葡萄酒作为一种出色的多酚类化合物的来源[1]，在改善内皮依赖性血管张力、氧化应激和动脉粥样硬化等方面具有良好的效果[2]，同时能够预防血栓形成和心血管疾病等的产生。花色苷是葡萄酒中主要的酚类化合物之一，在葡萄酒中的浓度最高，可达2 000 mg/L[3]。花色苷主要以游离花色苷的形式存在于新酿制的酒中。葡萄酒酒体中的游离花色苷主要为锦葵类色素；此外常见的还有矢车菊素、芍药色素、飞燕草素和矮牵牛素等。葡萄酒花色苷不仅具有良好的生物活性[4-5]，而且影响葡萄酒酒体的感官品质[6-8]。花色苷在葡萄酒的发酵和陈酿过程中对光、pH 值、温度等环境因素非常敏感[9]，这导致花色苷在葡萄酒中易发生氧化和降解等反应；同时也会生成更稳定的色素衍生物，主要为吡喃花色苷和其他聚合色素[10]。在陈酿过程中，由于花色苷结构的变化，葡萄酒的酒体颜色会从新酒的紫红色逐渐转变为砖红色[11-12]，颜色趋于稳定，葡萄酒的生物活性也随着酒体的成熟逐渐提升[8]。
颜色被认为是评估食物和饮料品质的重要指标之一。在某种程度上，葡萄酒的颜色可以反映酒的品质，因此消费者也倾向于选择颜色较深的酒[13]。影响葡萄酒颜色的物质主要是酚类化合物，特别是花色苷及其衍生物。葡萄酒通过陈酿才能达到一定的酒龄，酒体的颜色随着酒体中游离花色苷浓度的下降以及复杂的衍生色素浓度的增加逐渐稳定。陈酿后的葡萄酒色泽饱满，香味馥郁。同时，花色苷自身或与其他辅色素（特别是酚类化合物）也可以依靠自缔合或分子内及分子间辅色作用，进一步增强其颜色表现力。辅色效应主要在新酿葡萄酒中起作用，颜色贡献率大约为30%～50%，随着陈酿过程的进行，辅色效应对葡萄酒酒体颜色的贡献逐渐降低[14]，衍生色素对葡萄酒酒体颜色的贡献会更大。
葡萄酒的传统陈酿是一个缓慢耗时的过程，这无疑限制了企业的生产效益。为了解决这个问题，研究人员开始探究可以用于加速陈酿的化学和物理方法[15-16]。许多研究表明，超声波可以用于酒类产品的催熟[17-18]。超声波通过产生物理及化学效应影响葡萄酒的整体变化[19]，缩短葡萄酒陈酿时间[20]。张清安等[21]的研究发现超声处理可以有效降低葡萄酒中高级醇的含量以及促进酒中挥发性酯类物质的形成。Ahmad 等[22]的研究发现超声波处理过的新酒中总花色苷含量和单宁浓度与对照组相比存在显著性差异，涩味减少，口感更顺滑。Sánchez-Córdoba 等[23]研究发现在葡萄酒陈酿阶段应用超声波处理会致使高级醇的降解以及芳香强度的增加。Del Fresno 等[24]研究表明，超声处理可以降低葡萄酒中原花青素的浓度和总色素含量。关于超声波对葡萄酒品质的影响，目前大部分研究仍着眼于超声催陈后葡萄酒酒体风味物质以及口感的变化，对色泽的影响研究还不够深入。超声波作为一种重要的非热加工技术，除了有缩短陈酿时间的优势，还可以使处理过的葡萄酒的质量长时间保持在较高水平[20]。因此，探究超声波对葡萄酒酒体色泽以及酒体中花色苷的影响非常必要。
本研究以新酿制的葡萄酒作为试验材料，对其进行超声波处理，分别探究超声功率、超声次数和超声时间3 个因素对新酒色泽指标的影响。本文的研究有助于进一步明确超声催陈对葡萄酒酒体色泽品质的影响，以期为改善葡萄酒品质，缩短葡萄酒酿造成本提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新酿葡萄酒（葡萄品种：美乐、歌海娜和佳丽酿）：广州市百富酒业有限公司。
醋酸钠、氯化钾、偏重亚硫酸钾、酒石酸氢钾、乙醛（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
JY92-ⅡDN 超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技有限公司；UV 1800PC 紫外可见分光光度计：上海美谱达公司。
1.3 方法
1.3.1 超声波催陈葡萄酒工艺
参照Li 等[25]的方法，略作修改。采用探头式超声波细胞粉碎机，变幅杆直径为6 mm，处理频率为20 kHz，超声间隙为1 s/次，在室温（25 ℃）下对葡萄酒样品进行恒温封闭式超声处理。超声波探头浸入葡萄酒中，位于葡萄酒的中心，并确保每次超声期间探头底端距离样品液面1 cm。在一定的超声时间（10、20、30 min和40 min）、超声功率（90、180、270 W 和360 W）和超声次数（1、2 次和4 次，每次间隔时间为24 h）组合下对葡萄酒进行超声处理。超声处理结束后，将葡萄酒置于酒瓶，橡木塞封口并贮藏（25 ℃，避光），研究葡萄酒在超声处理4 周内花色苷色泽指标的变化。每个试验重复3 次。
1.3.2 葡萄酒中花色苷色泽指标测定
参照Li 等[25]和Somers 等[26-27]的研究，采用紫外可见分光光度计分析葡萄酒中相关色泽指标。
1.3.2.1 pH1.0 时葡萄酒色度（wine color due to pigments，WCP）
取1 mL 葡萄酒样品用1 mol/L 盐酸稀释20 倍。置于暗处平衡30 min 后，用10 mm 比色皿测定样品在520 nm 下的吸光值（A520 nm）。以水为参比溶液，相同条件处理后测定吸光值。pH1.0 时葡萄酒色度（W1）计算公式如下。
W1=A520nm×20
1.3.2.2 pH3.6 时葡萄酒色度（wine color，WC）
将50 μL 10%乙醛溶液加入5 mL 葡萄酒样品中。置于暗处平衡45 min 后，用1 mm 比色皿测定样品在520 nm 下的吸光值（Aacet）。以水为参比溶液，相同条件处理后测定吸光值。pH3.6 时葡萄酒色度（W2）计算公式如下。
W2=Aacet×10
1.3.2.3 抗SO2 漂白的花色苷衍生物色度（color due to pigments derivatives resistant to SO2，CDR SO2）
将75 μL 20%焦亚硫酸钠溶液加入5 mL 葡萄酒样品中。置于暗处平衡10 min 后，用1 mm 比色皿测定样品在520 nm 下的吸光值（ASO2）。以水为参比溶液，相同条件处理后测定吸光值。抗SO2 漂白的花色苷衍生物色度（CSO2）计算公式如下。
CSO2=ASO2×10
1.3.2.4 辅色素引起的花色苷增色效应（copigmented anthocyanin，CA）
测量葡萄酒样品的pH 值，再用氢氧化钠溶液调节12%乙醇和5 g/L 酒石酸氢钾溶液的混合溶液的pH 值到酒的pH 值；取添加了50 μL 10%乙醛的葡萄酒样品1 mL，用19 mL 的12%乙醇和5 g/L 酒石酸氢钾混合溶液进行稀释，使葡萄酒中的辅色素-花色苷复合物解离。稀释后用10 mm 比色皿测定样品在520 nm下的吸光值（Anoncopig）。以水为参比溶液，相同条件处理后测定吸光值。辅色素引起的花色苷增色效应（CA）计算公式如下。
CA=W2-Anoncopig×20
1.3.2.5 葡萄酒中游离花色苷色度（free anthocyanins，FA）
采用pH 示差法测定葡萄酒中游离花色苷的含量。分别向待测样品中加入pH 值为1.0 的0.025 mol/L氯化钾缓冲液和pH 值为4.5 的0.4 mol/L 醋酸钠缓冲液稀释，放置在暗处平衡30 min。用10 mm 比色皿分别测量样品在520 nm 和700 nm 的吸光值。样品中花色苷的含量用锦葵素-3-葡萄糖苷作为标准物。葡萄酒中游离花色苷色度（FA）公式如下。
FA=[（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5]×10
1.3.2.6 葡萄酒化学酒龄（chemical age of wine，CAW）
化学酒龄表示花色苷衍生物的颜色占比，化学酒龄（CAW，%）计算公式如下。
1.4 数据处理
试验数据采用Origin 2018 进行作图，采用单因素方差分析（ANOVA）确定差异具有统计学意义（P＜0.05），结果用平均值±标准差表示。每组试验重复3 次。
2 结果与分析
2.1 超声功率对葡萄酒色泽的影响
2.1.1 超声功率对葡萄酒WCP 和FA 的影响
WCP 主要由离子化的花色苷的种类和含量决定[28]，反映葡萄酒红色色调的变化。通过调节酒体pH 值至1.0，将无色半缩酮花色苷和花色苷-亚硫酸氢盐复合物转化为相应的花色烊阳离子形式后测定葡萄酒的总色度值，包括游离花色苷以及部分花色苷衍生物[25]。FA值能够反映葡萄酒中游离花色苷的含量。游离花色苷的结构因受到pH 值的影响而具有不同的结构形式[29]，利用pH 示差法测量样品中的游离花色苷，快速且不受其他色素干扰[30]。不同超声功率处理组葡萄酒的WCP值、FA 值在贮藏期的变化见图1。
图1 不同超声功率处理组葡萄酒WCP、FA 在贮藏期的变化
Fig.1 The changes of WCP and FA in wines of different ultrasonic power during storage
A.WCP 值；B.FA 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
由图1 可知，WCP 在陈酿早期阶段与游离花色苷呈正相关。随着陈酿过程的进行，FA 值（图1B）在贮藏期内下降，说明游离花色苷含量降低。随着FA 值的降低，各组的WCP 值（图1A）在贮藏4 周内也呈现下降趋势。WCP 的降低意味着花色苷衍生物的形成并不能补偿游离花色苷的减少导致的色度值的降低。WCP 的变化可能原因有两方面，一方面是贮藏期内受外界环境（温度、光照和氧气等）的影响，葡萄酒中游离花色苷的降解[31]；另一方面是游离花色苷经历氧化、聚合和缩合反应，生成了各种花色苷衍生物，而这些衍生物在520 nm 的吸收很低甚至没有吸收[32]。葡萄酒中的衍生色素如通过乙基连接的锦葵色素-3-O-葡萄糖苷-（表）儿茶素二聚体和锦葵色素-3-O-香豆酰葡萄糖苷-（表）儿茶素二聚体的λmax 分别为543 nm 和540 nm，与锦葵色素-3-O-葡萄糖苷（λmax=520 nm）相比显示出红移效应[33]。而与锦葵色素-3-O-葡萄糖苷相比，Vitisin B在490 nm 具有最大吸收波长，从而导致酒体呈现陈酒的橙红色外观[34]。Pinotins、黄烷醇-吡喃花色苷和Vitisin A 这些花色苷衍生物会随着酒龄的增大，比例不断增加。而这些衍生物在紫外光谱中的最大吸收在504～518 nm，这意味着它们具有橙色或淡黄色的色调[35]。Remy-Tanneau 等[36]的研究表明，陈酿过程中锦葵色素-3-O-葡萄糖苷还可以通过C—C 键和醚键与（表）儿茶素聚合生成无色的二聚体，降低了酒体的总体色度。超声处理在一定程度上可以提高酒体的总体颜色表现，如图1A 所示，贮藏4 周后，超声处理（90～360 W）与未经超声处理的对照组相比，WCP 显著增加（P＜0.05）。
2.1.2 超声功率对葡萄酒WC 和CA 的影响
WC 是pH3.6 时葡萄酒在520 nm 处的吸光值，与花色苷和辅色素之间的辅色效应呈正相关[25]。研究表明WC 值与各花色苷及其衍生物的绝对含量有关，而与其相对含量无关[37]，即与质量浓度有关，而与质量百分比无关。
CA 主要反映辅色效应对色泽呈现的贡献。相比陈酒，CA 对新酒颜色的贡献更大，随陈酿时间的延长而降低。这是因为葡萄酒陈酿过程中单宁含量会经历一个解聚过程，黄烷醇含量逐渐增加，辅色效应也增加，但随着陈酿的进行，花色苷衍生物逐渐生成，辅色效应也逐渐减弱。辅色素的存在提高了花色苷稳定性，同时增强了花色苷在酒体中的颜色呈现，因此辅色效应能够进一步促使WC 值增加[38]。不同超声功率处理组葡萄酒WC、CA 在贮藏期的变化见图2。
图2 不同超声功率处理组葡萄酒WC、CA 在贮藏期的变化
Fig.2 The changes of WC and CA in wines of different ultrasonic power during storage
A.WC 值；B.CA 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
新酒中游离花色苷因为经历了氧化、聚合和缩合等反应后含量一直在减少[39]，但游离花色苷逐渐转化成其对应的衍生产物，因此总色素的绝对含量（质量浓度），包括游离花色苷和花色苷衍生产物一直在增加。由图2 可知，葡萄酒的WC（图2A）在贮藏过程中表现出上升趋势。超声明显有利于促进游离花色苷的转化，图2B 表明270 W 和360 W 两种超声功率更有利于促进衍生色素和花色苷-辅色素复合物的生成，从而加速了新酒颜色趋于成熟。李杏华[40]推测超声处理导致葡萄酒WC 增加的原因可能是超声促进了酒体中花色苷与酚酸、黄烷醇等物质之间的辅色作用。
由图2B 可知，反映辅色的CA 整体呈先升高后降低的趋势，并且超声对辅色效应具有促进作用，超声功率为180 W 的试验组和对照组相比，在贮藏初期便表现出显著性差异（P＜0.05），随着贮藏时间的延长，从第0 周的显著增加转变为显著减少（P＜0.05）。这表明一定功率的超声处理所产生的空化效应在酒体中造成局部较高的温度和压力，促进了葡萄酒中的化合物之间的相互碰撞[41]，使得葡萄酒中的辅色素物质和游离花色苷在陈酿初期就形成复合物，这个过程中也会伴随着单宁的加速解聚和儿茶素等单体含量的增加，这也是辅色效应进一步得到促进的原因。Celotti 等[42]试验发现超声波处理过的样品中黄烷醇初始含量降低，而在储藏过程中花色苷和单宁含量降低，黄烷醇和聚合色素含量增加，推测这可能是因为适当的超声波处理后促进酚类化合物的解聚和重组。Masuzawa等[43]研究证实了随着葡萄酒的成熟，超声波会促进酚类化合物的聚合。Fu 等[44]利用在模型酒中添加儿茶素研究超声对酚类化合物变化的影响，发现超声对模型酒中Xanthylium 阳离子色素的产生起到了促进作用，Xanthylium 阳离子色素是通过羧甲基桥联的儿茶素二聚体的氧化产物。而后期，伴随着色素衍生物的生成，游离花色苷以及辅色素的含量降低，辅色效应随即减弱。
2.1.3 超声功率对葡萄酒CDR SO2 和CAW 的影响
CDR SO2 是反映花色苷衍生物的关键色度值，表征葡萄酒在陈酿期间的衍生物的生成以及颜色稳定性。在发酵和陈酿过程中，SO2 产生的亚硫酸根离子可与游离花色苷生成无色且不稳定的花色苷-亚硫酸氢盐复合物[45]。因此，游离的花色苷和一些花色苷衍生物很容易被SO2 进攻从而被漂白。然而，部分碳环4 号位被占据的花色苷衍生物对SO2 相对稳定[46]。CDR SO2 反映能够抗SO2 漂白的花色苷衍生物的色度值。葡萄酒的化学酒龄（CAW）反映花色苷衍生物对酒体颜色的贡献率，是评价葡萄酒陈化的一个重要指标。一般陈酿时间越长，化学酒龄也越大。不同超声功率处理组葡萄酒CDR SO2、CAW 在贮藏期的变化见图3。
图3 不同超声功率处理组葡萄酒CDR SO2、CAW 在贮藏期的变化
Fig.3 The changes of CDR SO2 and CAW in wines of different ultrasonic power during storage
A.CDR SO2 值；B.CAW 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
从图3 可知，在陈酿过程中，葡萄酒中的衍生色素含量逐渐增加，葡萄酒的CDR SO2 和CAW 在4 周的贮藏期内整体均呈现上升趋势。这归因于花色苷转化为更稳定的抗SO2 的衍生色素，这些色素可能是Vitisin A 以及黄烷醇-吡喃花色苷（A-v-F）等4 号位被占据的色素[35]。超声会促进游离花色苷经历氧化、聚合和缩合反应[25，32，46]。由图3A 可知，选择360 W 超声处理葡萄酒并贮藏4 周后，葡萄酒的CDR SO2 与未经超声处理的对照组相比显著提高（P＜0.05）。
2.2 超声次数对葡萄酒色泽的影响
2.2.1 超声次数对葡萄酒WCP 和FA 的影响
不同超声次数处理组葡萄酒WCP、FA 在贮藏期的变化见图4。
图4 不同次数处理组葡萄酒WCP、FA 在贮藏期的变化
Fig.4 The changes of WCP，FA in wines of different ultrasonic cycles during storage
A.WCP 值；B.FA 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
研究表明，多次的超声处理可以在陈酿初期显著提高葡萄酒的色度，如图4A 可知，在贮藏第0 周时，超声处理2 次和4 次的样品中WCP 值显著高于未经超声处理的对照组（P＜0.05）。
游离花色苷在自然陈酿中的减少归因于氧化反应、降解、沉淀、花色苷-辅色素复合物的形成[47]，这也是导致葡萄酒颜色从新酒的紫红色调变为陈酿葡萄酒特有的红宝石色，再到砖红色调的原因。多次超声有利于游离花色苷的降解和转化（图4B），促进衍生色素的生成。
2.2.2 超声次数对葡萄酒WC 和CA 的影响
不同次数处理组葡萄酒WC、CA 在贮藏期的变化见图5。
图5 不同次数处理组葡萄酒WC、CA 在贮藏期的变化
Fig.5 The changes of WC and CA in wines of different ultrasonic cycles during storage
A.WC 值；B.CA 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
由图5A 可知，超声处理2 次和4 次的葡萄酒的WC 在4 周的贮藏期内，相比于未经处理的对照组均有所提高（P＜0.05）。Li 等[25]的研究中发现，改变超声处理次数（1～3 次）对蓝莓酒的色调T 值和色度CD 值的影响有限，而超声处理4 次则可以显著提高T 值。而超声次数的改变对葡萄酒的CA（图5B）无影响。
2.2.3 超声次数对葡萄酒CDR SO2 和CAW 的影响
在陈酿初期，葡萄酒呈现紫红色调主要归因于游离花色苷以及某些衍生物如黄烷醇-花色苷和乙基连接的花色苷-黄烷醇[35]；而随着葡萄酒陈酿的进行，花色苷、黄烷醇-花色苷和通过乙基连接的花色苷-黄烷醇的相对比例降低，Pinotins、黄烷醇-吡喃花色苷（Av-F）和Vitisin A 相对含量逐渐占据优势，使得酒体呈红宝石色调；后期伴随着游离花色苷的降解和转化，酒体逐渐呈现出砖红色。葡萄酒酒体中衍生色素的增加也被认为是葡萄酒品质提升，色泽稳定的表现[48]。不同超声次数对葡萄酒CDR SO2、CAW 在贮藏期的变化的影响见图6。
图6 不同次数处理组葡萄酒CDR SO2、CAW 在贮藏期的变化
Fig.6 The changes of CDR SO2 and CAW in wines of different ultrasonic cycles during storage
A.CDR SO2 值；B.CAW 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
如图6A 所示，葡萄酒CDR SO2 随着陈酿时间的延长而增加。和对照组相比，贮藏4 周后超声处理试验组的CDR SO2 均显著增加（P＜0.05），其中处理4次的葡萄酒增加最显著。由图6B 可知，超声4 次同样可以显著提高葡萄酒的化学酒龄CAW，推测超声次数的增加促进了葡萄酒陈酿过程中游离花色苷的衍生化。由此表明，超声处理次数的增加对衍生色素的生成起到了增效作用。
2.3 超声时间对葡萄酒色泽的影响
通常超声会导致花色苷降解，这主要是因为超声波产生的温度、压力或固体和液体界面之间的声空化效应以及由微流和冲击产生的剪切力导致的[49]。过长的超声处理过程中温度的升高也可能会促进自由基的增加，这些自由基通过开环和形成查尔酮形式参与了花色苷的降解[50]。Cao 等[49]研究表明较长时间的超声处理可以导致杨梅汁中花色苷的降解。Fulcrand 等[51]的研究表明较长时间的超声处理可以促进红葡萄汁中花色苷的降解。Li 等[25]在对蓝莓酒的研究中发现过长的超声处理并不会造成酒体中花色苷的过度降解。Natolino 等[52]在对葡萄酒进行90%的振幅和10 min 的超声处理后，葡萄酒最高温度达到48°C，并未发现降解现象。Fulcrand 等[51]认为降解程度会因花色苷结构的不同而具有特异性。花色苷在超声处理过程中的降解是具有特异性的[53-54]。超声处理时间同样可以对葡萄酒的色泽产生影响。超声时间对葡萄酒色泽的影响如图7 所示。
图7 不同超声时间处理组葡萄酒在贮藏期的变化
Fig.7 The changes in wines of different ultrasonic time during storage
A.WCP 值；B.FA 值；C.WC 值；D.CA 值；E.CDR SO2 值；F.CAW 值。不同小写字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。
选择合适的超声时间可以促进酒体中衍生色素和花色苷-辅色素复合物的生成。从图7C 可知，当超声时间为20 min 时，超声处理组的WC 和对照组相比具有显著性差异（P＜0.05），表明20 min 的超声处理使得酒体中花色苷及其衍生物的绝对含量高于对照组。图7E 显示，贮藏4 周后，10～30 min 的超声处理和对照组相比，酒体的CDR SO2 均显著性增加（P＜0.05），且以20 min 为最显著。Sun 等[46]的研究表明超声处理可以加速花色苷向衍生色素转化。而从图7d 可以看出，随着贮藏期的延长，在第4 周时，超声处理20～40 min的葡萄酒的CA 已经显著高于对照组（P＜0.05），表明一定的超声时间的处理有利于葡萄酒陈酿早期辅色效应的增强。
3 结论
陈酿期间，因游离花色苷的降解和衍生色素的生成，葡萄酒酒体颜色会从新酒的紫红色逐渐转变为砖红色。葡萄酒的色泽指标能够简单、直观的反映花色苷及其衍生色素的相互转化情况。本试验发现，适当的超声波处理（超声时间20 min、超声功率180 W、超声4次）可以加速游离花色苷的降解和转化，促进酒体中花色苷衍生物的生成从而增大葡萄酒的化学酒龄。此外，适当的超声处理能提高葡萄酒的色度值，促使葡萄酒从紫红色色调向着砖红色色调转变。总的来说，超声波作为一种非热加工技术有利于提高葡萄酒在陈酿过程中的色泽品质，进一步缩短陈酿时间。
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