猪肉是人们蛋白质摄入的重要来源之一，而猪肉糜作为肉丸、肉馅、肉肠等众多肉制品的主要原料，其独特的风味和口感备受消费者喜爱[1]。随着猪肉糜市场的逐年扩大，肉糜掺杂的情况时有发生，掺杂肉样难以辨别，一些廉价肉会被混入其中[2]。为了维护消费者的健康和利益，需采取一系列方法对猪肉糜掺杂进行鉴定。目前常见的肉类掺杂检测技术有光谱分析[3]、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术[4]、色谱分析、酶联免疫分析等[5]。其中，光谱分析检测成本较高；PCR 技术会产生假阳性、假阴性等问题；酶联免疫分析不适用于加工过的肉制品，应用范围较窄。色谱技术检测限低，定量准确，应用范围也更广泛。目前色谱分析主要是通过对肉类氨基酸、蛋白质、肽类等成分的分析而鉴定其种类，但蛋白质受热变性会对试验结果产生影响[6]。研究表明因每种肉类的脂肪酸组成和含量不同，可依据不同肉类的特征脂肪酸进行掺杂鉴定[7]。
气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9]、薄层色谱法[10]是常见的脂肪酸组分分析方法。分析猪肉脂肪酸的组成一般利用气相色谱法，该方法分离度好、灵敏度高且分析时长短[11]，但由于脂肪酸在进行气相分析时是在高温下进行的，脂肪酸在高温下容易产生脱酸、裂解等副反应，会对分析结果产生影响，所以在进行色谱分析前，通常要将脂肪酸进行甲酯化，转化成脂肪酸甲酯或丁酯。适宜的甲酯化方法不但可以准确鉴定出猪肉的脂肪酸种类，还能够提高试验的效率。吴妹英等[12]利用碱法甲酯化法处理莆田黑猪肉的脂肪，并通过气相色谱法分析出其中饱和脂肪酸的质量分数占总脂肪酸的42.01%。李丹丹等[13]选择碱法甲酯化处理提取的发酵藏猪肉脂肪，采用气相色谱法测定出猪肉样品中含有36 种脂肪酸。李贵林等[14]选择氢氧化钾甲醇溶液进行甲酯化，通过气相色谱法分离出甘孜州藏猪肌肉中主要的8 种脂肪酸，并认为该法有较好的精密度、重复性、可靠性。胡广英等[15]采用氢氧化钾甲醇溶液对猪肉脂肪进行甲酯化，并利用气相色谱法测定出样品猪肉中21 种脂肪酸。前期在对猪肉样品进行碱法甲酯化的试验过程中发现，碱法甲酯化的酯化温度、酯化时间、酯化剂的添加量都对脂肪酸的检测结果有不同的程度的影响，甲酯化的反应是可逆的，添加适量的酯化剂才能保证反应正向进行，得到最优的条件。本研究对甲酯化方法进行优化，为下一步的气相色谱分析提供有利条件。这不仅有利于检测出更多种类的脂肪酸，还能够使油酸含量检测的更准确。本文参考王彦平等[16]的方法并稍加改动，选择猪的前、后腿肉，并在样品中加入氢氧化钾甲醇作为酯化剂，同时加入正己烷，采用超声处理代替原方法中涡旋混匀，以期有效提高检测结果的精确度。以猪肉中脂肪酸含量最多的油酸为测定指标，对比在不同碱法甲酯化条件下的油酸含量，得出最佳的甲酯化条件，为准确测量猪肉中脂肪酸的种类与含量提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪前腿、后腿肉：市售。37 种标准脂肪酸：美国Sigma-Aldrich 公司；甲醇、氢氧化钾、正己烷、氯化钠（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司。
1.2 仪器与设备
GC 7900 气相色谱仪：上海天美仪器有限公司；500A 中草药粉碎机：泰斯特仪器有限公司；H-511 电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；KQ-500 DE 数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；202 电热干燥箱：余姚市东方电工仪器厂；TG16-WS 台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 猪肉脂肪酸提取以及甲酯化
将猪前腿、后腿肉部位样品于箒20 ℃冰箱中冻藏，进行样品前处理。各取不同批次猪的前腿、后腿肉各100 g，切成薄片于60 ℃烘箱中，烘干至恒重，用粉碎机将烘干肉样混合粉碎，向1 g 猪肉样品粉末中加入5 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH 和10 mL 正己烷，70 ℃条件下，水浴回流20 min，冷却后加入15 mL 蒸馏水进行超声波处理，250 W 超声5 min，结束后以3 000 r/min离心10 min。离心后取上层经无水硫酸钠干燥后进行气相色谱分析。
1.3.2 气相色谱条件
色谱柱：选用DB-FastFAM 色谱柱（固定相为氰丙基），进样量1 μL，初始温度140 ℃，持续5 min，以5 ℃/min 升至220 ℃，保持15 min。
1.3.3 油酸含量的计算
油酸含量计算方法选择面积归一化法，测定方法参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》[17]。
1.3.4 猪肉脂肪酸碱法甲酯化单因素试验
以油酸含量为指标，研究甲酯化温度（50、60、70、80、90 ℃）；甲酯化时间（10、15、20、25、30 min）；酯化剂添加量（3、5、7、9、11 mL）对猪肉中油酸含量的影响。
1.3.5 响应面法优化碱法甲酯化条件
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 试验原理设计3 因素3 水平响应面试验，对甲酯化的条件进行分析与优化，试验因素以及水平如表1。
表1 响应面因素及水平
Table 1 Response surface factors and levels
?
1.4 数据分析
所得数据均进行3 次重复试验取平均值，借助SPSS 13.0 数据分析软件对数据进行单因素方差分析和显著分析，利用Design-Expert 8.0.6.1 软件进行响应面试验设计与分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 甲酯化温度对油酸含量的影响
甲酯化温度对油酸含量的影响见图1。
图1 甲酯化温度对油酸含量的影响
Fig.1 Effect of methyl esterification temperature on oleic acid content
如图1 所示，不同甲酯化温度对油酸含量有一定影响，随着反应温度的升高，油酸含量先升高后降低，70 ℃时油酸含量最高，这是由于温度升高会增加分子的运动速率，从而提高转化率，油酸含量增加。温度低于70 ℃时，甲酯化反应不充分，油酸含量少，但甲酯化温度过高时，甲醇容易发生汽化，会降低自身浓度，也可能会产生脂肪发生异构化，使得反应速率变慢，影响油酸的含量。此结果与李朝阳[18]研究结果相似。因此，选择价值化温度60、70、80 ℃进行后续响应面优化试验。
2.1.2 甲酯化时间对油酸含量的影响
甲酯化时间对油酸含量的影响见图2。
图2 甲酯化时间对油酸含量的影响
Fig.2 Effect of methyl esterification time on oleic acid content
如图2 所示，在10 min 到30 min 的反应过程中，油酸含量逐渐升高后降低，这是由于反应时长延长，甲酯化向正方向进行，油酸含量随着反应时间延长而增加，20 min 时可达到油酸含量的最大值。反应在10～20 min时呈上升趋势，在此期间甲酯化反应不充分，油酸含量较低。当反应时间超过20 min 之后，由于反应时间的延长，脂肪氧化分解，导致脂肪酸含量有所损失，油酸含量逐渐下降。此研究结果与李朝阳等[19]研究结果类似。因此，选择甲酯化时间15、20、25 min 进行后续响应面优化试验。
2.1.3 酯化剂添加量对油酸含量的影响
酯化剂添加量对油酸含量的影响见图3。
图3 酯化剂添加量对油酸含量的影响
Fig.3 Effect of addition amount of esterifying agent on oleic acid content
如图3 所示，酯化剂添加量较少时，油酸含量较低，这主要是由于酯化剂作为一种催化剂，当溶液中添加量较少时，达不到催化的最大作用。随着酯化剂添加量的增大，脂肪酸甲酯转化率逐渐增加，油酸含量逐渐增大，在酯化剂添加量为3～7 mL，酯化剂添加量与油酸含量成正相关。但随着酯化剂添加量的增加，油酸含量降低，分析是由于甲酯化向正向进行，加速了皂化反应等副反应的发生[20]。因此油酸含量不会一直升高，当酯化剂添加量达到7 mL 后，转化率逐渐平稳，油酸含量缓慢下降。因此，选择酯化剂添加量5、7、9 mL 进行后续响应面优化试验。
2.2 响应面试验结果与分析
响应面设计及结果见表2。
表2 Box-Behnken 碱法甲酯化测定猪肉脂肪酸响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface design and results of Box-Behnken alkali-catalyzed methyl esterification for determination of pork fatty acids
序号ABC油酸含量/%1-10139.50 2 1 0-139.64 3-1-1038.71 4 0 0 0 47.21 5 0 0 0 47.36 6-11040.28 7 1-1039.07 8 1 1 0 36.68 48.02 1001-139.65 1101139.28 9 0 0 0 1200047.16 130-1140.28 140-1-141.16 1510137.50 1600047.74 17-10-140.28
采用Design-expert 软件对数据进行拟合，得到的油酸含量二次多元回归模型公式为油酸含量=47.5-0.72A-0.4B-0.52C-0.97AB-0.34AC+0.13BC-4.83A2-3.96B2-3.44C2。
2.2.1 方差分析
回归方程系数及显著性检验见表3。
表3 回归方程系数及显著性检验
Table 3 Regression equation coefficients and significance test
注：*表示影响显著，P＜0.05；**表示影响极显著，P＜0.01。
?
由表3 可知，F=146.73、P＜0.01，本试验中的响应面回归模型极其显著，具有统计学意义。模型的失拟项F=1.9、P=0.270 7＞0.05，说明非正常误差的比例较小影响不显著，因此该模型项是显著的。该回归模型的相关系数R2=0.994 7，证明该模型能解释99.47%的试验数据，具有良好拟合度；方程决定系数R2Adj=0.987 9，也表明模型具有较高显著性，试验值与预测值之间具有良好一致性。CV=1.04%＜10%，表明该试验结果精确度较高；该模型Adeq Precision 的值为32.571，具有较高的精密度，说明该模型可预测。同时表明对猪肉脂肪酸中油酸含量拟合的回归方程与上述检验原则相符，具有良好的适应性。对油酸含量的影响效果表明：A、B、C 3 个因素对猪肉脂肪酸中的油酸含量的影响显著（P＜0.05），AB、A2、B2、C2 对猪肉脂肪酸中的油酸含量影响极显著（P＜0.01），而其他因素的影响则不显著。各因素对油酸含量影响的大小顺序为A（甲酯化时间）>C（酯化剂添加量）>B（甲酯化温度）。交互作用为AB>AC>BC。
2.2.2 响应面各因素交互作用分析及验证试验
甲酯化时间、甲酯化温度和酯化剂添加量交互作用如图4～图6。
图4 甲酯化时间与甲酯化温度对油酸含量的影响
Fig.4 Effects of methyl esterification time and temperature on oleic acid content
图5 甲酯化时间与酯化剂添加量对油酸含量的影响
Fig.5 Effects of methyl esterification time and addition amount of esterifying agent on oleic acid content
图6 甲酯化温度与酯化剂添加量对油酸含量的影响
Fig.6 Effects of methyl esterification temperature and addition amount of esterifying agent on oleic acid content
曲线梯度反应各因素对油酸含量的影响程度，响应面越弯曲则表示此因素对油酸影响越大[21]。由图4～图6 可知，3 个响应面均为开口向下的曲线，即响应值（油酸含量）存在极大值。
确定模型优化得到甲酯化反应的最佳条件：甲酯化时间19.65 min、甲酯化温度69.58 min、酯化剂添加量6.85 mL。考虑试验实际操作的可行性，按照调整后的试验条件进行，即甲酯化时间19.6 min、甲酯化温度69.5 min、酯化剂添加量6.8 mL，在相同条件下重复进行3 次试验，得到油酸含量为46.74%，与得出的预测值47.56%相差0.82%，相差较小，两者吻合性较好，说明该模型能较好反应实验的结果。此反应条件下不仅甲酯化效率高，而且试验反应快速、简单。
2.3 猪肉脂肪酸的组成成分分析
2.3.1 脂肪酸标准品的气相色谱分析结果
脂肪酸标准品的气相色谱图见图7，37 种脂肪酸出峰序号及名称见表4。
图7 37 种脂肪酸标准气相色谱图
Fig.7 Standard gas chromatogram of 37 fatty acids
表4 37 种脂肪酸出峰序号及名称
Table 4 Eluotropic sequence and names of 37 fatty acids
序号结构脂肪酸名称序号结构1C4∶0丁酸14C17∶0 2C6∶0己酸15C17∶1 3C8∶0辛酸16C18∶0 4C10∶0癸酸17C18∶1 5C11∶0十一烷酸18C18∶1T 6C12∶0月桂酸19C18∶2 7C13∶0十三烷酸20C18∶2TT 8C14∶0肉豆蔻酸21C18∶3 9C14∶1肉豆蔻烯酸22C18∶3 10C15∶0十五烷酸23C20∶0 11C15∶1顺-10-十五烯酸24C20∶1 12C16∶0棕榈酸25C21∶0 13C16∶1棕榈油酸26C20∶2脂肪酸名称十七烷酸顺-10-十七烯酸硬脂酸油酸反油酸亚油酸反亚油酸γ-亚油酸α-亚油酸花生酸顺-11-二十烯酸二十一碳酸顺-11，14-二十二碳二烯酸序号 结构脂肪酸名称27C22∶0山嵛酸28C22∶1芥酸29C20∶3顺-8，11，14-二十碳三烯酸30C20∶3 顺-11，14，17-二十碳三烯酸31C20∶4花生四烯酸32C23∶0二十三酸33C22∶2顺-13，16-二十碳二烯酸34C24∶0二十四酸35C20∶5顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸36C24∶1神经酸37C22∶6 顺-4，7，10，13，16，19-二十碳六烯酸
由表4 可知，37 种脂肪酸的各组分分离程度较好，被实验选用的气相色谱条件以及标准品适合分析猪肉脂肪酸的组成成分。
2.3.2 甲酯化方法优化前猪肉脂肪酸组成成分的测定
甲酯化方法优化前猪肉脂肪酸的气相色谱图见图8，其猪肉脂肪酸出峰序号及名称见表5。
图8 甲酯化方法优化前猪肉脂肪酸的气相色谱图
Fig.8 Gas chromatogram of pork fatty acids before process optimization for methyl esterification
表5 甲酯化方法优化前猪肉脂肪酸出峰序号及名称
Table 5 Eluotropic sequence and name of pork fatty acids before process optimization for methyl esterification
峰序脂肪酸名称碳数及不饱和数时间/min 峰面积 相对含量/%1月桂酸C12∶09.833520.340 2棕榈酸C16∶013.747 2 264 14.800 3棕榈油酸C16∶114.3931250.820 4反油酸C18∶1T18.0861871 12.230保留5顺-11，14，17-C20∶323.187740.480二十碳三烯酸6二十三酸C23∶023.5487434.860 7 顺-4，7，10，13，16，19- C22∶628.0271210.790二十碳六烯酸
由表5 可知，在甲酯化方法未优化时，猪肉样品中共检测出7 种脂肪酸，主要以棕榈酸（含量为14.800%）、反油酸（含量为12.230%）、二十三酸（含量为4.860%）为主，其他组分相对含量较低。这与王毅等[22]测定猪肉脂肪酸组成的试验结果（棕榈酸19.02%，硬脂酸17.90%，油酸33.21%）相比，棕榈酸含量相差不大，但其他种类脂肪酸含量有明显差距。
2.3.3 甲酯化方法优化后猪肉脂肪酸组成成分的测定
甲酯化方法优化后猪肉脂肪酸的气相色谱图见图9，其猪肉脂肪酸出峰序号及名称见表6。
图9 甲酯化方法优化后猪肉脂肪酸的气相色谱图
Fig.9 Gas chromatogram of pork fatty acids after process optimization for methyl esterification
表6 甲酯化方法优化后猪肉脂肪酸出峰序号及名称
Table 6 Eluotropic sequence and name of pork fatty acids after process optimization for methyl esterification
峰序脂肪酸名称碳数及不饱和数时间/min 峰面积 相对含量/%1月桂酸C12∶09.626 3 597 1.645 2十三烷酸C13∶010.472924 0.422 3肉豆蔻酸C14∶010.633322 0.148 4肉豆蔻烯酸C14∶111.536637 0.291 5十五烷酸C15∶012.576482 0.220 6棕榈酸C16∶013.586 49 030 22.433 7棕榈油酸C16∶114.176 6 517 2.982 8十七烷酸C17∶015.418 1 256 0.576 9硬脂酸C18∶017.383 33 027 15.111 10油酸C18∶117.975 103 582 47.395 11反油酸C18∶1T 18.127828 0.378 12亚油酸C18∶218.359922 0.422 13反亚油酸C18∶2TT 18.853 8 831 4.040 14花生酸C20∶020.033542 0.249 15二十碳二烯酸C20∶221.349199 0.091 16 顺8，11，14 二十碳三烯酸 C20∶322.911573 0.262 17花生四烯酸C20∶423.289 2 303 1.054保留
由表6 知，试验测得猪肉中共含有17 种脂肪酸，主要以油酸（47.395%）、棕榈酸（22.433%）、硬脂酸（15.111%）、反亚油酸（4.040%）、棕榈油酸（2.982%）、月桂酸（1.645%）为主，其他组分含量相对较低。
与未优化甲酯化方法测定猪肉脂肪酸的试验结果对比可以发现，可检测出的猪肉脂肪酸种类由7 种增加至17 种，月桂酸、棕榈酸、棕榈油酸所被检测出的含量明显提高，同时试验结果证实了油酸是猪肉中主要的脂肪酸，含量为47.395%。
通过对王彦平等[16]所采用的甲酯化方法的改进，本试验检测出的脂肪酸种类较丰富，与方晨等[23]采用气相色谱法检测分析猪肉中的15 种脂肪酸相比有所增多。并且优化后的甲酯化方法所检测出的油酸和棕榈油酸含量相较于李莹莹等[24]测定猪肉脂肪酸含量中棕榈油酸（1.629%）、油酸（39.208%）有显著提高。席斌等[25]和Joo 等[26]测定的猪肉中不包含反油酸，这可能与色谱柱的分离能力不同有关。此外，猪肉不同品种以及不同部位，其脂肪酸的组成和含量也有所差异[27]。黄业传等[28]发现荣昌猪肉中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸在不同部位间有显著差异。猪肉中以油酸、棕榈油酸和亚油酸为代表的不饱和脂肪酸，具有降血糖、调节免疫力、调节脂类代谢等功效[29]。适当摄入以月桂酸、棕榈酸和硬脂酸为代表的饱和脂肪酸能增加胆固醇和中性脂肪，为人体提供能量[23]。因此，探究合适的脂肪酸提取条件对脂肪酸功能研究同样具有意义。
3 结论
试验以油酸含量为指标，采取单因素试验并结合响应面法优化猪肉碱法甲酯化工艺中的甲酯化时间、甲酯化温度和酯化剂添加量3 个因素。结果表明：碱法甲酯化的最佳工艺参数为甲酯化时间19.6 min、甲酯化温度69.5 ℃、酯化剂添加量6.8 mL，在此条件下得到油酸含量为46.74%。通过气相色谱仪对猪肉的脂肪酸组成成分以及含量进行分析，结果表明猪肉中含有17 种脂肪酸。
本研究对传统的甲酯化工艺进行优化，确定一种新的甲酯化工艺参数，该工艺条件下能够检测出更多种类的脂肪酸，气相色谱图的出峰效果也有明显改善，可为猪肉类产品中脂肪酸种类和含量的测定以及后续通过特征脂肪酸种类和含量进行肉糜掺杂鉴定提供参考。
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