CH3）上碳氢键（C-H）的拉伸振动[18]，这表明甲基被引入纤维分子中。此外，接枝化后，在1 275、1 513.8 cm-1处出现新的吸收峰[13]，也代表羧基的振动。上述结果均可以证明，改性后的小米糠膳食纤维的部分氢键被破坏，羧甲基与羧基被成功引入。化学键与化学基团的改变，必然导致纤维结构的改变，从而引起理化性质与功能活性发生变化[5]。
2.4 不同改性方法对小米糠膳食纤维表面微观结构的影响
图2 为各小米糠膳食纤维的表面微观结构。
图2 不同小米糠膳食纤维的表面微观结构
Fig.2 Surface microstructure of different millet bran dietary fibres
（a）未改性小米糠膳食纤维；（b）羧甲基化小米糠膳食纤维；（c）接枝化小米糠膳食纤维。
由图2（a）可知，未改性小米糠膳食纤维的表面相对粗糙，有碎片聚拢。图2（b）和图2（c）表明，经羧甲基化和接枝化后，小米糠膳食纤维呈现蜂窝状、多孔的结构。在羧甲基化与接枝化中，强碱、加热等处理会使小米糠膳食纤维的晶体结构被破坏，化学键断裂，导致纤维结构坍陷，表现出多孔状的结构[10]。同时，原料残留的一部分淀粉与蛋白质分子，在羧甲基化与接枝化中被进一步去除，留下空隙，使纤维的表面变得粗糙多孔[8]。多孔的表面结构利于膳食纤维对水分子、油分子及亚硝酸根离子等的吸附，使其具有较好的持水性、持油性与有害离子吸附能力，进而表现出较高的降血糖、降血脂与排毒能力[17]。同时，多孔粗糙的表面结构也是羧甲基化小米糠膳食纤维与接枝化小米糠膳食纤维具有较小粒径与较大比表面积的直观证明。
2.5 不同改性方法对小米糠膳食纤维持水力的影响
持水力是评价膳食纤维与水相互作用力以及纤维在水相食品体系中应用前景的重要评价指标之一[19]。不同改性小米糠膳食纤维的持水力见表3。
表3 不同改性方法对小米糠膳食纤维持水力的影响
Table 3 Effects of different modifications on water-holding
capacity of millet bran dietary fibre g/g
注：同行不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
未改性小米糠膳食纤维接枝化小米糠膳食纤维1.12±0.44b2.69±0.19a2.29±1.63a羧甲基化小米糠膳食纤维
由表3 可知，羧甲基化和接枝化改性后，小米糠膳食纤维的持水力从1.12 g/g 分别增加至2.69、2.29 g/g。主要原因是羧甲基化和接枝化后，大量极性较强的羧甲基和羧基被引入小米糠膳食纤维链中，可溶性纤维含量提高，从而使其持水力提升。其次，未改性小米糠膳食纤维的空间构造比较紧密，水分子无法充分与膳食纤维中的亲水基团结合，所以持水力相对较低；而经改性后的小米糠膳食纤维，膳食纤维分子间的某些氢键被打开，使亲水基团暴露出来，亲水基团与水分子更加充分地接触，增加了与水分子结合的作用面积，从而提高了持水力[9]。此外，接枝化小米糠膳食纤维的持水力与羧甲基化的接近，均显著高于未改性小米糠膳食纤维的持水力，表明这2 种改性方法均可以使小米糠膳食纤维的持水力提高。
2.6 不同改性方法对小米糠膳食纤维膨胀力的影响
不同改性小米糠膳食纤维的膨胀力见表4。
表4 不同改性方法对小米糠膳食纤维膨胀力的影响
Table 4 Effects of different modifications on water-swelling capacity of millet bran dietary fibre mL/g
注：同行不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
未改性小米糠膳食纤维接枝化小米糠膳食纤维1.02±0.10b2.73±0.14a2.00±0.22a羧甲基化小米糠膳食纤维
从表4 可以看出，改性后的小米糠膳食纤维膨胀力得到显著提高（p＜0.05）。这是因为改性提高了小米糠膳食纤维的可溶性膳食纤维含量，同时改变了小米糠膳食纤维的表面微观结构。由于持水力增大，膳食纤维中充分吸水，使得小米糠膳食纤维的空间结构更加蓬松，体积增大，从而使膨胀力增加[20]。总体来说，羧甲基化改性对小米糠膳食纤维的膨胀力的改善效果最好，这与其蜂巢状的多孔结构有关。因为多孔结构的比表面积更大，更容易与水分子结合，从而表现出更高的持水力和膨胀力[16]。
2.7 不同改性方法对小米糠膳食纤维持油力的影响
持油力是评价膳食纤维体内降血脂功能的重要指标之一[2]。不同改性小米糠膳食纤维的持油力见表5。
表5 不同改性方法对小米糠膳食纤维持油力的影响
Table 5 Effects of different modifications on oil holding power of millet bran dietary fibre g/g
注：同行不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
未改性小米糠膳食纤维接枝化小米糠膳食纤维2.19±0.01b4.59±1.02a4.27±0.21a羧甲基化小米糠膳食纤维
由表5 可知，经羧甲基化和接枝化后小米糠膳食纤维的持油力显著提高（p＜0.05）。这是因为改性后小米糠膳食纤维的空间结构被改变，呈现更加多孔状，比表面积增大，对油脂分子的吸附能力增大，从而使持油力增加[13]。综合表3、表5 的结果可以看出，羧甲基化和接枝化既提高了小米糠膳食纤维的持水力，也提高了其持油力。有研究表明，持水力与持油力是对立的。膳食纤维的持水力和持油力的影响因素不同。决定膳食纤维持水力的主要是化学组成、特征基团的极性等，而纤维素的持油力则与其化学组成、疏水性、粒度、表面微观结构密切相关[17，21]。持油力较高意味着小米糠膳食纤维进入人体的胃、肠道后，通过吸收食物中的油脂，体积膨胀，从而引起人的饱腹感，不仅能有效减少进食量以及对脂肪的摄入，起到减肥的效果，还能促进消化道的运动，加快体内代谢物的排出及减轻有害物质对人体的危害[3]。
2.8 不同改性方法对小米糠膳食纤维阳离子交换能力的影响
不同改性小米糠膳食纤维的阳离子交换能力见表6。
表6 不同改性方法对小米糠膳食纤维阳离子交换能力的影响
Table 6 Effects of different modifications on cation-exchanging capacity of millet bran dietary fibre mmol/g
注：同行不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
未改性小米糠膳食纤维接枝化小米糠膳食纤维0.104±0.003c0.182±0.002b0.660±0.020a羧甲基化小米糠膳食纤维
从表6 可以看出，接枝化和羧甲基化后，小米糠膳食纤维的阳离子交换能力分别提高了5.34 倍和0.75倍。主要原因是改性后，小米糠膳食纤维的多糖链中引入了大量的羧甲基与羧基。这2 种基团的极性与负电性均较强，可以极大提升膳食纤维与阳离子的结合能力或静电吸引能力，因此表现出较高的阳离子交换能力[9]。同时，改性使小米糠膳食纤维原有结构的氢键被破坏，使得小米糠膳食纤维中原有的一些侧链基团被暴露出来，例如氨基、羟基等，这些侧链基团可以与阳离子络合，改性后侧链基团增多，进而增大与阳离子的接触面积和接触几率，使改性后的小米糠膳食纤维阳离子交换能力提高[8，22]。
3 结论与展望
本试验结果表明，与未改性小米糠膳食纤维相比，羧甲基化小米糠膳食纤维与接枝化小米糠膳食纤维的总膳食纤维与可溶性膳食纤维的含量提高。改性后小米糠膳食纤维表面呈蜂窝状、多孔状结构，粒径更小，比表面积增大。羧甲基化和接枝化改性后，小米糠膳食纤维的持水力从1.12 g/g 分别增加至2.69、2.29 g/g；而持油力则从2.19 g/g 分别提升至4.59、4.27 g/g。同时，接枝化和羧甲基化后，小米糠膳食纤维的阳离子交换能力分别是未改性小米糠膳食纤维的6.34 倍和1.75 倍。但这2 种改性方法均降低了小米糠膳食纤维的亮度。因此，羧甲基化和接枝化改性都是有效改善小米糠膳食纤维可溶性膳食纤维含量与部分理化性质的有效方法。
与超微粉碎、复合酶解等物理与化学型的改性方法相比，羧甲基化与接枝化能够更好地提高小米糠中可溶性膳食纤维含量，进而改善其持水力、阳离子交换能力等性质。虽然生物酶法的作用条件相对温和，产品似乎也更安全，但其作用机理相对复杂，改性过程也不容易掌握；而化学法的机理相对明确，靶点比较集中，直接从结构上进行改性，因而效果一般较好。然而，利用化学法对小米糠膳食纤维进行改性，其产品的安全性需要重点考虑。此外，将物理法、化学法与生物法相结合对小米糠膳食纤维进行改性，有待进一步研究。
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