酸浆（Physali alkekengi L.）别名红姑娘，主要分布在吉林、内蒙古、四川、西藏等地[1]，具有清凉、消肿、利尿等功效。民间常用酸浆宿萼（果萼）代茶饮降低糖尿病患者血糖，效果非常好[2]。酸浆多糖具有多种生物活性[3]，能修复糖尿病小鼠的肝脏、肾脏，增强糖尿病小鼠的免疫活性，有抗衰老、抑制疲劳等作用[4]，还能促进乳酸杆菌生长，抑制大肠杆菌生长，调节肠道菌群[5]。超声-微波协同辅助提取既拥有超声产生的“机械和空化效应”，能迅速破裂植物细胞壁；又具有微波能使物料内外同时受热的特性。植物细胞内的溶剂汲取微波能，温度急速升高，能够产生瞬时高压，破碎植物细胞壁，强化物质提取[6]。超声-微波协同提取法可以明显缩短提取时间，节省能源消耗，且提高多糖提取率[7]。王佰灵等[8]优选超声-微波双辅助法提取延龄草多糖的工艺，研究表明超声-微波双辅助法提取工艺简单便捷，方法切实可行，延龄草多糖提取率高于单独超声和单独微波提取。李湘利等[9]运用超声-微波协同提取鸡枞菌多糖，缩短了提取时间，提升了多糖得率。
超声-微波协同提取酸浆宿萼多糖相关的提取工艺参数贫乏及酸浆宿萼多糖降糖活力的相关试验研究鲜有报道。本研究选用酸浆宿萼为试验原料，采用超声-微波协同提取酸浆宿萼多糖，通过酸浆宿萼多糖对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力测评其体外降糖活力，为酸浆宿萼多糖的更深入试验研究提供有益借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
酸浆宿萼：自采于通化县，30 ℃低温烘干，粉碎过60 目筛，备用。
葡萄糖对照品（批号：161171-160921）：中国食品药品检定研究院；α-淀粉酶（≥10 000 U/g）、α-葡萄糖苷酶（≥50 U/mg）、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）：上海伊卡生物技术有限公司。
XH-300PE 微波超声波组合萃取仪：北京祥鹄科技有限公司；UV1900 紫外-可见分光光度计：上海菁海仪器有限公司；Thermo Forma 酶标仪：美国Bio-Rad公司。
1.2 试验方法
1.2.1 多糖提取
标准曲线的绘制：超声辅助蒸馏水溶解葡萄糖对照品制备0.2 mg/mL 葡萄糖对照品储备液。取对照品储备液2 mL 于10 mL 容量瓶中，加1 mL 5%苯酚溶液，5 mL 浓硫酸溶液水浴反应20 min，再用蒸馏水定容，于波长400～600 nm 间扫描，优选492 nm 为测定波长[10]。精密吸取对照品储备液1.10、1.30、1.50、1.70、1.90、2.10、2.30、2.50 mL 于10 mL 容量瓶，492 nm 处检测吸光度，参比液为蒸馏水，吸光度A 对浓度C 制作方程A=0.006 7C+0.016 2，R2=0.999 7。结果表示，葡萄糖在0.022～0.050 mg/mL 具有良好线性关系。
样品中多糖含量测定：称取经干燥箱干燥后的酸浆宿萼粉末1 g，石油醚脱脂3 h，超声-微波协同浸提2 次，浸提液5 000 r/min 转速下离心20 min，得上清液，75%乙醇醇沉，复溶，二次醇沉，干燥沉淀为酸浆宿萼多糖[11]。蒸馏水超声溶解酸浆宿萼多糖于10 mL 容量瓶中，蒸馏水溶解并定容，于优选的测定波长处测吸光度，利用回归方程算出浓度，求出多糖提取量。
1.2.2 单因素试验设计
在超声功率200 W、微波功率250 W、协同时间5 min 的条件下，考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]对多糖提取量的作用；在料液比1∶20（g/mL）、微波功率250 W、协同时间5 min 的条件下，考察超声功率50、100、150、200、250 W 对多糖提取量的作用；在料液比1∶20（g/mL）、超声功率150 W、协同时间5 min的条件下，考察微波功率200、250、30、350、400 W 对多糖提取量的作用；在料液比1∶20（g/mL）、超声功率150 W、微波功率300 W 的条件下，考察协同时间2、3、4、5、6 min 对多糖提取量的作用；每组均进行3 次平行试验。
1.2.3 星点响应面法优选提取条件
结合单因素试验获得的试验结果，考察的工艺条件为料液比（A）、超声功率（B）、微波功率（C）、协同时间（D），运用响应面法优选酸浆宿萼多糖提取的工艺条件。多糖提取量为响应值（Y）完成随机试验设计，各工艺因素水平见表1。
表1 工艺因素水平设计
Table 1 Factors and levels of design
水平A 料液比/（g/mL）D 协同时间/min-11∶153 01∶204 11∶255 B 超声功率/W 100 150 200 C 微波功率/W 250 300 350
1.2.4 降糖活力检测
蒸馏水超声辅助制备0.125、0.5、2、8、16 mg/mL 系列浓度的样品溶液，0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL 系列浓度的阿卡波糖阳性对照溶液。
1.2.4.1 对α-葡萄糖苷酶的抑制能力测定
参照表2 完成相关试验，其中加入样品和PNPG后都要求放置在提前预热37 ℃烘箱中15 min，最后添加碳酸钠使得反应终止，使用酶标仪选取540 nm 处检测吸光度。
表2 抑制α-葡萄糖苷酶试验设计
Table 2 Experimental design for α-glucosidase inhibition
组别 磷酸盐缓冲溶液/μL 苷酶/μL样品/μL PNPG/μL 碳酸钠溶液/μL样品组11220502080对照组11220等体积PBS2080空白组112等体积PBS502080 α-葡萄糖
R葡萄糖甘酶=[A对照-（A样品-A空白）]/A对照×100
式中：R葡萄糖甘酶为α-葡萄糖甘酶抑制率，%；A对照为对照组吸光度；A样品为样品组吸光度；A空白为空白组吸光度。
1.2.4.2 对α-淀粉酶的抑制能力测定
参照沈鹏等[12]的方法制备DNS 试剂。参照表3 完成相关试验，加α-淀粉酶后放置在提前预热的37 ℃水浴锅中10 min，最后加入DNS 后，使用酶标仪选取540 nm 处检测吸光度。
表3 抑制α-淀粉酶试验设计表
Table 3 Experimental design for α-amylase inhibition
组别样品/μLα-淀粉酶/μL 淀粉溶液/μL DNS/μL A样品50505050 A样品对照50等体积PBS5050 A对照等体积PBS505050 A空白对照等体积PBS等体积PBS5050
R淀粉酶=[（A对照-A空白对照）-（A样品-A样品对照）-（A空白-A空白对照）]/A对照×100
式中：R淀粉酶为α-淀粉酶抑制率，%；A对照为对照组吸光度，A样品为样品组吸光度，A空白对照为空白对照组吸光度，A样品对照为样品对照组吸光度。
1.3 数据处理
试验获得数据选用Design-Expert 8.0.6、SPSS13.0软件处理分析。
2 结果与分析
2.1 料液比对多糖提取量的影响
料液比对多糖提取量的影响见图1。
图1 料液比对酸浆宿萼多糖提取量的作用
Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on polysaccharides yield
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1 得知，一定程度内酸浆宿萼多糖提取量伴随着溶剂量的增大而增加，提取溶剂量的增大拓宽了酸浆宿萼多糖和提取溶剂两者间浓度差，更便于多糖的溶出[13-14]。料液比达到1∶30（g/mL）后总多糖提取量趋于稳定。这可能与随着溶液体积变大，超声波、微波能量发挥作用于物料上相对消弱，作用于溶剂上相对增强有关[14]。因此选择料液比最佳条件为1∶20（g/mL）。
2.2 超声功率对多糖提取量的作用
超声功率对多糖提取量的作用见图2。
图2 超声功率对酸浆宿萼多糖提取量的作用
Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图2 得知，酸浆宿萼多糖提取量伴随超声功率的增大先升后降，当功率150 W 时，达到最大值，因此选择超声功率工艺参数为150 W。超声波产生的振动能生成空化和剪切效应，更有益于酸浆宿萼细胞的破壁，超声功率进一步加大反而破坏糖苷键有关[15]。
2.3 微波功率对多糖提取量的作用
微波功率对多糖提取量的作用见图3。
图3 微波功率对酸浆宿萼多糖提取量的作用
Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharides yield
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图3 得知，酸浆宿萼多糖提取量随微波功率的增大先升后降，微波功率300 W 时，达到最大值，因此选择微波功率工艺参数为300 W。随着溶剂温度迅速上升，酸浆宿萼多糖提取率在功率250～300 W 时上升很快，随后波功率更高溶剂温度也更高，能破坏多糖结构，导致溶剂甚至暴沸，多糖提取量下降[16]。
2.4 超声-微波协同时间对多糖提取量的作用
超声-微波协同时间对多糖提取量的作用见图4。
图4 协同时间对酸浆宿萼多糖提取量的作用
Fig.4 Effect of synergistic time on polysaccharides yield
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4 得知，酸浆宿萼多糖提取量随超声-微波协同时间的拉长展示出先增后降的趋势，在协同时间4 min 时达到峰值，因此选择协同时间工艺参数为4 min。超声-微波协同提取温度上升非常快，提取时间越长温度越高，高温易使多糖水解，从而致使多糖的提取量下降[17]。
2.5 响应面法改进酸浆宿萼多糖提取工艺条件结果
响应面法所设计的试验方案与结果见表4。
表4 拟合设计试验方案及结果
Table 4 Fitting design test scheme and results
试验号 A 料液比 B 超声功率Y 多糖提取量/（mg/g）1-10-1024.59 2100127.56 3-100-119.87 4010126.89 5000020.23 6011017.56 7-110-126.26 8000-113.56 9-10-1118.32 10-101010.23 11110015.00 120-11019.35 130-1-1023.69 14000018.64 15000019.34 16100127.39 17101019.32 180-10116.56 1900-1-127.26 20-10-1027.31 21000014.32 22-1-10026.38 23-11009.49 24001-111.99 25000026.42 260-10-116.32 2700-1023.35 28110011.36 29001125.34 C 微波功率D 协同时间
使用Design-Expert 8.0.6 软件采用响应面分析法对试验结果进行分析，所得回归方程：Y=26.64-0.30A-0.16B+0.67C+0.55D-1.41AB-0.51AC-0.41AD-1.72BC-0.58BD-0.38CD-1.06A2-1.18B2-0.42C2+0.60D2，R2=0.990 5。响应面法对酸浆多糖提取量的方差分析见表5。
表5 方差分析表
Table 5 Variance analysis of orthogonal test
?
由表5 可知，模型P 值为0.000 5，表示回归方程与实际试验结果拟合性好，试验误差在合理范围，证实该模型可以分析与预测酸浆宿萼多糖的提取量。各因素对多糖提取量的影响顺序为C 微波功率>A 料液比>B 超声功率>D 协同时间。
将表4 中试验所得数据利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应曲面分析，获得的曲面图和等高线图能直观的反映2 个交相提取工艺对酸浆宿萼多糖提取量的影响。遵照上述回归方程，分析A 料液比、B 超声功率、C 微波功率、D 协同时间4 个考察条件对多糖提取量的作用，结果见图5。
图5 各因素交互作用对多糖提取影响的响应面图
Fig.5 Response diagram of the interaction of various factors on the extraction of polysaccharides
由图5 可知，A 料液比、B 超声功率、C 微波功率、D协同时间工艺参数间的交互作用对宿萼多糖提取量的影响。与其它考察因素比较，A 料液比和B 超声功率、A料液比和C 微波功率、C 微波功率和B 超声功率分别与多糖提取量呈相应明显的二次抛物线关系，所构成的三维曲面图形陡峻，且等高线图形为椭圆，等高线较稠密，两工艺参数间的作用对多糖提取量影响相对大[18]。
2.6 验证试验
试验获得的酸浆宿萼多糖提取的最佳条件：料液比1∶16.85（g/mL）、超声功率160 W、微波功率316 W、协同时间3.88 min，多糖提取量为27.569 5 mg/g。考虑实际操作性，提取工艺条件调整为：料液比1∶17（g/mL）、超声功率160 W、微波功率320 W、协同时间4 min。在此优选工艺参数下，完成3 次验证，获得的酸浆宿萼多糖为（26.13±0.11）mg/g，与模型预期值形成的误差为5.22%，证实该方程与酸浆宿萼多糖提取试验完成较好拟合。
2.7 酸浆宿萼多糖降糖能力试验研究结果
酸浆宿萼多糖降糖能力试验研究结果见表6。
表6 酸浆宿萼多糖降糖能力结果
Table 6 Hypoglycemic activity of polysaccharides
组别α-葡萄糖苷酶IC50/（mg/mL）α-淀粉酶IC50/（mg/mL）酸浆宿萼多糖0.387 0±0.158 01.197 3±0.488 8阿卡波糖0.046 5±0.021 30.092 6±0.029 8
由表6 可知，酸浆宿萼多糖与阳性对照品对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制结果进行两样本T 检验，两者降糖结果有差异，但不显著（t=4.314、p=0.050，t=4.032、p=0.056）。抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性是医治2 型糖尿病初期有效途迳[19-20]。酸浆宿萼多糖具有较好的降糖活性，可与医治2 型糖尿病的惯用药物协同使用。
3 结论
超声-微波协同提取利用超声波的空化和剪切作用乃至微波的加热、破壁效用来提高酸浆宿萼多糖的提取量。通过回归方程模拟相关试验考察试验因素间的函数关系来探寻各交互考察因素的最准确组合以及响应值的最理想值。本文优化了超声-微波协同提取酸浆宿萼多糖的工艺，超声-微波协同提取酸浆宿萼多糖用时4 min，该提取法更加省时、高效，酸浆宿萼多糖提取量高。酸浆宿萼多糖有降糖活力，可与医治2型糖尿病的惯用药物协同使用。本试验为酸浆宿萼多糖的更深入科学研究提供参考。
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