番石榴叶，为桃金娘科植物番石榴（Psidium guajava Linn.）的叶，具有燥湿健脾，清热解毒之功效。由于其具有良好的降血糖作用，在民间广泛用于降糖治疗[1]。番石榴叶显著的降糖活性，是其食疗产品研发的基础和关键，黄酮类化合物是番石榴提取物降血糖功能的有效成分[2-3]。番石榴苷（槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷）、萹蓄苷（广寄生苷）、瑞诺苷（槲皮素-3-O-β-D-木糖苷）和槲皮素是番石榴叶中主要的4 种黄酮类成分[4-5]，且已被证实是番石榴叶降糖、抑制游离脂肪酸释放的主要活性物质基础[6]，在抗糖尿病方面具有潜力[7]。此外，番石榴叶中的黄酮化合物具有抗氧化、抑菌等生物活性[8-10]，是一种具有发展潜力的食品添加剂，可在食品加工和贮藏中应用[11]。然而目前，鲜见番石榴叶黄酮含量品种差异及积累规律的分析研究。
黄酮的提取方法有溶剂提取、微波辅助提取、超临界辅助萃取、酶浸渍萃取、超声波辅助提取、回流、索氏提取、煎煮法和渗滤等。低共熔溶剂[12]（deep eutectic solvents，DES）是由氢键受体和氢键供体通过氢键交互影响形成的一个新体系，是一种绿色混合溶剂，具有环保无毒、生物相容性好、稳定性强等特点[13]，已应用于野菊花[14]、鸡骨草[15]、葛根[16]、黄芩[17]等植物黄酮成分的提取。以超声波辅助DES 提取可显著提高有效成分的提取率，且可改善现有技术存在的耗时长、操作繁琐或长时间热效应导致有效成分分解氧化等弊端。本研究采用超声波辅助DES 法对番石榴叶进行提取，并分析总黄酮及4 种主要黄酮类成分的品种差异，以期从10 个代表性番石榴品种中筛选出富含总黄酮的品种，探究叶片生长过程中总黄酮类含量最高的时期，为其降糖活性提供理论依据和数据支撑，为天然食疗产品（番石榴茶饮等）的研发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
10 个品种番石榴叶（珍珠、泰国1 号、荷西黄、汕红、新世纪、蒙自红、龙州1 号、红宝石、西瓜、全红）的成熟叶片，采集于广西壮族自治区亚热带作物研究所，颜色深绿，革质，经水果中心陈豪军正高级农艺师鉴定为桃金娘科番石榴属植物番石榴Psidium guajava Linn.的叶片。
芦丁（批号：Y2411Y17051）、番石榴苷（批号：P09J7F8764）、萹蓄苷（批号：P21S10S98394）、瑞诺苷（批号：P25J10S91433）、槲皮素（批号：C01J10Y91727）（≥98%）：上海源叶生物科技有限公司；氯化胆碱[HOC2H4N（CH3）3Cl，ChCl）]、乙二醇[（CH2OH）2，EG]、丙三醇[（CH2OH）2CHOH，GLY]、乳酸[CH3CHOHCOOH，LA]、葡萄糖[CH2OH（CHOH）4CHO，GLU]、丁二醇[（CH2）4（OH）2，BDO]、硝酸铝、亚硝酸钠（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity II XL-30C）：安捷伦科技有限公司；万能高速粉碎机（XL-30C）：济南欧莱博科学仪器有限公司；紫外可见光分光光度计（UV-1800PC）：济南欧威腾生物科技有限公司；电子分析天平（CP214）：奥豪斯仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-5210A）：上海亚荣生化仪器厂；热泵干燥机（L3.5TB1）：广东威而信实业有限公司；恒温鼓风干燥箱（DHG-9070A）：上海精宏实验设备有限公司；数控超声波清洗器（GTSONIC-T20）：广东固特超声股份有限公司；Milli-Q 超纯水仪：美国Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 低共熔溶剂（DES）水溶液的制备
根据文献[18]方法，氯化胆碱使用前放入真空干燥箱中于80 ℃干燥24 h，干燥后与不同的氢键供体以适当的比例混合后放置在圆底烧瓶中，90 ℃恒温水浴锅中加热搅拌，直至形成均一稳定的透明体系。将所得DES 冷却至室温后，密封置于干燥器中以P2O5 干燥2 周以上，按照一定体积分数将目标DES 溶解于去离子水中，充分摇匀、静置，得到一定含水量（0%、25%、40%、55%）的均一透明DES 水溶液。
1.3.2 番石榴叶有效部位提取
1.3.2.1 番石榴叶预处理
将不同品种番石榴叶洗净、去除枝梗、泥沙等杂质后经50 ℃烘箱烘干，粉碎过40 目筛，备用。
1.3.2.2 样品制备
将番石榴叶粉末以适宜的料液比、提取温度、超声功率辅助DES 提取3 次后，合并提取液，真空抽滤，去除残渣收集滤液，4 500 r/min 下离心15 min，取上清液，用于总黄酮含量测定；精确吸取0.1 mL 上清液，用甲醇定容至2.5 mL，经微孔滤膜过滤，取滤液，用于黄酮类成分测定。
1.3.3 NaNO2-Al（NO3）3 比色法测定总黄酮含量
番石榴叶总黄酮含量通过NaNO2-Al（NO3）3 比色法[19]测定，以芦丁为对照品，在505 nm 处测定其吸光度。拟合标准曲线回归方程为Y=3.918 4X+0.004 3（R2=0.998 3）。
1.3.4 HPLC 法测定黄酮类成分含量
1.3.4.1 色谱条件
参照文献[20]方法测定，色谱条件为色谱柱：Agilent eclipse plus C18 柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱（0～15 min，11%～13.5% A；15～30 min，13.5%～18% A；30～40 min，18%A；40～65 min，18%～49%A；65～70 min，49%～11%A）；检测波长：360 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃。
1.3.4.2 对照品溶液的制备
分别取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成番石榴苷、萹蓄苷、瑞诺苷、槲皮素浓度为1 mg/mL 的对照品储备溶液，依次精密吸取各对照品储备溶液200、150、100、50、25、10 μL 于6 个10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得系列混合对照品溶液。
1.3.4.3 精密度试验
按1.3.2.2 制备番石榴叶黄酮样品液，按1.3.4.1 色谱条件测定番石榴苷的含量，连续测定6 次。
1.3.4.4 稳定性试验
按1.3.2.2 制备番石榴叶黄酮样品液，按1.3.4.1 色谱条件分别于15、30、45、60、75、90 min 测定番石榴苷、萹蓄苷、瑞诺苷和槲皮素的含量。
1.3.5 单因素试验
取番石榴叶粗粉2 g，超声功率600 W，提取时间50 min，水浴温度30 ℃，提取3 次，DES 组合中氢键供体和氢键受体的摩尔比为1∶1，含水量为25%，料液比1∶30 （g/mL），测定不同DES 组合ChCl+EG、ChCl+GLY、ChCl+BDO、ChCl+LA、ChCl+GLU 的总黄酮提取率。以最佳DES 组合进行提取，其它条件不变，测定DES 含水率分别为0%、10%、25%、40%、55%时的总黄酮提取率。以最佳DES 组合、最适含水率进行提取，其它条件不变，测定料液比为1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）时总黄酮提取率。
为了探究各单因素变化对番石榴叶总黄酮提取率的影响程度，通过公式计算每个单因素试验结果的均方差，均方差越小，表明影响程度越小。均方差计算公式如下。
式中：R 为均方差；Yi 为每组单因素试验中各水平的提取率，%；Y 为每组单因素试验中各水平提取率的平均值，%；n 为每组单因素试验水平数量。
1.3.6 正交试验优化超声波辅助DES 提取工艺
在单因素试验基础上进行正交试验，采用L9（33）正交设计，确定超声波辅助EDS 提取番石榴叶总黄酮的最佳工艺参数，正交试验设计见表1。
表1 正交试验设计
Table 1 The design of orthogonal test
水平A DES 组成B DES 含水率/% C 料液比/（g/mL）1ChCl+EG10%1∶20 2ChCl+BDO25%1∶25 3ChCl+GLY40%1∶30
1.3.7 不同品种番石榴叶总黄酮含量测定
采用优化后的超声波辅助DES 提取法分别提取10 个品种番石榴老叶中的黄酮类物质，测定其中总黄酮和黄酮类成分含量。
1.4 统计学方法
采用Excel 2016 进行处理，采用GraphPad Prism 7.0 软件作图。数据以平均值±标准差表示，应用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，p＜0.05 示为差异有统计学意义，以不同英文字母表示。
2 结果与分析
2.1 黄酮类成分HPLC 线性关系考察
混合对照品的HPLC 图谱如图1 所示，线性关系如表2 所示。
图1 混合对照品的HPLC 图谱
Fig.1 HPLC of reference substances
表2 4 种黄酮类成分线性关系考察
Table 2 Linearity of four kinds of flavonoids
对照品回归方程相关系数 线性范围/（mg/L）番石榴苷Y=7.345X+0.0520.9990.330～10.530萹蓄苷Y=7.613X+0.0750.9990.324～10.940瑞诺苷Y=7.008X+0.0970.9990.334～10.190槲皮素Y=11.599X-0.3440.9990.366～10.480
如图1 所示，4 种黄酮类成分在该HPLC 方法中分离度良好，互相无干扰。由表2 可知，各化合物在相应范围内线性关系良好。
2.2 精密度与稳定性试验
本研究建立的HPLC 法精密度为1.21%，精密度符合测定黄酮类成分含量的要求。稳定性试验结果见表3，在90 min 内样品中黄酮类成分基本不变，稳定性良好，符合试验要求。
表3 样品黄酮类成分稳定性试验
Table 3 Stability test of flavonoid constitutes in sample
成分放置时间/minRSD/%153045607590番石榴苷 6.136.126.116.086.106.091.71萹蓄苷6.356.346.326.346.326.291.97瑞诺苷3.123.123.113.123.083.091.60槲皮素0.890.910.880.860.860.881.73
2.3 单因素试验
2.3.1 DES 组成对番石榴叶总黄酮提取率的影响
低共熔溶剂具有极性可调谐性、黏度可调谐性、增溶性等特性，直接影响目标化合物的提取效率。不同DES 组成对番石榴叶总黄酮提取率的影响如图2 所示。
图2 不同DES 组成条件下总黄酮提取率
Fig.2 Extraction rate of total flavonoids under different DES solvent
如图2 所示，在含水率为25%的条件下，不同组成的DES 对总黄酮的提取率为5.58%～15.16%，总黄酮提取率最高的DES 为ChCl+EG，其余依次为ChCl+BDO、ChCl+GLY、ChCl+GLU、ChCl+LA。由于DES 主要通过与目标物形成分子间氢键和静电作用而增加其溶解度[15]，5 种DES 的氢键供体中，乙二醇、丙三醇、丁二醇、葡萄糖均含有大量的羟基，乳酸含有大量的羧基，均能与黄酮类化合物形成分子间氢键[21-23]。黄酮化合物具有多个苯环结构，形成了π-π 大共轭体系，具有很高的电子云密度，而DES 中乳酸的羧基C O 键的电负性强，也具有较高的电子云密度，二者接近时，会因电子云相互排斥而导致氢键不稳定，因此含羧基的DES（ChCl+LA）对总黄酮的提取效果最差。
2.3.2 DES 含水率对番石榴叶总黄酮提取率的影响
少量水的加入能降低DES 的黏度且增加其极性，但过量的水反而会破坏DES 因氢键构建的超分子结构，同时降低DES 与目标组分间的相互作用[23]。本研究对含水量的考察结果如图3 所示。
图3 不同DES 含水率条件下总黄酮提取率
Fig.3 Extraction rate of total flavonoids under different moisture content of DES
由图3 可知，DES（ChCl+EG）的含水率由0%上升到55%的过程中，总黄酮提取率呈现先增加后降低的趋势，并在含水率为25%时达到最大值，提取率为15.17%。
2.3.3 料液比对番石榴叶总黄酮提取率的影响
不同料液比条件下总黄酮提取率如图4 所示。
图4 不同料液比条件下总黄酮提取率
Fig.4 Extraction rate of total flavonoids under different solidliquid ratio conditions
如图4 所示，料液比为1∶10～1∶30（g/mL）时，总黄酮提取率随DES 溶剂量的增加而稳定上升，为5.60%～11.61%；料液比从1∶30（g/mL）变化到1∶50（g/mL）时，提取率变化趋于平缓，提取率仅相差0.54%。从成本、环保等方面考量，初步确定1∶30（g/mL）为最佳提取料液比。
2.4 正交试验
正交试验结果如表4 所示。
表4 超声波辅助DES 提取正交试验结果
Table 4 Ultrasonic assisted extraction with DES orthogonal test results
总黄酮提取率/%11（ChCl+EG） 1（10%）1（1∶20）6.16±1.06 21（ChCl+EG） 2（25%）2（1∶25）13.96±1.97 31（ChCl+EG） 3（40%）3（1∶30）10.04±0.55 42（ChCl+BDO） 1（10%）3（1∶30）5.41±0.44 52（ChCl+BDO） 2（25%）1（1∶20）9.63±0.86 62（ChCl+BDO） 3（40%）2（1∶25）7.02±1.36 73（ChCl+GLY） 1（10%）2（1∶25）4.30±0.59 83（ChCl+GLY） 2（25%）3（1∶30）10.17±1.41 93（ChCl+GLY） 3（40%）1（1∶20）5.27±0.26 K130.1615.8721.06 K222.0633.7625.28 K319.7422.4325.62 k110.055.297.02 k27.3511.258.43 k36.587.478.54极差R3.475.961.52因素主次B＞A＞C最优条件A1B2C3序号A DES 组成B DES含水率/%C 料液比/（g/mL）
由表4 可知，3 个因素对总黄酮得率影响程度为DES 含水率＞DES 组成＞料液比，超声辅助DES 提取最优工艺为A1B2C3，即DES 组成为ChCl+EG，含水率为25%，料液比为1∶30（g/mL）。而此条件与最高提取率13.96%所对应的提取条件A1B2C2 不一致，即DES 组成为ChCl+EG，含水率为25%，料液比为1∶25，因此需对这两种条件进行验证。
验证试验结果如表5 所示。
表5 验证试验结果
Table 5 Verification test results
试验号最佳提取条件提取率/%1 A1B2C314.95±1.54 2 A1B2C213.06±1.22
如表5 所示，在A1B2C3 和A1B2C2 两种提取条件下，番石榴叶总黄酮提取率较高的提取条件为A1B2C3，即DES 组成为ChCl+EG，含水率为25%，料液比为1∶30（g/mL），此条件下总黄酮平均提取率为14.95%，高于以往研究中利用回流或超声辅助提取法的提取率（0.497%～5%）[10，24-25]，与蒋利荣等[26]利用超声辅助DES 提取法达到的提取率（15.97%～22.06%）相当。这是由于形成DES 时两种组分之间的协同效应促使DES 对物质的溶解能力增强，无论是极性或非极性的化合物，DES 均具有增溶作用。槲皮素、芦丁、DNA、淀粉等在DES 中的溶解度是在水中的18～460 000 倍，而在水中溶解性较差的苯甲酸、灰黄霉素等药物在DES中的溶解度是在水中的5～22 000 倍[27]。此外，超声波所具有的空化效应能促使溶剂更大程度地渗入细胞中，不断刺激胞内腺体，增加传质速率[28]；同时利用它的机械效应和化学效应等使细胞壁破裂而加速植物中有效成分的扩散和释放，能有效避免热敏性物质在高温环境下被破坏[29]。
2.5 不同品种番石榴叶总黄酮含量及其聚类分析
黄酮是植物体重要的次生代谢产物，其合成、分布受基因等遗传因素和外界环境因素的共同调控。不同品种番石榴叶总黄酮含量如图5 所示，总黄酮含量聚类分析如图6 所示。
图5 不同品种番石榴叶总黄酮含量
Fig.5 Contents of total flavonoids in Guava leaves of different cultivars
不同字母表示各组间差异显著，p＜0.05。
图6 不同品种番石榴叶总黄酮含量聚类分析
Fig.6 Cluster analysis of total flavonoids content in Guava leaves of different cultivars
如图5 所示，不同品种番石榴材料老叶中总黄酮含量差异明显。‘全红’总黄酮含量显著高于其它品种，达到226.62 mg/g；‘红宝石’总黄酮含量最低，为45.12 mg/g；其余8 个品种总黄酮含量为67.48～183.56 mg/g。在欧氏距离为10 时进行组间平均聚类分析（图6），不同番石榴叶材料总黄酮含量可分为3 组，代表3 个不同的含量水平，结合图5 中不同品种番石榴叶总黄酮含量测定结果，将含量水平分成低、中、高，其中低含量的品种包括‘蒙自红’、‘汕红’、‘新世纪’和‘红宝石’，中含量材料包括‘珍珠’、‘龙州1 号’、‘西瓜’、‘荷西黄’和‘泰国1 号’；高含量品种为‘全红’。
2.6 番石榴嫩芽、嫩叶、老叶中总黄酮含量分布情况
选取总黄酮高、中、低含量水平的番石榴品种‘全红’、‘珍珠’以及‘新世纪’，其嫩芽、嫩叶和老叶中总黄酮含量差异如图7 所示。
图7 番石榴嫩芽、嫩叶、老叶总黄酮含量
Fig.7 Content of total flavonoids in tender buds，tender leaves and old leaves of Guava
‘全红’各部位总黄酮含量为95.96～212.61 mg/g，‘珍珠’为66.69～174.98 mg/g，‘新世纪’为25.70～76.58 mg/g；3 个品种番石榴叶总黄酮含量的分布情况为嫩芽＜嫩叶＜老叶，且从嫩芽到嫩叶期，总黄酮含量增长迅猛，从嫩叶到老叶，增长趋于平缓。这是因为黄酮类化合物作为植物体内一大次生代谢产物，能抵御一定恶劣的生态环境以及动物和微生物等带来的伤害[30]，番石榴植株在嫩芽时期最为娇嫩脆弱，为避免恶劣环境如强光照、病虫害等对植株生长过程的不利影响，会增加其次生代谢物的合成量[31]，因此在嫩芽到嫩叶的生长阶段，黄酮类物质大量分泌释放，随着番石榴叶的生长过程而不断累积，在老叶期含量达到峰值。
2.7 不同品种番石榴叶黄酮类成分含量
目前针对番石榴品种差异，相关研究者进行了番石榴种质资源亲缘关系研究[32]、不同品种番石榴果实的酚类物质、糖酸组分及其抗氧化活性分析[33-34]以及果实耐藏性和采后品质变化比较[35]，但未对番石榴叶片中有效成分品种差异进行分析。不同品种番石榴叶样品HPLC 图谱见图8。
图8 不同品种番石榴叶样品HPLC 图谱
Fig.8 HPLC of Guava leaves of different cultivars
A.全红；B.西瓜；C.珍珠；D.龙州1 号；E.荷西黄；F.泰国1 号；G.新世纪；H.蒙自红；I.汕红；J.红宝石。
不同品种番石榴叶中黄酮类成分含量如表6 所示。
表6 不同品种番石榴叶中黄酮类成分含量（n=3）
Table 6 Flavonoids content in Guava leaves of different cultivars（n=3） mg/L
注：同列不同字母表示各组间差异显著，p＜0.05。
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如图8 所示，不同品种番石榴叶中4 种黄酮类成分含量差异明显。由表6 所知，所研究的10 个番石榴品种中，主要的黄酮类成分为番石榴苷和萹蓄苷，含量高于瑞诺苷和槲皮素；4 种黄酮类成分总含量最低的品种为‘西瓜’（6.70 mg/L）；黄酮类成分总含量最高的品种为‘全红’（21.03 mg/L），其中番石榴苷、萹蓄苷、瑞诺苷的含量分别为7.25、7.94、3.96 mg/L，均显著高于其余9 个品种（p＜0.05）。槲皮素含量最高的品种为‘红宝石’（2.32 mg/L）。
3 结论
黄酮类化合物是番石榴叶的主要有效成分，其含量差异将直接影响产品的应用功效。本研究采用超声辅助DES 法提取番石榴叶总黄酮，并对不同品种总黄酮含量进行对比研究。通过单因素试验表明3 个考察因素对总黄酮得率影响程度为DES 含水率＞DES 组成＞料液比。在单因素试验基础上，通过正交试验优化，得到最优工艺：以ChCl+EG 组成的DES 为提取溶剂，DES 含水率为25%，料液比为1∶30（g/mL），此条件下总黄酮平均提取率为14.95%。总黄酮含量最高的番石榴品种为‘全红’，在老叶期达到顶峰；且‘全红’中4种主要的黄酮类成分番石榴苷、萹蓄苷、瑞诺苷和槲皮素总含量最高。综合总黄酮和4 种主要的黄酮类单体成分含量结果，表明‘全红’老叶是最适于番石榴叶保健产品开发的原料，为其加工选材提供科学依据。
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