冷冻作为一种最常用的长期保存鱼糜的方法，可以抑制微生物的生长，降低酶的活性。但在冻藏过程中其肌原纤维蛋白质不可避免地发生冷冻变性，从而对鱼糜品质产生负面影响，影响其后续加工性能，造成资源浪费和经济损失[1-3]。目前添加抗冻剂是防止冻藏鱼糜品质下降的主要方法，工业上常用的商业抗冻剂为4%蔗糖与4%山梨醇的混合液[4-5]。但由于传统商业抗冻剂高甜高热量的特点与如今消费者追求健康低热量的消费趋势不符[6-7]，因此，探寻低热量、低甜度的糖类（菊粉、壳寡糖、甲壳素水解物、魔芋葡甘聚糖降解物、卡拉胶寡糖等）、酚类和蛋白水解物（抗冻蛋白/肽）等新型抗冻剂，并研究其抗冻效果已成为国内外的研究热点[3，7-10]。
糖类通过改变内部结合水的状态和性质间接地发挥抗冻作用，其作用大小与羟基配位有关[11]，甲壳素纳米晶体（chitin nanocrystals，ChNCs）是一种从水产品加工副产物甲壳素中剥离出来的纳米尺寸晶体，具有高比表面积、高结晶度和良好的稳定性等优良特性，可作为新型膳食纤维、食品稳定剂和生物保鲜剂等应用在食品领域中[12]。同时，ChNCs 结构中的羟基、氨基和羧基基团容易与肌原纤维蛋白中的极性残基基团形成氢键或离子键，可以提高冻藏鱼糜的持水能力，延缓冻藏鱼糜凝胶强度下降的趋势，延缓肌原纤维蛋白氧化等，其优势可使其作为一种潜在的冷冻食品抗冻剂，但关于将ChNCs 应用于水产品抗冻剂的研究鲜有报道。
本研究利用ChNCs 拥有的独特结构与性质，以带鱼肌原纤维蛋白和ChNCs 为研究对象，将ChNCs 加入带鱼鱼糜中冷冻保藏，探究ChNCs 对鱼肌原纤维蛋白冻藏稳定性的影响，以期为冷冻鱼糜的低热量抗冻剂的开发与应用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
带鱼、蔗糖、山梨醇：市售；蛋白定量测定试剂盒（分光光度法）、总巯基（-SH）测试盒（分光光度法）、分型巯基（-SH）测试盒（分光光度法）：南京建成生物工程研究所；甲壳素、2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物、亚氯酸钠、次氯酸钠、氯化钠、氯化钾（均为分析纯）、Tris-HCL 缓冲液（1 mol/L）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
组织捣碎机（JJ-2BX）：方科仪器（常州）有限公司；恒温水浴锅（HH-1）：常州金坛良友仪器有限公司；精密色差仪（CS-200）：杭州彩谱科技有限公司；均质机（T25）：艾卡（广州）设备仪器有限公司；离心机（H2-16KR）：湖南可成仪器设备有限公司；精密pH 仪（G13505）：美国赛默飞世尔科技公司；流变仪（MCR301）：奥地利安东帕有限公司；质构仪（TA XT plus）：英国Stable Micro System 公司；紫外分光光度计（UV-1780）：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 甲壳素纳米晶体的制备
参照Wu 等[13]的方法制备甲壳素纳米晶体（ChNCs）。
1.3.2 带鱼鱼糜的制备
新鲜带鱼经前处理后选取去骨去皮肉块，用清水漂洗3～4 次，再用0.15%盐水漂洗，并用吸水纸吸去多余水分，斩碎后获得鱼糜。将带鱼鱼糜添加10%的玉米淀粉低温搅拌30 min，保证最终鱼糜含水量为80%。再分别与ChNCs 按比例混合搅拌，ChNCs 的添加量分别为0%、1%、3%、5%（质量分数），并以3%的商业抗冻剂（1.5%蔗糖与1.5%山梨醇混合）做阳性对照，作为将各组样品装袋冻藏于-18 ℃的冰柜中储存0、7、14、21、28、35 d。
1.3.3 肌原纤维蛋白的提取
带鱼中提取肌原纤维蛋白参照Cao 等[6]的方法并稍作修改。将1 mol/L Tris-HCl 稀释成20 mmol/L，称取鱼糜20 g 加入5 倍体积且pH 值为7.2 的20 mmol/L Tris-HCl（含有0.1 mol/L KCl）溶液中，6 000 r/min 均质，每均质30 s 停止30 s，并重复均质5 次，整个过程均在冰水浴中操作；然后，将匀浆在4 ℃、10 000×g 条件下离心20 min，除去上清液之后，沉淀继续用5 倍体积的提取液重复均质3 次；最后，用pH7 的20 mmol/L Tris-HCl（含有0.6 mol/L KCl）溶液均质溶解沉淀物，并在4 ℃静置1 h 后，10 000×g 离心20 min 取上清液，即为肌原纤维蛋白溶液。
1.3.4 盐溶性蛋白含量测定
取2 g 肌原纤维蛋白溶液，加入9 倍体积的生理盐水，4 ℃条件下机械匀浆，制备成10%的匀浆液，2 500 r/min 离心10 min，取50 μL 上清液用双缩脲法测定蛋白质含量。
1.3.5 总巯基和分型巯基测定
取5 g 肌原纤维蛋白溶液，加入9 倍体积的生理盐水制成10%的蛋白匀浆，3 500 r/min 离心10 min，取上清液采用分光光度法测定分型巯基与总巯基含量。
1.3.6 带鱼鱼糜流变学特性测定
使用流变仪测定样品流变性能。将样品放置在直径为60 mm 的板上，狭缝距离设定为1 mm，流变仪探头型号选择PP50，板间距设置为1.0 mm，扫描频率为1 Hz，应变为15%，温度扫描设置在25～90 ℃范围内，升温速率为5 ℃/min。
1.3.7 带鱼鱼糜凝胶强度、持水性和白度测定
1.3.7.1 凝胶强度
破裂强度（B，g）和凹陷深度（C，cm）通过质构仪测量[14]。鱼糜在80 ℃蒸煮20 min，室温下平衡30 min 后制成鱼糜凝胶。鱼糜凝胶切成长度20 mm 的圆柱体，使用P/ 0.25 s 探头，检测前和检测后速度设定为5 mm/s，中试速度1 mm/s，13.5 mm 的距离，触发力为5×g，每个样品10 个重复，测量在不同批次的样品中重复2 次。凝胶强度（A，g·cm）计算公式如下。
A=B×C
1.3.7.2 持水性
鱼糜凝胶的持水能力（water holding capacity，WHC）按Zhou 等[14]的方法测定。称取20 g（m1）鱼糜凝胶放入两层滤纸折叠的盒子中，放入50 mL 的离心管中，6 000 r/min 离心20 min，去除滤纸称量离心后鱼糜总质量，用双层滤纸包裹鱼糜凝胶，4 000 r/min 离心15 min，取下滤纸后，测量凝胶质量，记录为m2。持水率（H，%）的计算公式如下。
1.3.7.3 白度
鱼糜及其凝胶的白度用色差仪测定[15]。将鱼糜和鱼糜凝胶切成20 mm 厚的薄片，然后测量并记录L*（亮度）、a*（红/绿）和b*（黄/蓝）的值。白度（W）计算公式如下。
1.4 数据处理
所有试验均进行3 个重复，数据结果以平均值±标准差表示。通过SPSS 软件进行方差分析（ANOVA）检验，确定数据的显著性。数据图表采用OriginPro 2021 绘制。
2 结果与分析
2.1 ChNCs 对冷冻贮藏中带鱼鱼糜盐溶性蛋白含量的影响
冷冻贮藏中盐溶性蛋白含量的变化是反映蛋白质变性程度的重要指标[16]。冻藏期间不同含量ChNCs对鱼糜盐溶性蛋白含量的影响如图1 所示。
图1 冻藏期间不同含量ChNCs 对鱼糜盐溶性蛋白含量的影响
Fig.1 Effects of different contents of ChNCs on content of saltsoluble protein in surimi during freezing storage
由图1 可知，所有冷冻鱼糜样品的盐溶性蛋白含量均呈现随着冻藏时间的延长而降低的趋势，且冻藏35 d 后，不含抗冻剂与加入1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇组的样品的盐溶性蛋白含量分别降低至（42.29±1.42）%、（47.02±4.85）%、（59.70±1.92）%、（50.35±1.37）%和（62.84±1.57）%。试验结果显示，ChNCs 添加组的肌原纤维盐溶性蛋白含量比不含抗冻剂组下降幅度小，当ChNCs 添加量为3%时，肌原纤维盐溶性蛋白下降的幅度最小，这可能是由于ChNCs 分子链中具有的氨基和羧基等特定官能团取代水分子，从而与蛋白质分子作用，延缓蛋白质的冷冻变性[5，17]。此外，图1 结果显示在冻藏35 d 时，不添加抗冻剂组的盐溶性蛋白含量低于添加抗冻剂的试验组，其中添加1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇组盐溶性蛋白含量最高，而3%ChNCs 的试验组中盐溶性蛋白仅次于1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇组，这表明3%ChNCs 具备的抗冻效果十分接近1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇组效果。
2.2 ChNCs 对冷冻贮藏中带鱼鱼糜的总巯基和分型巯基含量的影响
冻藏期间不同含量ChNCs 对鱼糜总巯基和分型巯基含量的影响如图2 所示。
图2 冻藏期间不同含量ChNCs 对鱼糜巯基的影响
Fig.2 Effect of different contents of ChNCs on the sulfhydryl groups of surimi during freezing
a.总巯基含量；b.分型巯基含量。
由图2a 可知，新鲜带鱼鱼糜的总巯基含量为（6.72±0.31）mol/105 g，当冻藏时间达到35 d 时，新鲜带鱼鱼糜的总巯基含量降低至（3.33±0.08）mol/105 g。这可能是因为在冻藏过程中肌原纤维蛋白冷冻变性，空间结构转变，分子内更多的巯基暴露，被氧化为二硫键，导致巯基含量的降低[1，3，9]。与对照组相比，添加ChNCs 的鱼糜样品中的总巯基含量也呈现不断下降的趋势，添加量为1%、3%、5%ChNCs 的鱼糜总巯基含量，分别下降41.96%、26.79%和37.50%。此外，添加商用抗冻剂的试验组的总巯基含量缓慢下降，在冻藏35 d后，总巯基含量下降22.47%。上述结果表明，ChNCs 等抗冻剂的添加减缓了鱼糜中的总巯基含量的下降速度，表明ChNCs 能够抑制巯基氧化，延缓肌原纤维蛋白的冷冻变性，具有一定的抗冻效果，此结果与冻藏期内的盐溶性蛋白含量变化一致。
肌肉中较低的分型巯基含量通常表明肌原纤维蛋白氧化程度较高[18]。如图2b 所示，新鲜带鱼鱼糜中的分型巯基含量为（5.12±0.21）mol/105 g，随冻藏时间的延长，分型巯基含量快速降低至（2.24±0.12）mol/105 g（冻藏35 d），而加入1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇组样品的分型巯基含量分别降低至（2.53±0.03）、（3.08±0.16）、（2.71±0.43）、（3.46±0.07）mol/105 g；此外，在冷冻过程中，对照组中肌球蛋白分子的构象变化可能导致分型巯基暴露，导致分型巯基含量降低，而ChCNs 的羟基基团与肌球蛋白形成的强氢键阻止分型巯基的暴露[3]。综上所述，ChNCs 的添加能够有效抑制带鱼鱼糜中更多的分型巯基被氧化，提升带鱼鱼糜的抗冻性。
2.3 ChNCs 对冷冻贮藏中带鱼鱼糜流变性能的影响
储能模量G′代表了鱼糜凝胶的弹性行为，损耗模量G″则代表了鱼糜凝胶的黏性特征[19-20]。ChNCs 的添加量对带鱼鱼糜流变性能的影响如图3～图4 所示。
图3 升温中鱼糜凝胶G′的变化
Fig.3 Changes of surimi gel G′ during heating
a.冻藏0 d；b.冻藏14 d；c.冻藏35 d。
图4 升温中鱼糜凝胶G″的变化
Fig.4 Changes of surimi gel G″during heating
a.冻藏0 d；b.冻藏14 d；c.冻藏35 d。
在整个冻藏期间，所有处理组样品的温度应变曲线都表现出G′远大于G″的现象，这表明冻藏期间带鱼鱼糜中的具有弹性的成分较多，鱼糜显现出具有较好的弹性[21]。由图3 可知，在不同冻藏时间内G′的总体变化趋势相似，而不同处理组的鱼糜样品的G′在加热过程（25～90 ℃）中的曲线变化反映了鱼糜的凝胶网络随温度改变而产生的各种物理变化，因此可以将整个升温变化过程大致分为3 个阶段[20，21]。首先，在25～50 ℃的第一阶段内，G′随温度的升高而逐渐降低，并在接近50 ℃时降低到最低值，这可能与肌球纤维蛋白结构变化有关，温度升高提供了过高的能量，破坏了肌球纤维蛋白尾部的螺旋结构，从而导致螺旋结构解旋，提高了分子链的流动性，不利于鱼糜凝胶网络的形成[20，22]；在50～80 ℃的第二阶段，G′随温度的升高而快速增大，并在80～90 ℃进入第三阶段，G′逐渐趋于平稳状态，这是因为温度进一步升高导致大量的蛋白质变性，蛋白质的空间结构被破坏，暴露出大量的活性基团，增大了蛋白凝胶的交联度[21-22]；此外，大量变性蛋白沉降聚集重新形成了结构稳固的凝胶网络[23]。不同处理组的鱼糜样品的G′大小顺序为1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇＞3%ChNCs＞5%ChNCs＞1%ChNCs＞对照组，这表明ChNCs 的添加能够促进鱼糜凝胶的形成。随着冻藏时间的延长，G′呈现降低趋势，这表明随着冻藏时间的延长，鱼糜样品中的弹性组分下降，鱼糜凝胶的弹性降低；然而，尽管随着冻藏时间的延长，试验组的G′仍然呈现相同的趋势，这表明ChNCs 和商业抗冻剂均能够抑制冰晶生长，为冻藏期间鱼糜样品中的肌原纤维蛋白提供保护，延缓蛋白质的冷冻变性。
由图4 可知，带鱼鱼糜中损耗模量G″变化趋势与G′变化趋势相似。G″缓慢增加，当温度小于60 ℃时，鱼糜内部分子之间相互交联，有着稳定的结构，不会对鱼糜内分子链之间化学键以及三维结构造成破坏，继续升高温度会对鱼糜内部的结构造成一定破坏，蛋白发生解链，延伸变长，导致流动性增加[24]。
2.4 ChNCs 对冷冻贮藏中带鱼鱼糜凝胶性能的影响
2.4.1 带鱼鱼糜凝胶的持水性
鱼糜凝胶的持水性能体现了鱼糜蛋白与水分子结合的程度，也反映了鱼糜凝胶对水分子的束缚能力，是影响鱼糜制品的重要因素。冻藏期间带鱼鱼糜凝胶的持水性能如图5 所示。
图5 冻藏期间鱼糜凝胶的持水性能变化
Fig.5 Water holding capacity of surimi gel during freezing storage
由图5 可知，各组鱼糜凝胶的持水性能在冻藏过程中不断降低，这可能是因为在冻藏期间蛋白质的变性，空间结构被破坏，水合作用降低和凝胶网络的重组导致水分流失[6，16，25]。添加ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇后，鱼糜凝胶的持水性能下降速率降低。当冻藏35 d 后，添加1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5%山梨糖醇组的鱼糜凝胶的持水性能分别降低至（67.78±1.02）%、（70.94±0.57）%、（67.83±0.54）%和（71.02±0.91）%，相较于对照组的（62.27±0.90）%有较为明显的提升。上述结果显示抗冻剂的添加提升了鱼糜凝胶的持水性能，可能的原因是抗冻剂能够吸收更多的水分，形成更强的蛋白网络[26]，并且3%ChNCs 和商业抗冻剂对鱼糜凝胶的提升效果接近，表明ChNCs 可能成为商业抗冻剂的潜在替代品。
2.4.2 带鱼鱼糜凝胶的白度
白度主要通过色差参数L*、a*和b*计算获得，反映了冻藏期间鱼糜凝胶的颜色变化差异。Tao 等[21]研究表明白度主要由鱼糜凝胶内部的蛋白质组成成分、变性蛋白质的聚集程度和鱼糜凝胶表面的光学参数决定。冻藏期间鱼糜凝胶的白度变化如图6 所示。
图6 冻藏期间鱼糜凝胶的白度变化
Fig.6 Whiteness of surimi gel during freezing storage
由图6 可知，对照组的初始白度为64.64±1.32，而随着ChNCs 和商业抗冻剂的添加鱼糜凝胶的白度有不同程度的上升，添加1%、3%、5%ChNCs 和1.5%蔗糖＋1.5% 山梨糖醇的鱼糜凝胶的白度分别为68.99±0.87、69.89±0.51、67.99±0.81 和68.97±0.79；而随着冻藏时间的延长，白度呈现逐渐下降的趋势，表明鱼糜凝胶中的变性蛋白质聚集，与文献报道结果一致[3，22，27]。冷冻鱼糜的白度还与致密的空间网络结构有关，由于凝胶三维网络结构的致密性，使其透明度存在差异，因此添加量过多时白度值反而下降，5% ChNCs 组白度均低于3%ChNCs[28]。
2.4.3 带鱼鱼糜凝胶的凝胶性能
鱼糜经过加热蒸煮后能够形成具有三维网络的鱼糜凝胶。冻藏期间鱼糜凝胶的凝胶强度变化如图7所示。
图7 冻藏期间鱼糜凝胶的凝胶强度变化
Fig.7 Gel strength of surimi gel during freezing storage
由图7 可知，所有鱼糜凝胶随着冻藏时间的延长，凝胶强度逐渐降低，表明鱼糜凝胶不断弱化，凝胶蛋白网络逐渐被破坏。在第0 天时，相较于对照组（356.60±7.01）g·cm，添加ChNCs 和商业抗冻剂的试验组凝胶强度更高，其中商业抗冻剂效果最好，为（548.10±12.58）g·cm，这表明添加的抗冻剂等外源物能够有效提高鱼糜凝胶的三维网状结构。当冻藏35 d 后，对照组鱼糜凝胶强度降低至（144.08±11.23）g·cm，而试验组鱼糜凝胶分别为（205.43±7.44）g·cm（1% ChNCs），（328.53±10.69）g·cm（3%ChNCs），（250.68±7.62）g·cm（5%ChNCs）和（363.59±6.58）g·cm（1.5%蔗糖+1.5%山梨糖醇组）。从上述结果可以看出，在冻藏期间，未经处理的对照组鱼糜凝胶弱化，而添加了抗冻剂处理后的试验组不仅能在冻藏前期提升鱼糜凝胶的凝胶强度，还能在冻藏期间抑制鱼糜凝胶的弱化作用。此外，3%ChNCs 具备的抗冻效果十分接近商业抗冻剂的效果。
综上所述，ChNCs 的添加对冷冻贮藏中带鱼鱼糜中的盐溶性蛋白的含量、巯基含量和鱼糜的流变学性能产生了积极的影响，这表明ChNCs 具有的抗冻性能显著保护带鱼鱼糜中肌原纤维蛋白的完整性；此外，ChNCs 还能增强鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性、白度和质构等理化特性，在冻藏期间抑制冰晶生长和凝胶弱化作用。基于上述试验结果，假想ChNCs 的可能抗冻保护机制如图8 所示。
图8 ChNCs 的可能抗冻保护机制
Fig.8 Possible antifreeze protective mechanisms of ChNCs
ChNCs 作为一类甲壳素改性多糖，具有羟基、氨基和羧基等特殊官能团，表面带负电荷，能够通过氢键或静电相互作用与肌原纤维蛋白相互作用，从而延缓冰晶生长和氧化等理化变化对蛋白质的损害，防止其冷冻变性[16]。另一方面，多数文献报道表明，ChNCs 具有的大量羟基基团，使鱼糜内部的与水分子通过氢键结合，减少鱼糜组织内部的水分子迁移，游离水分子的减少不利于冰晶的形成与生长，从而提高鱼糜制品的保水性，抑制冰晶对鱼糜组织的损伤[8，17]。
3 结论
通过甲壳素纳米晶体（ChNCs）对带鱼鱼糜在冻藏期间的抗冻试验，结果表明，ChNCs 能够延缓冻藏期间鱼糜的盐溶性蛋白的含量、巯基含量的下降趋势和增强鱼糜的流变学性能，保护了带鱼鱼糜中的肌原纤维蛋白的完整性；同时，ChNCs 还能增强鱼糜凝胶的凝胶强度、持水性、白度等理化特性并延缓这些指标在冻藏期间的快速下降趋势，抑制在冻藏期间冰晶生长和凝胶弱化作用。与常规商业抗冻剂（1.5%蔗糖+1.5%山梨糖醇）相比，3%ChNCs 的抗冻效果并不弱于商业抗冻剂。此外，作为新型膳食纤维的ChNCs，能够降低鱼糜制品的甜度；相比于商业抗冻剂，ChNCs 能够成为健康有效的抗冻剂的潜在替代品，为食品工业的高性能抗冻剂研究提供思路。
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