白酒酿造过程实质上是微生物繁殖和代谢的过程。浓香型白酒其丰富、独特的口感正是来自于酿酒微生物群的发酵作用，例如真菌菌群是产酒精、产香的主要功能菌，也具有很高的糖化酶及酯化酶活力[1-2]，这些微生物群在酿酒周期内不断动态变化，与整个酿酒过程中所形成的生存环境相适应，经过相应的酿造工艺产生了白酒的独特口味[3-4]。
目前，随着宏基因组测序技术在传统白酒发酵中的广泛应用，微生物群落结构与白酒风味物质的相关性研究成为热点问题[5-7]。吴成等[8]研究酱香型白酒4 轮次堆积发酵过程风味物质与微生物群落间的相互关系，发现酵母菌主要与醇类物质呈正相关显著，丝状真菌和细菌主要与酸类和酯类物质呈正相关显著。刘凡等[9]研究发现，洋河浓香型白酒发酵过程与主要有机酸合成相关的7 个菌属微生物；蒙德俊等[10]以酱香型白酒7 轮次发酵酒醅样品为研究对象，分析发现了毕赤酵母属和酵母菌属与乳酸呈显著相关。王鹏等[11]采用微生物群落与挥发性化合物轮廓关联分析获得功能相关的微生物群，又通过共现性网络分析获得共现微生物群，最终确定了白酒发酵过程中的核心微生物群。
本研究以浓香型白酒不同发酵周期的酒醅样品为研究对象，对其微生物群落结构及其风味物质进行解析，并对两者之间的相关性进行预测，尝试了解浓香型白酒发酵过程中的主要功能微生物群，为白酒生产的定向调控提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
酒醅样品来自河南宋河酒业有限公司16 年窖池。分别采集发酵第0、3、6、9、15、21、27、33、48、60 天的窖池中心上、中、下3 层样品，放入无菌采样袋中，充分混匀后低温运回实验室，-80 ℃保存。
1.2 主要试剂
4-辛醇（色谱纯）：美国Sigma 公司；NaCl（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；E.Z.N.ATM Mag-Bind 土壤DNA 提取试剂盒：美国OMEGA 公司；Agencourt AMPure XP 核酸纯化试剂盒：美国Beckman 公司；Qubit3.0 DNA 检测试剂盒：美国Life 公司。
1.3 试验仪器与设备
7890B-5975C 气相色谱质谱联用仪、Agilent7697A顶空进样系统、HP-INNOWAX 色谱柱（60 m×250 μm×0.5 μm）：美国安捷伦科技有限公司；EC3 凝胶成像系统：美国UVP 公司；T100 Thermal Cycler PCR 仪：美国Bio-RAD 公司；Illumina Miseq PE250 高通量测序仪：美国Illumina 公司。
1.4 方法
1.4.1 酒醅中挥发性风味物质的测定
采用静态顶空气相色谱-质谱法（static headspace gas chromatography-mass spectrometry，SHSGC-MS）对酒醅中挥发性风味物质进行分析。取2.0 g 酒醅样品加入8 mL 超纯水中，4 ℃过夜，冰浴超声30 min 后，于4 ℃、1 000 r/min 离心20 min，将8 mL 已离心的酒醅提取液加入到20 mL 顶空瓶中，再加入3.0 g NaCl 和质量浓度为125 mg/L 的内标物4-辛醇25 μL。采用顶空进样器处理样品[12]。
GC 条件：HP-INNOWAX 色谱柱；载气为氦气，流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；升温程序为50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 升温至80 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升温至170 ℃，以10 ℃/min 升温至240 ℃，保持10 min。
MS 条件：电子电离（electronic ionization，EI）；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围m/z 30～500[13]。
通过质谱解吸以及与NIST 05 a.L 标准谱库比对，进行定性分析，采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。
1.4.2 酒醅微生物群落结构分析
采用DNA 提取试剂盒对酒醅样品进行微生物基因组DNA 提取，具体步骤参见试剂盒说明，采用1%琼脂糖凝胶电泳对所提样本DNA 进行完整性检测。
以基因组DNA 为模板，采用B341F 和B785R 引物[14]对酒醅样品中细菌16S rDNA 的V3～V4 区进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，采用ITS1FI2 和ITS2 引物[15]对酒醅样品中真菌的内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列进行PCR 扩增。PCR 扩增体系：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，DNA 模板10 ng，正反向引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶0.05 U，用双蒸水补充至50 μL。
细菌PCR 扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共5 个循环；然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20 个循环；最后72 ℃延伸5 min[14]。
真菌PCR 扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共计5 个循环；然后94 ℃变性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共计20 个循环；最后72 ℃延伸5 min[15]。
PCR 产物切胶纯化后进行精准定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司进行Illumina MiSeq 高通量测序。
1.4.3 高通量数据处理
采用Cutadapt（v1.9.1）、Prinseq（v0.20.4）及Flash（1.2.3）软件对高通量测序序列进行质控，包括序列拼接、去掉含有N 的序列、去除引物和接头、去除质量值＜20 的碱基及长度＜200 bp 的序列及去除嵌合体。
经过质控的序列在97%相似性水平下进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析。利用Silva 数据库，采用Mothur（1.30.1）软件在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成，同时计算各个样品的覆盖率以及微生物α 多样性指数，包括辛普森（Simpson）指数、香农（Shannon）指数、ACE 和Chao1指数。
1.4.4 酒醅挥发性风味物质与微生物相关性分析
本研究选取酒醅样品微生物高通量测序结果中相对丰度排序在前20 的细菌属和前20 的真菌属信息与风味物质进行相关性分析。首先使用RStudio 中的psych 包计算微生物与代谢物之间的spearman 相关系数（r），以r＞0.5 且p＜0.05 为阈值找出可视化对象，然后选用Cytoscape 3.6.1 对微生物和代谢物之间的相互作用关系进行可视化，表征微生物对风味物质的贡献[11]。
2 结果与分析
2.1 挥发性风味成分的测定结果
利用GC-MS 方法对浓香型白酒酒醅进行主要挥发性风味物质检测，结果分析发现，酒醅中主要风味成分为酯、醇、酚、烷、酸、烯类等化合物，其中酯类136种、醇类39 种、酸类34 种、酚类12 种、烯烃类8 种、烷类20 种、醛类6 种、酮类9 种、醚类4 种。
白酒发酵过程酒醅样品中主要酯含量变化见图1。
图1 白酒发酵过程酒醅样品中主要酯含量变化
Fig.1 Change of main ester content in fermented grains during Baijiu fermentation
如图1 所示，本次采集的酒醅样品中，检测到丰度较高（平均浓度＞0.1 μg/g）的酯类物质有10 种，分别是己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、庚酸乙酯、乙酸己酯、戊酸乙酯和辛酸乙酯。其中丰度最高的为己酸乙酯，在整个发酵周期内，己酸乙酯平均检测值到22.45 μg/g，是浓香型白酒的主体香成分，对浓香型白酒风格的形成有重要作用[16-17]，其次为辛酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯以及己酸己酯。从发酵开始，随着乙醇和多种有机酸的产生，酯类合成开始，发酵至第15 天，酯类总含量达到最高值，发酵末趋于稳定。
白酒发酵过程酒醅样品中主要酸含量变化见图2。
图2 白酒发酵过程酒醅样品中主要酸含量变化
Fig.2 Change of main acid content in fermented grains during Baijiu fermentation
如图2 所示，酒醅样品中检测到的有机酸主要以己酸、乙酸、丁酸、正戊酸和辛酸为主，其总和占总有机酸含量的92.4%，是酯类合成的主要前体物质。其中己酸丰度最高，在整个发酵周期内，每克酒醅样品中平均检测到3.72 μg 己酸。
2.2 酒醅微生物α 多样性分析
采用Illumina Miseq 测序平台得到白酒酒醅样品细菌有效序列数42 937～58 935，97%相似水平下的OTU数目为981～2 390；真菌有效序列数为49 546～76 613，OTU 数目为457～759。酒醅样品微生物α 多样性结果见表1。
表1 酒醅样品中细菌和真菌α 多样性指数
Table 1 The α diversity of bacteria and fungi in fermented grains
微生物时间/d 序列数量覆盖率/%细菌058 391 1 316 3.878 1 788.027 1 692.801 0.075 99.24 349 552 2 390 4.939 4 939.432 3 865.331 0.032 98.91 652 330 2 209 5.122 3 919.201 3 289.313 0.024 98.35 957 161 1 763 4.127 3 519.659 2 767.124 0.094 98.72 15 48 415 1 308 2.693 3 310.226 2 340.869 0.271 98.77 21 49 294 1 705 3.589 4 195.990 3 089.888 0.125 98.31 27 56 828 1 532 2.820 3 424.303 2 642.845 0.296 98.82 33 53 439 1 970 3.758 4 375.562 3 320.385 0.163 98.38 48 50 033 1 538 3.193 3 330.227 2 550.020 0.216 98.65 60 42 937 981 2.290 2 675.462 1 814.058 0.291 98.88真菌064 559 457 2.019 1 086.916 785.514 0.230 99.73 372 145 759 3.087 1 917.424 1 367.464 0.110 99.52 665 494 635 2.678 1 532.903 1 099.472 0.149 99.61 952 343 649 3.102 1 645.663 1 175.756 0.096 99.45 15 68 323 627 3.198 1 234.046 998.091 0.087 99.63 21 49 546 626 2.773 1 468.145 1 088.315 0.192 99.44 27 76 613 604 2.838 1 182.241 955.081 0.171 99.73 33 53 360 613 3.412 1 596.527 1 069.199 0.068 99.46 48 56 760 646 2.824 1 504.542 1 086.678 0.135 99.53 60 66 503 517 2.890 1 148.281 824.966 0.109 99.71 OTU数量Shannon指数ACE指数Chao1指数Simpson指数
丰富度指数Chao1 和ACE 越大，表明群落物种丰富度越高；多样性指数Shannon 越大或Simpson 越小，表明群落物种的多样性越高。由表1 中细菌α 多样性指数结果分析发现，在发酵初期（3～6 d），酒醅样品中Simpson 指数出现最小值，Shannon 指数、ACE 和Chao1 指数均出现最大值，说明在发酵初期酒醅中微生物菌群的丰富度和多样性最高，推测可能是由于在发酵初期底物充足，来自酒曲、窖池中的多种微生物活跃，呈现了较为丰富的多样性。随后多样性指数及丰富度指数均呈现不同程度下降，随着发酵的进行，分解原料产生的有机酸、乙醇等物质过多，使一部分微生物不能适应酸度过高的发酵环境，生长受到抑制，到达发酵后期，微生物的多样性及丰富度均达到最低。真菌α 多样性指数结果分析发现，酒醅样品在发酵第3 天，物种丰富度最高，在发酵第33 天，物种多样性呈现最大值。细菌的丰富度和多样性高于真菌，本研究结果与其他报道基本一致[9，18]。
2.3 酒醅微生物群落结构分析
基于门水平酒醅中细菌群落结构分析见图3。
图3 基于门水平酒醅中细菌群落结构分析
Fig.3 Analysis of bacterial community structure of fermented grains based on phylum level
如图3 所示，基于细菌OTU 注释分析，酒醅样品中共得到16 个门，优势菌门（任一样品相对丰度≥1%）7 个，非优势菌门和未注释（unclassified）门的OTU 归为其它。其中所有样品中平均相对含量大于1%的有厚壁菌门（Firmicutes）、菌拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteria）。整个发酵过程中厚壁菌门是丰度最高的优势门，其相对丰度为27.54%～93.65%。菌拟杆菌门、变形菌门和绿弯菌门在发酵前期丰度较高，随着发酵的进行相对丰度呈波动式降低，至发酵第60 天相对丰度均低于1%。
基于门水平酒醅中真菌群落结构分析见图4。
图4 基于门水平酒醅中真菌群落结构分析
Fig.4 Analysis of fungi community structure of fermented grains based on phylum level
如图4 所示，基于真菌OTU 注释分析，酒醅样品共得到8 个真菌门，优势菌门3 个，其中所有样品中平均相对含量大于1%的有子囊菌门（Ascomycota）和毛霉门（Mucoromycota）。整个发酵过程中子囊菌门是丰度最高的优势门，其相对丰度在入料样品（0 d）中达到91.09%，最后缓慢降低，发酵结束稳定在48.41%。高含量的Ascomycota 对驱动酒醅活性微生物群落变化起重要作用[18]。
基于属水平酒醅中细菌群落结构分析见图5。
图5 基于属水平酒醅中细菌群落结构分析
Fig.5 Analysis of bacterial community structure of fermented grains based on genus level
如图5 所示，细菌属水平上，酒醅样品共检测到169 种，优势菌属（任一样品相对丰度≥1%）有29 种。其中所有样品中平均相对含量大于1%的有乳杆菌属（Lactobacillus）、蚤蝇属（Levilinea）、普雷沃菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）、牦牛瘤胃菌（Proteiniclasticum）和Macellibacteroides。未分类菌（unclassified）和未注释到属的未知菌在发酵过程中所占比例较高（16.82%～84.61%），表明白酒发酵过程中微生物种属复杂。
基于属水平酒醅中真菌群落结构分析见图6。
图6 基于属水平酒醅中真菌群落结构分析
Fig.6 Analysis of fungi community structure of fermented grains based on genus level
如图6 所示，酒醅样品检测到真菌属43 种，优势菌属有15 种。其中所有样品中平均相对含量大于1%的有酵母菌目的未分类属（unclassified Saccharomycetales）、嗜热真菌属（Thermomyces）、曲霉属（Aspergillus）、Naumovozyma、假丝酵母属（Candida）、酵母属（Saccharomyces）、青霉菌属（Penicillium）和镰刀霉（Fusarium），这与我国其它浓香型白酒产区相关研究中优势属种类一致性较高[9，19]。
2.4 微生物与风味物质的相关性分析
酒醅样品微生物与主要风味物质的相关性分析如图7 所示。
图7 酒醅样品主要微生物与风味物质相关性分析
Fig.7 Correlation network between main microbial genera and volatile compounds
V1～V24.酯类物质；V35～V53.醇类物质；V70～V72.酮类物质；V80～V81.醛类物质；V98～V103.酸类物质；V110～V115.酚类物质。
如图7 所示，相关性分析中共有238 个有效连接点，其中真菌Thermomyces、Naumovozyma 和Saccharomyces 是连接度最大的3 个真菌属（26，20，17），细菌Lactobacillus、醋酸杆菌（Acetobacte）和梭状芽孢杆菌XlVa（Clostridium XlVa）是连接度最大的3 个细菌属（18，10，10）。浓香型白酒四大酯类物质分别为己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯，相关性分析发现Naumovozyma、Aspergillus、Thermomyces、Saccharomyces和Candida 与己酸乙酯（V24）具有较强相关性；拟杆菌属（Bacteroides）和Lactobacillus 与乙酸乙酯（V5）具有较强相关性；Aspergillus 与丁酸乙酯（V4）强相关；Naumovozyma、Thermomyces、Fusarium、根毛霉属（Rhizomucor）、孢圆酵母（Torulaspora）、Acetobacter 和梭状芽孢杆菌IV（Clostridium IV）与乳酸乙酯（V16）具有较强相关性。Naumovozyma、Thermomyces、Saccharomyces、Candida 和Lactobacillus 与醇类物质有关联，Lactobacillus和Thermomyces 与酸类物质呈正相关。
综上，Spearman 相关性结果显示，在浓香型白酒发酵过程中，Thermomyces、Naumovozyma、Saccharomyces、Lactobacillus、Acetobacte、Clostridium、Candida和Aspergillus 对酯、醇等主要风味物质的产生具有显著贡献作用。Saccharomyces 和Lactobacillus 同样是刘凡等[9]和王鹏等[11]的研究中与浓香型白酒主要风味物质相关的核心和关键酒醅微生物。
3 结论
采用气相色谱-质谱联用法和高通量测序技术检测浓香型白酒连续发酵的酒醅样品中挥发性风味物质变化和微生物群落结构组成。结果显示，发酵过程中共检测到挥发性风味成分268 种，其中酯类136 种、醇类39 种、酸类34 种、酚类12 种、烯烃类8 种、烷类20 种、醛类6 种、酮类9 种、醚类4 种。己酸乙酯是丰度最高的酯类物质，构成了浓香型白酒的主体香成分。高通量测序结果结果表明，发酵过程中酒醅样品细菌的丰富度和多样性高于真菌，厚壁菌门（Firmicutes）和子囊菌门（Ascomycota）分别是丰度最高的优势细菌门和真菌门。平均相对丰度大于1%的优势细菌属有乳杆菌属（Lactobacillus）、蚤蝇属（Levilinea）和普雷沃菌属（Prevotella）等；优势真菌属有酵母菌目的未分类属（unclassified Saccharomycetales）、嗜热真菌属（Thermomyces）和曲霉属（Aspergillus）等。主要微生物与挥发性风味物质的相关性网络连接图显示，Thermomyces、Naumovozyma、酵母属（Saccharomyces）、Lactobacillus、醋酸杆菌（Acetobacte）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、假丝酵母属（Candida）和Aspergillus 是浓香型白酒挥发性风味物质产生的主要贡献微生物。
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