红苋菜（Amaranthus tricolor L.），学名苋菜，别名雁来红、红菜、老少年，为苋科一年生草本植物[1]。具有清肝明目、降血脂、心脏保护和消肿解毒的功效，常以其叶片、根入药，治疗赤白痢疾、绦虫、黄疽等[2]。目前关于该植物的研究涉及天然红色素的提取，浸泡酒制作工艺的优化、化学成分组成以及提取物具有中枢神经系统抑制和抗焦虑活性等方面[3-4]，有关总黄酮类物质及其活性的研究鲜见报道。总黄酮类化合物，是以糖苷或游离态形式存在于自然界的一类特殊化合物，是植物界较常见且分布广的天然活性成分，具有抗癌抑菌、消炎镇痛、抗氧化、抗辐射、保护心血管、降脂等生理功效[5-6]。
在苋属植物中总黄酮可从根、茎、叶等部位中进行提取，其方法主要包括热水提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等[7]。研究表明，超声波辅助提取过程会产生空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应，可以提高细胞壁破碎速度增加溶剂渗透作用，达到提取细胞内容物的目的，能有效提高天然产物成分的提取率[9]。因此，本试验拟采用超声辅助乙醇提取法对红苋菜总黄酮的提取工艺参数进行优化，并研究其抗氧化及抑菌活性，以期为今后红苋菜的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
红苋菜：市售；三氯化铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：茂名市雄大化工有限公司；芦丁标准品（分析纯）、青霉素（分析纯）：青岛克斯特生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）、抗坏血酸（分析纯）：天津鸿鑫化学药品有限责任公司。
JE1103CE 电子天平：梅特勒-托利多国际有限公司；R-1010 旋转蒸发器：耀特设备科技有限公司；V-5600（PC）型紫外可见分光光度计：元析仪器国际有限公司；KKRQ-409B 电导率仪：北京仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 芦丁标准曲线的绘制
分别吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 芦丁标准溶液储备液于25 mL 比色管中，向其加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置6 min，加入0.3 mL 10%三氯化铝溶液静置6 min，最后加入4.0 mL 4%氢氧化钠溶液，摇匀后静置15 min[10]，空白对照使用75%乙醇溶液，将以上8 个不同浓度的芦丁溶液于510 nm波长处测定对应吸光值；以芦丁质量浓度为x 轴，吸光度为y 轴，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.008 7x+0.097 5，R2=0.996 5。
1.2.2 红苋菜中总黄酮的提取
取2.0 g 红苋菜样品粉末，加入50 mL 乙醇溶液，60 ℃超声辅助提取1.5 h，吸取1.0 mL 提取液，按照1.2.1 的方法，在波长为510 nm 条件下测定样品的吸光值，依据标准曲线计算总黄酮含量。
1.2.3 单因素试验
1）固定提取时间2.0 h、料液比1∶30（g/mL），改变提取温度条件（40、50、60、70、80 ℃），进行超声辅助提取，并测定红苋菜总黄酮提取量，考察提取温度对总黄酮提取量的影响。
2）保持提取温度70 ℃不变，在料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）条件下超声辅助提取2.0 h，测定总黄酮提取量，考察料液比对总黄酮提取量的影响。
3）固定提取温度为70 ℃，料液比为1∶40（g/mL），考察提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 时对总黄酮提取量的影响。
1.2.4 正交试验
根据各单因素试验的结果，以提取温度、料液比、提取时间为考察因素，以总黄酮提取量为指标，利用正交试验优化得到最佳提取工艺条件，因素水平见表1。
表1 试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平因素A 提取时间/hB 料液比/（g/mL）C 提取温度/℃1 1.51∶3050 2 2.01∶4060 3 2.51∶5070
1.2.5 抗氧化活性测定
DPPH 自由基清除能力测定，参照张晓婷等[11]的方法，按下列公式计算DPPH 自由基清除率X（%）。
式中：Ai 为样品溶液的吸光值；Aj 为95%乙醇溶液的吸光值；A0 为95%乙醇和DPPH 工作液的吸光值。
还原能力测定参考马洪鑫等[12]的方法稍作修改，1 mL 样品中加入浓度0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液2.5 mL，再加入质量分数1%铁氰化钾2.5 mL，充分混匀，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min 离心10 min，最后加入2.5 mL 蒸馏水、0.5 mL 0.1%氯化铁溶液，以未加样品液的反应溶液作为参比溶液，测定700 nm 处吸光值。
1.2.6 抑菌活性测定
取最佳工艺获得的红苋菜总黄酮，以30%乙醇配制相应质量浓度菌悬液为处理组，以无菌培养基作为空白对照组，以没有加红苋菜总黄酮处理的菌悬液为对照组，以30%乙醇溶液为阴性对照，青霉素为阳性对照。最低抑菌浓度测定采用二倍稀释法[13]，按下列公式计算抑制率Y（%）。
式中：C2 为处理组的吸光值；C1 为对照组的吸光值；C0 为空白对照组的吸光值。
1.2.7 体外抑菌作用机制
将一定量培养到对数期的金黄色葡萄球菌，接种至含有液体培养基的锥形瓶中，分别加入稀释后的红苋菜总黄酮提取液。摇床培养，每小时取菌液4 mL，4 500 r/min 条件下离心10 min 收集上清液，用紫外可见分光光度计于260 nm 和280 nm 处测量吸光值[14]。参考文献[15]的方法使用电导率仪测量溶液的电导率。
1.3 数据处理
试验数据统计分析采用SPSS 25.0、Origin 9.0 等软件进行数据处理及图形绘制。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
红苋菜总黄酮提取的单因素试验结果见图1。
图1 红苋菜总黄酮提取单因素试验结果
Fig.1 Single factor test results for extraction of flavonoids from Amaranthus tricolor L.
由图1 可知，提取温度在40～80 ℃时，总黄酮提取量随提取温度的升高先增大后减小，总体增幅较小，50 ℃时提取效果最好，总黄酮提取量达到1.303 mg/g，此后随着提取温度的继续升高，总黄酮提取量缓慢下降。由此说明，提取温度过高或过低都会影响提取效果。适当地升高提取温度，有利于加快分子的扩散运动，进而加快料液两相间的混合及总黄酮物质的溶出，当提取温度高于50 ℃，总黄酮提取量开始下降，这可能是由于溶剂在提取过程中随温度的升高而挥发，以及在高温状态下总黄酮物质发生分解[16]，因此确定提取温度为50 ℃最佳。
料液比为1∶40（g/mL）时，总黄酮提取量达最高值1.192 mg/g，之后继续增加溶剂量，总黄酮提取量反而呈下降趋势。其原因推测为溶剂量较少时红苋菜中的总黄酮与乙醇接触面积较小，溶出的总黄酮类物质总黄酮浓度较低；随着溶剂量的增加，乙醇与红苋菜中的总黄酮接触面积增大，总黄酮溶解度增大，总黄酮提取量也随之增高；但乙醇溶液的量过多，脂溶性杂质等含量也相对增加，从而影响总黄酮提取量[17]。因此，最佳料液比为1∶40（g/mL）。
红苋菜中总黄酮提取量随着提取时间的延长先增大后减小，当提取2.0 h 时，总黄酮提取量最高，为1.290 mg/g，提取时间继续延长而总黄酮提取量逐渐降低。说明长时间加热提取会破坏总黄酮类活性成分，降低其稳定性，加速溶剂乙醇的挥发，影响提取效果[18]，因此，确定红苋菜的最佳提取时间为2.0 h。
2.2 正交试验
根据单因素试验结果，以总黄酮提取量为评价指标，选择提取时间、料液比、提取温度3 个因素，进行正交试验，结果见表2。
表2 正交试验分析方案及结果
Table 2 Scheme and results of orthogonal test
试验号ABC总黄酮提取量/（mg/g）11111.047 21221.012 31331.151 42120.984 52231.408 62311.088 73131.060 83211.144 93320.949 K13.2103.0913.279 K23.4803.5642.945 K33.1533.1883.619 R0.3270.4730.674
由表2 可知，影响红苋菜总黄酮提取量的因素主次顺序为提取温度＞料液比＞提取时间，根据正交试验的结果，可确定最佳的提取条件为A2B2C3，即提取时间为2.0 h，料液比为1∶40（g/mL），提取温度为70 ℃，进一步根据最优方案进行3 次平行试验，得到红苋菜总黄酮提取量平均值为1.498 mg/g，优化后的提取方案重复性好，总黄酮提取量高于正交试验结果，表明本试验得出的最佳工艺结果具有可靠性。
2.3 抗氧化能力
红苋菜总黄酮和抗坏血酸对DPPH 自由基清除效果见图2。
图2 红苋菜总黄酮和抗坏血酸对DPPH 自由基清除效果
Fig.2 DPPH free radical scavenging activities of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.and ascorbic acid
由图2 可知，在考察的质量浓度范围内，红苋菜总黄酮提取物对DPPH 自由基具有较好的清除能力（IC50值为38.5 μg/mL），但是弱于抗坏血酸，这可能是提取液中含有的色素及脂类的干扰，降低了其抗氧化活性。
红苋菜总黄酮和抗坏血酸的还原能力见图3。
图3 红苋菜总黄酮和抗坏血酸的还原能力
Fig.3 Reducing power of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.and ascorbic acid
由图3 可知，不同质量浓度总黄酮提取液对Fe3+均有较强的还原能力，且总黄酮提取物的还原能力呈浓度依赖性增加。当样品质量浓度为80.00 μg/mL 时，与阳性对照溶液的还原能力相近。这可能是总黄酮类物质与反应体系中的金属离子发生强烈的螯合反应，从而更好地将三价铁离子还原为亚铁离子，进而展现出良好的抗氧化活性[19-20]。
2.4 抑菌能力
红苋菜总黄酮提取物对微生物的抑制作用见表3。
表3 红苋菜总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑制效果
Table 3 Inhibitory effect of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on Staphylococcus aureus
注：—表示无抑菌效果。
样品稀释体积分数/%抑菌圈直径/mm提取液无菌水青霉素100.013.0±0.8—26.0±1.5 50.07.0±0.2—17.0±1.3 25.05.3±0.7—12.0±0.5 12.51.5±0.1—9.0±0.6
由表3 可知，随着红苋菜总黄酮体积分数的增加，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不断增强。当体积分数为50.0%时，抑菌圈直径为7.0 mm，抑菌效果比较明显，当体积分数达到100.0%时，抑菌效果最强。可见，高体积分数的黄酮类化合物对细菌的抑菌效果较好。基于上述结果，进一步考察提取物的最小抑菌浓度，结果见表4。
表4 不同浓度红苋菜总黄酮对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用
Table 4 Inhibitory effects of different concentrations of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on the growth of Staphylococcus aureus
浓度/（mg/mL）生长抑制率/%160.00100.0±4.9 80.00100.0±2.4 40.00100.0±1.5 20.0095.6±2.9 10.0089.8±5.2 5.0039.5±4.7 2.5015.0±1.3 1.250.0±0.1
由表4 可知，红苋菜总黄酮够明显抑制金黄色葡萄球菌的增殖，随着浓度的增大生长抑制率逐渐增强，当以浓度为2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 的红苋菜总黄酮提取液处理时，其抑菌率分别为15.0%、39.5%、89.8%和95.6%，当其浓度为40.00 mg/mL 时，抑制率达到了100.0%，即红苋菜总黄酮对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为40.00 mg/mL。
2.5 抑菌机制
细胞膜保持了细胞内外渗透压的平衡，当菌体受到外界侵害时，细胞膜的通透性和完整性受到损伤，使菌细胞内容物（蛋白质和核酸）大量泄漏，导致电导率增加[21]，因此细胞内核酸、蛋白质和电导率的变化是表征细胞膜破裂的3 个重要指标[14]。红苋菜总黄酮对细胞膜通透性和电导率的影响见图4。
图4 红苋菜总黄酮对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性和电导率的影响
Fig.4 Effects of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on cell membrane permeability and conductivity of Staphylococcus aureus
由图4 可知，红苋菜总黄酮提取物处理后的金黄色葡萄球菌在260 nm 和280 nm 处的吸光值与未添加提取物的对照组相比明显增加，并随着提取液浓度的增大和处理时间的延长而增多，表明提取物引起了菌体细胞内蛋白和核酸泄露。同样，未添加红苋菜总黄酮提取物的对照组，菌悬液中电导率增长缓慢，当提取物作用于金黄色葡萄球菌180 min 后其电导率与对照组相比增加了74.3%，这表明红苋菜总黄酮提取物是通过破坏细菌的细胞膜从而抑制其生长。
3 结论
本试验采用正交试验法优化了红苋菜总黄酮提取工艺。结果显示最优提取工艺为提取时间2.0 h、料液比1∶40（g/mL）、提取温度70 ℃，在该工艺条件下，红苋菜中的总黄酮提取量高达1.498 mg/g。此外，红苋菜总黄酮提取物显现出了较强的DPPH 自由基清除能力和还原能力，且抗氧化活性随着提取液质量浓度的增加而升高。由最低抑菌浓度试验结果可知，红苋菜总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌具有抑制效果。通过抑菌机理试验可知，红苋菜总黄酮提取物通过破坏细胞膜通透性或完整性，导致菌悬液中电导率增大，大分子物质浓度上升明显，进而抑制细菌生长。综上，红苋菜总黄酮提取物表现出了较强的体外抗氧化能力和抑菌活性，后期将对其在抗氧化和抑菌活性的构效关系和相关分子机理进行深入研究。
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