牛排菇（Fistulln hepatica），又名褐蘑菇、洋松茸、波多黎各菌、牛舌菌、猪肝菌，属于担子菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，是双孢蘑菇的近缘种[1]。其菌肉厚实紧密，口味独特，畅销欧美诸多国家，后被我国长江中下游地区引进且成功驯化栽培。牛排菇含有丰富的蛋白质，其脂肪和胆固醇含量较低[2]。牛排菇可增加矿物质含量[3]，降低肌肉蛋白质的损失、抑制胸腺萎缩和减少类风湿性关节炎的发生[4]。此外，研究者发现牛排菇不仅能预防肿瘤[5]，还能通过生成白细胞介素来调节肠道免疫力[6]。牛排菇的营养功能和潜在的多种药用价值赋予其广阔的市场开发前景。
食用菌源多肽的研究近年来得到重视，相关多肽的提取研究和功能性价值被不断报道，如利用灵芝水解物可分离出抗氧化肽[7]，从羊肚菌中可发现一种具有肿瘤预防功能的新型多肽等[8]。食用菌源多肽不仅分子量小容易被人体吸收，且其食用安全，用于疾病预防和治疗时，对人体没有副作用，可以替代很多药物用于人体治疗[9]。但牛排菇多肽方面的研究目前鲜有报道，仅见刘莹[10]利用耗时较长的水提醇沉法获得该多肽。关于多肽的提取主要有酶解法、发酵法、化学合成法[11]。发酵法是利用微生物在适宜条件下发酵产生的蛋白酶将原料代谢分解成多肽等小分子，此方法成本低但是过程不易于控制，生成的产物具有不确定性[12]。化学合成法则对技术要求高，工艺繁琐，多不被采用。酶解法在食品和生物医药业中应用性很高，因为酶解的过程中不会加入有机溶剂，也不会产生对人体有毒害的物质，整个反应体系便于调控[13]。因此本研究拟以珍稀食用菌——牛排菇为原料，采用酶解法进行多肽提取，通过对反应时间、底物浓度、pH 值、温度、加酶量进行考察，利用响应面试验优化多肽提取工艺，以期为后续该多肽的活性研究及相关功能产品的开发提供试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛排菇：市售；氢氧化钠、甲醛（均为分析纯）：广东光华科技股份有限公司；盐酸（分析纯）：南京化学试剂有限公司；酸性蛋白酶（10 000 U/g）、碱性蛋白酶（20 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、木瓜蛋白酶（80 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；胰酶（4 000 U/g）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电热恒温水槽（DK-8D 型）：上海森信实验仪器有限公司；电子天平（CP124C）、pH 计（STARTER 3100）：奥豪斯仪器（上海）有限公司；电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；离心机（TDZ5-WS）：长沙湘智离心机仪器有限公司；高速多功能粉碎机（RHP-400）：浙江永康市荣浩工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 牛排菇多肽提取工艺
将牛排菇清洗干净后在50 ℃下烘干，粉碎，过100 目筛。称量1.00 g 蘑菇粉，根据不同底物浓度加入水后混匀，放置在指定温度的水浴锅中预热10 min，用1 mol/L NaOH 和HCl 溶液调节至适宜pH 值，然后根据一定的加酶量加入对应的蛋白酶，再次混匀后放置水浴锅中水浴一定时间。水浴结束后在100 ℃下灭酶10 min，冷却后在4 000 r/min 下离心20 min，取上清液得粗多肽[14]。
1.3.2 蛋白酶筛选
将酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶5 种酶分别在各自的最适pH 值和最适温度下对牛排菇进行酶解，各自最适条件见表1[15]。根据1.3.1步骤，加酶量设为3 000 U/g，每隔1 h 测定不同蛋白酶对酶解过程中水解度的影响，持续6 h，筛选出最佳蛋白酶[16-17]。
表1 不同蛋白酶最适的pH 值和温度
Table 1 Optimal pH value and temperature of different proteases
蛋白酶种类最适pH 值最适温度/℃胰酶845胃蛋白酶237酸性蛋白酶345碱性蛋白酶950木瓜蛋白酶6.550
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 反应时间对酶解效果的影响
固定底物浓度为4%，温度为45 ℃，pH 值为7，加酶量3 000 U/g，分别设置反应时间为1、2、3、4、5、6 h，以水解度为指标，考察不同反应时间对水解度的影响。
1.3.3.2 底物浓度对酶解效果的影响
固定pH 值为8，温度为45 ℃，反应时间4 h，加酶量3 000 U/g，分别设置底物浓度为3%、4%、5%、6%、7%，以水解度为指标，考察不同底物浓度对水解度的影响。
1.3.3.3 pH 值对酶解效果的影响
当反应条件设为底物浓度为4%，温度为45 ℃，反应时间4 h，加酶量3 000 U/g，分别设置pH 值为6、7、8、9、10，以水解度为指标，考察不同pH 值对水解度的影响。
1.3.3.4 温度对酶解效果的影响
当反应条件设为底物浓度为4%，pH 值为7，反应时间4 h，加酶量3 000 U/g，分别设置温度为40、45、50、55、60 ℃，以水解度为指标，考察不同温度对水解度的影响。
1.3.3.5 加酶量对酶解效果的影响
当反应条件设为底物浓度为4%，pH 值为7，温度为45 ℃，反应时间4 h，分别设置加酶量为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g，以水解度为指标，考察不同加酶量对水解度的影响。
1.3.4 响应面试验
根据单因素试验结果，选择对水解度影响较大的反应时间、底物浓度、pH 值、加酶量4 个因素为自变量，以水解度为响应值，进行Box-Behnken 试验设计，因素水平如表2 所示。
表2 Box-Behnken 试验设计因素水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design
水平 A 反应时间/h B 底物浓度/% C 加酶量/（U/g） D pH 值-1336 0006 0448 0007 15510 0008
1.3.5 总氮量测定
根据GB 5009.5—2016 《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定牛排菇中总氮量。
1.3.6 氨基态氮含量测定
取5 mL 酶解液，加入60 mL 去CO2 水（蒸馏水超声20 min），混匀，用0.1 mol/L NaOH 调节pH 值至8.2，加入20 mL 中性甲醛溶液（取50 mL 甲醛加入3 mL 0.5%酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH 滴加至颜色变为微粉红色，现配现用），用0.1 mol/L NaOH 调pH 值至9.2，记录加入甲醛后所消耗的氢氧化钠体积。空白对照用65 mL 水重复上述试验，记录加入甲醛后消耗的体积[18]。氨基态氮含量计算公式如下[19]。
式中：M 为氨基态氮含量，mg/mL；C 为氢氧化钠浓度，mol/L；V1 为空白对照加入甲醛后消耗氢氧化钠的体积，mL；V2 为样液加入甲醛后消耗氢氧化钠的体积，mL；V3 为所取样液体积mL；14 为氮元素的相对分子质量，g/mol。
1.3.7 水解度测定
水解度计算公式如下。
式中：h 为水解度，%；A 为氨基态氮含量，mg/mL；B 为总氮含量，mg/mL。
1.4 数据处理
每组试验重复3 次，试验结果利用SAS V8 中单因素方差分析Duncan 法进行显著性分析，并用Origin 8.5 软件作图。通过Design-Expert 8.0.6 设计响应面试验，并对试验数据进行方差分析及二次多项式回归拟合，当P＜0.05 时，结果具有显著差异。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶筛选
胰酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶5 种酶的水解度结果如图1 所示。
图1 不同种类酶对酶解程度的影响
Fig.1 Effects of different kinds of enzymes on the degree of enzymatic hydrolysis
由图1 可知，在同一时间下，几种酶对牛排菇酶解的程度依次为胰酶＞木瓜蛋白酶＞碱性蛋白酶＞胃蛋白酶＞酸性蛋白酶。因为不同酶的酶切位点不同，酶解效果不一样，结果显示胰酶水解度明显高于其他4 种酶，所以选择胰酶对牛排菇进行酶解。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 反应时间对水解度的影响
不同反应时间对酶解效果的影响如图2 所示。
图2 不同反应时间对酶解效果的影响
Fig.2 Effects of different reaction times on enzymatic hydrolysis
不同大写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图2 可知，随着反应时间延长，水解度增加，到达5 h 后虽有所下降，但是并不显著（P＞0.05）。因为酶解时间过短，酶与底物的接触时间不足，影响酶解效果，当酶解时间过长，则酶解过度，使多肽分解成小分子氨基酸。又因为4 h 与5 h 的水解度并没有显著差异（P＞0.05），从节能节时角度考虑，4 h 可作为酶解时间的中心点。
2.2.2 底物浓度对水解度的影响
不同底物浓度对酶解效果的影响如图3 所示。
图3 不同底物浓度对酶解效果的影响
Fig.3 Effects of substrate concentrations on enzymatic hydrolysis
不同大写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图3 可知，随着底物浓度增加，水解度先增加后降低，在底物浓度为4%时水解度达到最大。当底物浓度太大时，酶与底物不能充分接触，导致反应不完全，而当底物浓度太小时，酶的浓度被稀释，影响了酶解反应的进行[20-21]。因此选择3%、4%和5%作为底物浓度的3 个水平进行后续试验。
2.2.3 pH 值对水解度的影响
不同pH 值对酶解效果的影响如图4 所示。
图4 不同pH 值对酶解效果的影响
Fig.4 Effects of different pH values on enzymatic hydrolysis
不同大写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图4 可知，水解度随着pH 值的增大先升高后降低。每种酶都有最适pH 值范围，过高或过低都会直接影响酶活，当pH 值大于7 时，酶的生物活性下降，其酶解能力也随之下降[22]。所以选择6、7、8 作为pH 值的3 个水平进行后续试验。
2.2.4 温度对水解度的影响
不同温度对酶解效果的影响如图5 所示。
图5 不同温度对酶解效果的影响
Fig.5 Effects of different reaction temperatures on enzymatic hydrolysis
不同大写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图5 可知，随着反应温度的升高，其水解度先升高后降低，在45 ℃达到最高点。因为温度适当上升，可以增加酶活力，提高酶促反应速率，但是温度过高会破坏酶的结构，使得酶活性降低[23]。因此选择45 ℃作为后续试验的最适温度，不再对反应温度进一步优化。
2.2.5 加酶量对水解度的影响
不同加酶量对酶解效果的影响如图6 所示。
图6 加酶量对酶解效果的影响
Fig.6 Effects of different enzyme additions on enzymatic hydrolysis
不同大写字母表示存在显著性差异，P＜0.05。
由图6 可知，随着加酶量的增加，底物水解度不断升高，超过8 000 U/g 后增加不显著（P＞0.05），这是因为随着加酶量增加，酶与底物结合位点不断增加，水解程度不断加大，但是当加酶量达到一定程度，结合位点趋向饱和，继续提高加酶量也不会提升水解效果[24]。又因为加酶量在8 000 U/g 与10 000 U/g 时不显著（P＞0.05），所以选择加酶量6 000、8 000、10 000 U/g 3 个水平进行后续试验。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面试验结果
Box-Behnken 设计试验方案和结果见表3，方差分析见表4。
表3 响应面试验方案与结果
Table 3 Response surface experimental design and results
试验号A 反应时间/h B 底物浓度/%C 加酶量/（U/g）D pH 值 水解度/%1338 000759.17 2538 000761.28 3358 000754.24 4558 000757.41 5446 000652.39 64410 000657.23 7446 000853.71 84410 000861.19 9348 000653.71 10548 000658.55 11348 000858.99
表4 响应面试验设计方差分析
Table 4 Analysis of variance of response surface experimental design
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源模型A 反应时间B 底物浓度C 加酶量D pH 值AB AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项误差总变异平方和199.03 24.83 53.59 77.83 20.70 0.07 0.05 5.86 0.03 0.07 1.74 5.38 0.02 0.06 6.13 4.85 3.84 1.01 203.88自由度14 111111111111111 4 F 值41.07 71.73 154.84 224.86 59.80 0.20 0.15 16.92 0.09 0.20 5.03 15.54 0.05 0.16 17.70 P 值＜0.000 1**＜0.000 1**＜0.000 1**＜0.000 1**＜0.000 1**0.659 3 0.707 9 0.001 1**0.770 5 0.665 3 0.041 5*0.001 5**0.821 0 0.697 2 0.000 9**10 4 28均方14.22 24.83 53.59 77.83 20.70 0.07 0.05 5.86 0.03 0.07 1.74 5.38 0.02 0.06 6.13 0.35 0.38 0.25 1.53 0.363 7
采用Design-Expert.8.0.6 软件得到响应值与各影响因素之间的二元多项式回归方程：水解度=57.41+1.44A-2.11B+2.55C+1.31D+0.13AB+0.11AC-1.21AD-0.088BC-0.13BD+0.66CD+0.91A2-0.053B2+0.092C2-0.97D2。
续表3 响应面试验方案与结果
Continue table 3 Response surface experimental design and results
试验号A 反应时间/h B 底物浓度/%C 加酶量/（U/g）D pH 值 水解度/%12548 000859.43 13436 000757.58 14456 000753.53 154310 000761.81 164510 000757.41 17346 000754.15 18546 000757.23 193410 000758.99 205410 000762.52 21438 000657.06 22458 000653.53 23438 000859.70 24458 000855.65 25448 000756.79 26448 000757.23 27448 000757.67 28448 000758.11 29448 000757.23
通过表4 结果可知，该模型P＜0.000 1＜0.01 说明该响应面拟合模型极显著，可以较好地反映试验因素对响应值的影响，失拟项P=0.363 7，不显著（P＞0.05），说明回归模型拟合程度良好，非试验因素对试验结果影响较小。决定系数R2 值越接近1，说明模型的预测值与实际值越接近，该模型R2=0.982 3，矫正后模型决定系数R2Adj=0.964 5，说明该回归方程拟合度较好，可以用此模型分析和预测各因素对水解度的影响。由F值得到各因素对水解度影响的主次顺序为C>B>A>D，所以对牛排菇多肽的水解度影响最大的是加酶量，然后是底物浓度、反应时间，最后是pH 值。由回归方程和方差分析可知，模型中各因素对水解度的影响均达到极显著水平（P＜0.01）；对于交互项因素而言，AD 交互作用极显著（P＜0.01）、CD 因素的交互作用显著（P＜0.05）。对于二次项因素而言，A2、D2 因素的交互作用均极显著（P＜0.01）。
2.3.2 工艺优化与验证试验
为了进一步确定提取的最佳工艺条件，利用Design-Expert 8.0.6 分析，最终分析得到牛排菇多肽的最佳提取工艺条件为反应时间5 h、底物浓度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量9 998.11 U/g、多肽水解度的预测值为59.97%。考虑实际情况，调整提取工艺为反应时间5 h、底物浓度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量10 000 U/g。为检验试验结果与真实情况的一致性和可靠性，进行3 次验证试验，在最佳工艺条件下，水解度实测值为59.17%，与预测值相差0.8%，该响应面法优化所得的最佳工艺条件有较好的实际应用价值。
3 结论
本研究以牛排菇为原料，利用胰酶进行酶解获得其多肽，在单因素试验的基础上，对酶解工艺进行响应面优化，得到最优条件：反应时间5 h、底物浓度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量10 000 U/g。在最优工艺条件下牛排菇多肽的水解度与理论值接近，该响应面模型准确可靠，具有实际应用价值。本文对牛排菇多肽的深入研究提供了试验基础，后续将进而探究牛排菇多肽的特性和生物活性。
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