超氧阴离子是一种活性氧，是细胞中氧分子受单一电子还原的产物[1-3]，它能够通过细胞扩散，参与细胞增殖、细胞凋亡等众多的生理活动，在细胞的氧化还原代谢中发挥着重要作用。超氧阴离子在细胞内能够通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）转化为H2O2，但是当生物体内产生过多的超氧阴离子，超过细胞所能调节的范围时，可能会引起细胞坏死、DNA损伤、脂质过氧化等。随着时间的推移，甚至会导致神经退行性疾病、糖尿病等慢性疾病的发生[1，4-5]。因此，当机体受到外界不良条件的刺激（如紫外线、环境污染等）产生过量的超氧阴离子时需要借助外源性物质来清除。
虾青素，又名虾黄质，是一种含氧类胡萝卜素，其具有脂溶性，不溶于水，可溶于有机溶剂。虾青素含有多个共轭双键及2 个含氧的α-羟基酮六元环，能通过向自由基提供电子或接受自由基未配对电子，淬灭自由基发挥其抗氧化作用[6-7]。虾青素可以分为人工合成的虾青素和天然来源的虾青素。利用化学方法合成的虾青素易于大规模生产，已成为虾青素市场的主要组成部分，但因其利用率低及安全性问题限制了其在医疗、保健以及化妆品等行业的应用[8-9]。天然虾青素广泛分布于自然界，尤其是虾、蟹等水生动物，以及微藻、酵母等微生物中。雨生红球藻凭借其高虾青素含量和所含虾青素的类型被认为是天然虾青素的最佳来源[6，10-12]。雨生红球藻来源的虾青素是一种具有多种生理功能的有效抗氧化剂，被广泛应用于健康食品和生物医学等领域[9]。
虾青素是自然界最强的抗氧化剂之一，能有效清除自由基和活性氧，其抗氧化活性是玉米黄质、叶黄素、β-胡萝卜素的10 倍，是α-生育酚的100 倍[10]。虽然虾青素的抗氧化作用是公认的，但是以往研究大都关注虾青素的总体抗氧化能力，而很少探究其针对某一种活性氧或自由基的作用，比如虾青素对超氧阴离子的作用。对于抗氧化剂的总抗氧化能力的衡量，一般采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）测定法[13-16]，它常用于活性物种（如亲水过氧基、亲脂过氧基、过氧亚硝基、超氧阴离子等）的检测，但并不区分对某一种自由基的作用。目前缺乏简单、经济实惠的方法检测虾青素对超氧阴离子的清除作用。有研究者利用电子自旋共振（electron spinresonance spectroscopy，ESR）法或液质联用的方法检测虾青素或其衍生物对超氧阴离子的作用[17-18]，但这些方法所用到的仪器价格昂贵，不适合常规的检测。而其他用于测定抗氧化剂超氧阴离子清除活性的方法，如荧光法[19]、细胞色素c 还原法[20]、氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）法[21]等，除了对检测设备具有一定的要求，还需要特殊的生物制剂。相比这些方法，利用邻苯三酚自氧化法检测抗氧化剂的超氧阴离子清除能力是一种经济实用的方法。该方法利用邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化，产生超氧阴离子的同时，在325 nm 附近会出现一个特征吸收峰，而超氧阴离子又可以进一步促进邻苯三酚的氧化，随着氧化反应的深入，该峰的吸收逐渐变强，当产生的超氧阴离子被清除后，反应被抑制，其在325 nm 附近的吸收就会减少[22-24]。所以，可以根据325 nm 附近特征吸收峰的变化判断溶液中超氧阴离子的量的多少，从而判断抗氧化剂对超氧阴离子的清除作用。邻苯三酚自氧化法最早由Marklund 为SOD 而设计[22，25]，后来由于方法的优越性被广泛用于检测抗氧化剂对超氧阴离子的清除作用。但虾青素不溶于水，而传统的邻苯三酚自氧化法的溶液体系为水相，不适合虾青素的检测，因此本研究在传统的邻苯三酚自氧化法的基础上进行改进，定量检测虾青素对超氧阴离子的清除效果，并与典型的抗氧化剂β-胡萝卜素、维生素C 和α-生育酚进行对比，以期为检测虾青素等脂溶性抗氧化剂对超氧阴离子的清除作用提供一种简便可行的方法，同时也为虾青素的抗氧化应用提供一定的试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
邻苯三酚（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司；盐酸、无水乙醇（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl：合肥志宏泰克生物技术有限公司；α-生育酚（＞99%）、维生素C（≥99%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；β-胡萝卜素（≥97%）、虾青素标准品（≥97%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；天然虾青素（10%）：云南红青夫生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（UV-2550）：日本岛津公司；电子天平（ALC-110.4）：德国Acculab 公司；超纯水机（RM-220）：美国艾科浦国际有限公司；涡旋仪（MXF）：美国Scilogex 公司。
1.3 方法
1.3.1 测量原理
虾青素对超氧阴离子清除能力的检测采用邻苯三酚自氧化法。该方法利用邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化，产生超氧阴离子的同时，在325 nm 附近会出现一个特征吸收峰，根据特征吸收峰的变化判断溶液中超氧阴离子的量的多少，从而判断抗氧化剂对超氧阴离子的清除作用[22-24]。
1.3.2 测量方法的改进
一般通过邻苯三酚自氧化法检测抗氧化剂对超氧阴离子的清除作用多采用偏碱性的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）或Tris-HCl 等水相溶液作为反应体系[26-29]，这种方法更适合于水溶性抗氧化剂的检测，而虾青素是一种脂溶性抗氧化剂，不溶于水，因此常规方法不适合虾青素。有研究者利用正丁醇饱和水溶液作为Tris-HCl 的溶剂改进邻苯三酚自氧化法用于对脂溶性抗氧化剂的检测[22]，而在试验的过程中发现，当以正丁醇饱和的水溶液作为Tris-HCl 的溶剂时，加入微量邻苯三酚即可使溶液变浑浊，严重影响检测结果。天然虾青素能较好地溶解于无水乙醇中，而β-胡萝卜素和α-生育酚皆可溶解于无水乙醇中，因此，向反应中引入无水乙醇可解决虾青素及其他抗氧化剂的溶解性问题。
利用1 mmol/L 的盐酸制备成浓度为30 mmol/L 的邻苯三酚溶液。分别向5 mL 的离心管中加入900、1 200、1 500、1 800、2 250 μL 无水乙醇，然后利用pH 8.0 的Tris-HCl 缓冲液补足至2 975 μL，混合均匀后，加入25 μL 30 mmol/L 的邻苯三酚溶液，使无水乙醇的体积分数分别为30%、40%、50%、60%、75%，充分混合后立即在200～750 nm 的范围内进行紫外-可见光吸收光谱的扫描，每隔3 min 扫描1 次，试验共进行9 min，考察反应溶液在325 nm 附近的吸收变化。
1.3.3 虾青素及其它抗氧化剂对超氧阴离子清除能力的测定
精密称取一定质量的虾青素标准品，分别配制成不同浓度的虾青素溶液，然后利用紫外可见分光光度计测量其在最大吸收峰处的吸收值，根据测得的数值绘制标准曲线。取一定质量的天然虾青素、β-胡萝卜素、α-生育酚和维生素C 标准品，利用无水乙醇分别制备浓度为600 μmol/L 的虾青素母液、浓度为120 μmol/L 的β-胡萝卜素母液、浓度为12.5mmol/L 的α-生育酚母液，制备浓度为11.25 mmol/L 的维生素C水溶液，用于后续试验。具体方法如下：向5 mL 的离心管中依次加入pH8.0 的Tris-HCl 缓冲液，不同浓度的虾青素溶液或β-胡萝卜素、维生素C、α-生育酚溶液，一定体积的无水乙醇，混合均匀后，加入25 μL 30 mmol/L的邻苯三酚溶液，充分混合后立即在200～750 nm 的范围内进行紫外-可见光吸收光谱的扫描，每隔3 min 扫描1 次，试验共进行9 min，考察反应溶液在325 nm 附近的吸收变化，记为ΔA。虾青素等抗氧化剂对超氧阴离子的清除率（R，%）按照以下公式进行计算。
式中：ΔAct 为不加样品时反应溶液在325 nm 处吸光度的变化量；ΔAs 为加入样品溶液后反应溶液在325 nm 处吸光度的变化量；T 为反应时间，9 min。
1.4 数据处理
本试验采用Origin 2021b、Excel 2019 软件进行数据处理并分析作图，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 无水乙醇对邻苯三酚自氧化反应的影响
不同无水乙醇浓度对邻苯三酚自氧化反应的影响见图1。
图1 无水乙醇对邻苯三酚自氧化反应影响的紫外可见光吸收光谱
Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectra of the effect of ethanol on pyrogallol autoxidation
由图1 可知，反应混合液在325 nm 附近吸光度在0～9 min 内均随着无水乙醇浓度的增加而降低，这表明无水乙醇会抑制反应的进行。当无水乙醇浓度较大时，邻苯三酚自氧化反应被明显抑制，产生的超氧阴离子较少，不利于后续的清除试验，因此，选择无水乙醇浓度30%用于后续的试验。
2.2 不同浓度的虾青素对邻苯三酚自氧化反应的影响
图2 为不同浓度的虾青素对邻苯三酚自氧化反应的影响。通过虾青素对邻苯三酚自氧化反应的抑制作用间接判断其清除超氧阴离子的抗氧化能力。
图2 不同浓度虾青素对邻苯三酚自氧化反应影响的紫外可见光吸收光谱
Fig.2 Ultraviolet-visible absorption spectra of the effect of astaxanthin with different concentrations on the autoxidation of
pyrogallol
A.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.6 μmol/L；D.8 μmol/L。
由图2 可知，与不加虾青素相比，当虾青素的终浓度为4 μmol/L 时，邻苯三酚的自氧化产物在325 nm附近的特征吸收峰的变化较小，说明该浓度的虾青素对反应条件下邻苯三酚的自氧化反应抑制作用不明显。随着虾青素浓度的增加，邻苯三酚自氧化反应的程度有所降低，当虾青素的浓度为8 μmol/L 时，在325 nm附近的特征吸收峰的变化最小，邻苯三酚从0 min 到9 min 内自氧化反应的进程被显著抑制，说明该浓度的虾青素能明显清除超氧阴离子。
2.3 不同抗氧化剂对超氧阴离子的清除能力
为了进一步量化4 种抗氧化剂对超氧阴离子的清除能力，对它们在9 min 内的超氧阴离子清除率与其浓度的关系进行线性拟合，并计算出各自清除超氧阴离子作用的线性回归方程，结果如图3 所示。
图3 抗氧化剂的浓度与超氧阴离子清除率关系的拟合曲线
Fig.3 Fitting curve of the relationship between the concentration of antioxidants and superoxide anion scavenging rate
A.虾青素；B.β-胡萝卜素；C.维生素C；D.α-生育酚。
由图3 可知，虾青素、β-胡萝卜素、维生素C 和α-生育酚的超氧阴离子清除率与其浓度关系的线性回归方程分别为y=2.021 7x-0.481 4，R2=0.987 1；y=0.527 2x+0.061 3，R2=0.996 2；y=2.270 1x-0.414 3，R2=0.995 3；y=0.071 4x-0.054 4，R2=0.997 8。由此可见，不同浓度的抗氧化剂与其清除率之间的线性关系良好。
2.4 不同抗氧化剂对超氧阴离子清除作用的半数效应浓度
根据抗氧化剂各自的线性回归方程分别计算出其超氧阴离子清除率的半数效应浓度（median effective concentration，EC50），从而判断不同抗氧化剂抗氧化能力的强弱，结果见表1。
表1 不同抗氧化剂对超氧阴离子清除作用的EC50 Table 1 EC50 of different antioxidants for scavenging superoxide anion μmol/L
抗氧化剂种类EC50虾青素25.0 β-胡萝卜素94.7维生素C22.2 α-生育酚701.0
由表1 可知，当pH8.0 的Tris-HCl 与无水乙醇的体积比为7∶3，邻苯三酚的终浓度为0.25 mmol/L 时，虾青素、β-胡萝卜素、维生素C 和α-生育酚对超氧阴离子清除作用的半数效应浓度分别为25.0、94.7、22.2 μmol/L 和701.0 μmol/L。虾青素对超氧阴离子的清除作用的EC50 与维生素C 接近，明显小于β-胡萝卜素和α-生育酚，这说明清除相同数量的超氧阴离子所需的虾青素或维生素C 的浓度较小，所需的β-胡萝卜素或α-生育酚的浓度较大，由此可见，虾青素对超氧阴离子的清除作用与维生素C 接近，明显高于β-胡萝卜素和α-生育酚，在本试验条件下，其清除超氧自由基的能力是β-胡萝卜素的3.8 倍，是α-生育酚的28.0 倍。由于反应条件的不同，这与先前研究者检测的β-胡萝卜素和维生素C 对超氧阴离子的清除作用不完全一致[22]，但对于抗氧化剂之间清除能力的比较，本研究与前人的试验结果是一致的，说明本研究检测方法可靠。
3 结论
在本研究中，利用改进的邻苯三酚自氧化法检测虾青素对超氧阴离子的清除作用，结果表明，虾青素的超氧阴离子清除能力与维生素C 接近，明显高于β-胡萝卜素和α-生育酚。本研究不仅提供了一种测定虾青素抗氧化能力的方法，而且为虾青素的抗氧化应用提供了一定的试验依据。
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