万寿菊（Tagetes erecta L.），又名金盏花、臭芙蓉等，是一年生草本植物，属被子植物门、双子叶植物纲、菊目、菊科、万寿菊属，原产于墨西哥及中美洲，在我国各地均有种植。万寿菊中含有多糖、黄酮、挥发油、氨基酸、生物碱、萜类等多种功能成分[1-6]，具有提高免疫力[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]、抑菌[11]、降血脂[12]和抗动脉粥样硬化[13]等功效。万寿菊黄酮（Tagetes erecta L.flavonoids，TEF）是万寿菊中主要的生物活性成分之一，具有较高食用和保健价值，其花中含有的黄酮较多。
目前，常用的黄酮提取方法有热回流法、溶剂法、微波法、超声波法等[14]，这些方法各有利弊。郭耀东等[5]在常压条件下采用超声辅助提取TEF，得到了最佳工艺条件；上述方法大都需要高温或高压或常压，容易导致黄酮被破坏[15-16]。负压技术利用原料在真空负压下产生强烈的空化和机械效应，使其细胞壁在较低温度下破碎，其活性成分不易降解，最大限度地保留其生物活性。超声法一般是在常压下进行，其提取温度通常较高，容易使黄酮结构发生降解和活性降低。为了弥补常压法和黄酮在高温下会降解的不足，本文拟采用负压协同超声波辅助提取TEF，利用Design-Expert 软件设计优化提取条件，通过数学模型获得最佳条件，同时研究其抗氧化活性和抑菌活性，为TEF 的提取、应用和产业化提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
万寿菊：亳州中药材市场；芦丁标准品（≥98%）：北京谱析标准技术有限公司；硫酸亚铁、无水乙醇、氢氧化钠、三氯甲烷、硝酸铝、亚硝酸钠、水杨酸、过氧化氢、四氯化碳、正丁醇、联苯双酯、维生素C（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-bitter hydrazine，DPPH）试剂：武汉卡诺斯科技有限公司。
1.2 仪器与设备
超声波清洗器（KM-300DE）：昆山美美超声仪器有限公司；无油真空泵（VP-1800V）：东莞市盛飞真空设备有限公司；台式高速离心机（TD6M）：绍兴市苏珀仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE500）：上海远怀实业有限公司；紫外可见分光光度计（N6000S）：青岛精诚仪器仪表有限公司；手提式高速万能粉碎机（DFT-50）：上海化科实验器材有限公司；台式真空干燥箱（DZF-6020）：中新医疗仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 万寿菊预处理
将万寿菊清洗干净，置于低温烘箱烘干，再用粉碎机粉碎，过0.18 mm 筛，备用。
1.3.2 TEF 的提取流程
万寿菊粉→按料液比1∶20（g/mL）加入70%乙醇溶液→放入超声波清洗器中，按照负压协同超声波辅助法的条件提取→离心（5 000 r/min，15 min）→浓缩→纯化[17]（AB-8 型大孔树脂）→浓缩→真空干燥→制得TEF。
1.3.3 TEF 得率测定
参照符群等[18]的方法，以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色法测定。TEF 得率（A，%）的计算公式如下。
式中：C 为提取液的质量浓度，mg/mL；V 为提取液的体积，mL；M 为万寿菊样品质量，mg。
1.3.4 TEF 提取单因素试验
以TEF 得率为指标，固定乙醇浓度70%、料液比1∶20（mg/mL）、提取温度50 ℃、负压0.08 MPa、超声波功率400 W、超声时间30 min。分别考察不同负压（0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa）、超声功率（250、300、350、400、450 W）、超声时间（10、20、30、40、50 min）对TEF 得率的影响，每组试验重复3 次。
1.3.5 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，以TEF 得率为响应值，利用Design-Expert 12 软件进行响应面试验设计。试验因素与水平见表1。
表1 试验因素与水平
Table 1 Test factors and levels
水平因素A 负压/MPaB 超声功率/WC 超声时间/min-10.0735020 00.0840030 10.0945040
1.3.6 抗氧化活性的测定
1.3.6.1 DPPH 自由基清除能力测定
根据吴杨洋等[19]的方法进行测定。
1.3.6.2 羟基自由基清除能力测定
根据王迦琦等[20]的方法进行测定。
1.3.7 抑菌活性的测定
根据李晓娇等[21]的方法，利用2 倍稀释法，将TEF用无菌水配成系列梯度浓度的样品液，备用。采用龚祥等[22]的滤纸片法，将圆形滤纸片灭菌后，放在含供试菌的培养皿上，用移液管移取5 μL TEF 样品液滴在滤纸片上，置于生化培养箱中，35 ℃培养24 h，测其抑菌圈直径，加无菌水的滤纸片作对照，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为开始出现抑菌圈时的浓度。
1.3.8 数据处理
各试验均重复3 次取平均值。采用SPSS 软件和Design-Expert 12 软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 负压对TEF 得率的影响
负压对TEF 得率的影响见图1。
图1 负压对TEF 得率的影响
Fig.1 The effect of negative pressure on TEF yield
由图1 可知，随着负压的升高，TEF 得率先升高后下降，在负压为0.08 MPa 时，达到最大值。这是由于负压升高，负压作用于料液产生的空化气泡增多，其空化效应和机械振动作用增强，导致万寿菊细胞壁破裂速度、程度和数量增加，胞内黄酮扩散、溶解增多，得率升高；当负压为0.08 MPa 时，由负压导致的细胞破裂基本完全，黄酮溶出基本彻底，再继续升高负压，提取温度会下降，黄酮的扩散、溶出减小，得率略有下降。因此，负压取0.08 MPa 为宜。
2.1.2 超声功率对TEF 得率的影响
超声功率对TEF 得率的影响见图2。
图2 超声功率对TEF 得率的影响
Fig.2 The effect of ultrasonic power on TEF yield
由图2 可知，随着超声功率的增大，TEF 得率先升高后略有降低，在400 W 时达到最高。这是因为超声功率增大，其空化、机械效应增强，万寿菊细胞的破裂程度、数量增大，得率提高；当超声功率400 W 时，细胞破裂基本完全，黄酮基本溶出完全，再继续增大超声功率，黄酮溶出也不再增加，反而过高的超声功率会破坏部分黄酮结构，降低其得率。因此，超声功率取400 W 为宜。
2.1.3 超声时间对TEF 得率的影响
超声时间对TEF 得率的影响见图3。
图3 超声时间对TEF 得率的影响
Fig.3 The effect of ultrasonic time on TEF yield
由图3 可知，随着超声时间的延长，TEF 得率呈先升高后下降的趋势，并在30 min 时达到最大。这是因为超声时间延长，超声波的空化和机械作用增强，万寿菊细胞壁破裂程度和数量增大，黄酮溶出增多，得率提高；当时间超过30 min 后，过长的超声时间，会使部分黄酮结构破坏，得率下降。因此，超声时间取30 min为宜。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 回归方程的建立
在单因素的基础上，以负压（A）、超声功率（B）和超声时间（C）为3 个影响因素，TEF 得率（Y）为响应值，试验方案与结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface test design and results
试验号因素TEF 得率/%A B C 1-1-103.19 2 1-103.83 3-1103.24 4 1 1 0 4.05-10-13.19 6 1 0-13.94 5-1013.47 8 1 0 1 4.09 7-1-13.37 1001-13.51 110-113.65 120113.67 130005.14 140005.15 150005.16 160005.17 170005.18 9 0
采用Design-Expert 12 软件，对表2 的试验数据进行回归拟合，得到回归方程Y=5.16+0.352 5A+0.053 8B+0.108 8C+0.042 5AB-0.032 5AC-0.030 0BC-0.730 0A2-0.852 5B2-0.757 5C2。
2.2.2 回归模型的方差分析
对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。
表3 回归模型方差分析结果
Table 3 Results of variance analysis of regression model
注：*表示影响显著（P＜0.05）；**表示影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方F 值P 值显著性模型9.7591.08 2 280.48 ＜0.000 1**A0.994 110.994 1 2 092.74 ＜0.000 1**B0.023 110.023 1 48.660.000 2**C0.094 610.094 6 199.18 ＜0.000 1**AB0.007 210.007 2 15.210.005 9**AC0.004 210.004 28.890.020 4*BC0.003 610.003 67.580.028 4*A22.2412.24 4 723.77 ＜0.000 1**B23.0613.06 6 442.16 ＜0.000 1**C22.4212.42 5 086.37 ＜0.000 1**残差0.003 370.000 5失拟项 0.002 330.000 83.100.151 5 不显著纯误差 0.001 040.000 3总和9.7516 R20.999 7 R2Adj0.999 2
由表3 可知，该回归模型的P＜0.01，表明模型极显著；失拟项P=0.151 5＞0.05，不显著，拟合度较好，说明该模型可信度高；另外，模型的决定系数R2=0.999 7，说明模型拟合程度良好。R2Adj=0.999 2，说明该模型能解释99.92%响应值的变化，自变量和响应值间线性关系显著。综上所述，该模型可用于TEF 的提取工艺优化。从显著性结果可知，A、B、C、AB、A2、B2 和C2 项影响极显著（P＜0.01），AC、BC 影响显著（P＜0.05）。根据F 值大小可知，各因素影响顺序为A＞C＞B。
2.2.3 响应面分析
利用Desgin-Expert 12 软件绘制的各因素交互作用的响应面和等高线见图4。
图4 各因素交互作用的响应面与等高线
Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors
由图4 可知，AC 和BC 响应面较弯曲，等高线呈椭圆形，说明AC 和BC 之间的交互作用显著（P＜0.05），AB 的响应曲面更陡峭，曲面更弯曲，说明该交互作用极显著（P＜0.01），这与方差分析结果一致。
2.2.4 最佳条件的预测及验证试验
通过模型的建立，预测最佳工艺条件为负压0.082 MPa、超声功率401.81 W、超声时间30.66 min，理论TEF 得率为5.21%。考虑到实际操作，对最佳工艺条件修正为负压0.08 MPa、超声功率402 W、超声时间30 min，对此条件下建立的模型进行验证试验，重复3 次，得到实际TEF 得率平均值为5.18%，与预测值相对误差0.58%，表明该模型可靠。
2.3 抗氧化活性测定结果
2.3.1 DPPH 自由基清除能力
不同浓度的TEF 对DPPH 自由基的清除能力见图5。
图5 不同浓度的TEF 对DPPH 自由基的清除能力
Fig.5 The scavenging ability of different concentrations of TEF on DPPH free radicals
由图5 可知，随着TEF 和VC 质量浓度的增大，其清除DPPH 自由基的能力均不断增强。当TEF 浓度为250 μg/mL 时，清除率为81.73%，弱于同浓度的VC，说明其在适宜的浓度下，有较强的清除DPPH 自由基能力。
2.3.2 羟基自由基清除能力
不同浓度的TEF 对羟基自由基的清除活性见图6。
图6 不同浓度的TEF 对羟基自由基的清除活性
Fig.6 The scavenging activity of different concentrations of TEF on hydroxyl radicals
由图6 可知，随着TEF 和VC 质量浓度的增大，其羟基自由基清除能力逐渐增强，并呈正相关，当TEF浓度为250 μg/mL 时，羟基自由基清除率为83.28%，比同浓度的VC 略低，表明其在适宜的浓度下，具有较强的羟基自由基清除能力。
2.4 抑菌活性测定结果
不同质量浓度TEF 抑菌活性结果见表4。
表4 不同质量浓度TEF 抑菌活性结果
Table 4 The bacteriostatic activity results of TEF with different mass concentrations
注：—表示无法测定抑菌圈直径（即无抑菌效果）。
质量浓度/（mg/mL）抑菌圈直径/mm大肠杆菌金黄色葡萄球菌8.022.64±0.2821.71±0.27 4.019.13±0.2117.06±0.19 2.015.38±0.2512.91±0.24 1.512.17±0.279.53±0.23 1.09.26±0.21—0.5——对照组——
由表4 可知，TEF 在一定质量浓度下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，而对照组无抑菌圈出现。TEF 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL，且抑菌效果随着TEF 质量浓度的增加不断增强。
3 结论
本试验采用负压协同超声波辅助提取TEF，并经响应面优化提取工艺，得到最佳提取工艺条件为负压0.08 MPa、超声功率402 W、超声时间30 min，在此条件下，TEF 得率为5.18%。TEF 抗氧化活性研究表明，随着TEF 浓度的增加，其对DPPH 自由基和羟基自由基的清除能力逐渐增强，当其浓度为250 μg/mL 时，清除率分别为81.73%和83.28%，表明TEF 抗氧化能力较强，是一种理想的天然抗氧化剂。TEF 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌作用，最低抑菌浓度分别为1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL，且随着TEF 浓度的增加而不断增强。本试验可为TEF 的提取及应用提供理论依据。
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