学龄儿童对能量和营养素的需求量高于成年人，随着生活水平的提高，我国学龄儿童的营养健康状况逐步改善，但也面临诸多问题[1]。例如食物过度精细化、膳食纤维摄入不足、超重肥胖检出率不断上升；用眼过度、儿童近视率不断上升[2]；每日蛋白摄入不足。在改善上述问题的诸多途径中，最具可得性、可及性和可负担性的是通过健康的饮食来干预。
类胡萝卜素广泛存在于各种植物性食物中，赋予植物黄、橙和红的色泽。天然类胡萝卜素作为维生素A原对人体健康有益。特定类胡萝卜素的摄入及其在血液中的浓度与一些慢性疾病的风险降低有关，如叶黄素在保护和缓解眼部疾病方面发挥有益作用[3]。对我国儿童维生素A 营养状况的调查结果表明，近年来学龄儿童胡萝卜素摄入水平整体有所下降，急需采取措施增加儿童对维生素A 的摄入[4]。每日摄入多种色彩鲜艳的蔬果和杂粮被认为是补充类胡萝卜素最安全且有效的方式。
膳食纤维（dietary fiber，DF）指含有3 个或3 个以上单体单位的可食用碳水化合物聚合物，可以被特定的肠道菌群代谢并产生一系列有益的功能性代谢产物，如短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），促进结肠对矿物质（钙和镁）的吸收，改善肠道环境[5]。4～13 岁儿童膳食纤维的适宜摄入量为25～31 g/d[6]。然而，目前儿童的膳食纤维摄入量远未达到推荐水平[7]。儿童时期饮食设计应在满足生长发育的基础上，降低成年期饮食相关慢性疾病的风险。为了从日常饮食中获得足够的膳食纤维摄入量，需要额外补充膳食纤维。
面条是我国消费最多的主食，小米、南瓜和胡萝卜均富含类胡萝卜素，为获得更多类胡萝卜素对健康的益处，本研究制备富含类胡萝卜素和膳食纤维的蔬菜小米面条，研究不同膳食纤维添加对面条中类胡萝卜素生物可及性和酵解特性的影响，为改善儿童的维生素A 营养状况和增加膳食纤维的摄入提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米粉、麦芯粉：朝阳市顺和农业开发有限公司；谷朊粉：封丘县华丰粉业有限公司；食盐：四川久大制盐有限责任公司；冻干胡萝卜粉、冻干南瓜粉：漳州昌禄食品有限公司；高直链玉米淀粉（high-amylose corn starch，HACS）（直链＞65%）：美国Kang Biological Products 公司；阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）（含量≥95%）：江苏瑞诚生物科技有限公司；菊粉、低聚果糖（fructo-oligosaccharides，FOS）、低聚半乳糖（galactose oligosaccharides，GOS）、燕麦β-葡聚糖（oat β-glucan，BG）、阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）、低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）（含量≥95%）：上海洺彧生物科技有限公司；α-淀粉酶（A3175）、胃蛋白酶（P6887）、胰酶（P1750）：美国Sigma 化学公司；菊粉标准品、淀粉葡萄糖苷酶、总淀粉检测试剂盒（K-TSTA-100A）：爱尔兰Megazyme 公司；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸标品、维生素K1、氯化血红素（均为分析纯）：上海阿拉丁公司；蛋白胨：美国Becton Dickinson 公司；酵母膏粉：英国OXOID 公司。
1.2 仪器与设备
分析天平（XS205）、pH 计（FE-28）：瑞士梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；数显恒温摇床（VOSHINCOS-100B）：无锡沃信仪器有限公司；小型台式高速离心机（5418R）：德国Eppendorf 公司；全波长多功能酶标仪（Variouskan Flash）：美国Thermo 公司；厌氧手套箱（COY-8300600）：美国COY 公司；灭菌锅（BXN-30R）：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；冷冻干燥机（Free Zone）：美国LABCONCO 公司。
1.3 方法
1.3.1 小米胡萝卜南瓜面条的制备
未添加膳食纤维的面条（L）：在前期试验的基础上按照比例分别称取适量的小米粉、麦芯粉、冻干胡萝卜粉、冻干南瓜粉、谷朊粉和食盐，缓慢加入适量水搅拌至形成面团，盖上保鲜膜，在25 ℃醒发30 min 后，将面团分成小块装入自动面条机中，挤压（2～3 mm 孔径），水沸后煮3 min 得到熟面条，装入自封袋冷藏以供后续试验使用。
添加膳食纤维的面条：在上述配方的基础上分别添加8% 菊粉、FOS、GOS、HACS、BG、AG、AX 和XOS，再用同样的方法制作和储存，所制得面条依次表示为LI、LFOS、LGOS、LHACS、LBG、LAG、LAX 和LXOS。
1.3.2 面条指标的测定
1.3.2.1 面条熟断条率的测定
参考周民生等[8]的方法并稍作修改，随机选取20根直径2 mm、长20 cm 的面条，水沸后煮3 min 捞出，记录断条数（N），按下列公式计算面条断条率（X，%）。
X=N/20×100
1.3.2.2 面条感官评定
选15 名经过食品感官检验培训的人员作为评定人选，水沸腾后，把面条煮3 min 捞出，进行感官评定，结果以总分表示。面条的感官评价标准[8]见表1。
表1 面条的感官评价标准
Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of noodles
项目评分标准分值色泽（20 分）＞15～20＞10～15 5～10外观（20 分）色泽均匀，呈现诱人的食物色泽亮度一般，色泽不均匀亮度差，颜色不悦人＞15～20＞10～15 5～10口感（40 分）面条表面光滑和膨胀程度，表面结构光滑表面结构较光滑表面粗糙，发黏＞25～40＞15～25 1～15食味（20 分）有轻微嚼劲、富弹性，不黏牙，爽口，口感光滑咬劲稍差、稍黏牙，较爽口，口感适中咬劲差，弹性不足，黏牙，不爽口，口感差有胡萝南瓜本身香味，甜味适中萝卜南瓜香味较弱，微甜有异味或其他不良口感，偏甜＞15～20＞10～15 5～10
1.3.3 面条基本理化性质的测定
将制得熟面条经冷冻干燥并研磨后得到均一粉末面条样品，粗蛋白含量的测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；灰分含量的测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；粗脂肪含量的测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；总淀粉含量的测定参考总淀粉检测试剂盒中提供的方法。
1.3.4 面条的体外消化特性
1.3.4.1 模拟消化的电解质溶液成分
体外消化参考Brodkorb 等[9]的方法并略作修改。模拟口腔消化液（simulated salivary fluid，SSF）、模拟胃液（simulated salivary fluid，SGF）和模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）消化的电解质溶液的配制如表2所示。
表2 模拟消化电解质溶液配制
Table 2 Composition of electrolyte solution for simulated digestion
注：电解质溶液中的CaCl2·2H2O 需要在消化时加入。
无机盐溶液（500 mL） 浓度/（mol/L） SSF/mL SGF/mL SIF/mL KCl0.5018.8758.6258.500 K H2PO40.504.6251.1251.000 NaHCO31.008.50015.625 53.125 NaCl2.0014.750 12.000 MgCl2·6H2O0.150.6250.5001.375（NH4）2CO30.500.0750.625 CaCl2·2H2O0.300.0250.0050.040
1.3.4.2 面条的体外模拟消化模型
模拟口腔消化：将5 g 熟面条切成小块模拟咀嚼，用1 mol/L HCl 溶液将pH 值调到7 后加入4 mL SSF、25 μL CaCl2·2H2O 溶液、0.5 mL α-淀粉酶（1 500 U/mL，SSF 溶解），最后补充蒸馏水至10 mL，置于摇床中避光振荡（220 r/min、37 ℃）2 min。
模拟胃消化：模拟口腔消化后的样品用1 mol/L HCl 溶液调节pH 值至3 后加入8mLSGF 和5μLCaCl2·2H2O 溶液，再加入0.5 mL 胃蛋白酶溶液（80 000 U/mL，SGF 溶解），最后加入蒸馏水至20 mL，置于摇床中避光振荡（220 r/min、37 ℃）2 h。
模拟小肠消化：模拟胃消化后的混合物用1 mol/L NaOH 溶液调节pH 值至7 后加入8.5 mL SIF、40 μL CaCl2·2H2O 溶液、5 mL 胰酶（基于胰蛋白酶：800 U/mL，SIF 溶解）和2.5 mL 胆汁（38.4 mg/mL，SIF 溶解），最后加入适量蒸馏水至40 mL，置于摇床中避光振荡（220 r/min、37 ℃）2 h。
1.3.5 类胡萝卜素生物可及性的测定
1.3.5.1 类胡萝卜素的提取
消化前样品中类胡萝卜素使用有机萃取剂（正己烷、丙酮、无水乙醇体积比2∶1∶1）提取：准确称取2 g 经冷冻干燥、研磨并过筛（80 目）的面条粉末，加入8 mL萃取剂、5 mL 10%氯化钠，涡旋混匀后超声5 min 并离心（5 000 r/min，5 min），收集有机上清液，除不添加氯化钠溶液，重复上述步骤至样品颜色变成白色，之后收集并合并有机上清液并浓缩到10 mL，用紫外分光光度计在450 nm 处测定吸光度。
消化后样品中类胡萝卜素的提取：参考Petry 等[10]的方法并稍作修改，小米胡萝卜南瓜面条经体外模拟消化后的混合物先低速离心（5 000 r/min，10 min），之后取10 mL 上清液低温高速离心（20 000 r/min，10 min，4 ℃）得到含有混合胶束的上清液，采用上述同样方法进行萃取并测定吸光度。整个提取过程始终在暗环境下进行，每个样品独立消化，做3 个平行试验。
1.3.5.2 类胡萝卜素生物可及性的分析
面条中类胡萝卜素的生物可及性是和未消化面条中类胡萝卜素的初始含量相比，生物可及性的计算公式如下。
M=CX/CT×100
式中：M 为生物可及性，%；CX 为胶束组分中类胡萝卜素的浓度，μg/g；CT 为样品中初始的类胡萝卜素浓度，μg/g。
1.3.6 面条的体外模拟酵解
1.3.6.1 粪便接种物的预处理
将从4 名6～12 岁的健康学龄儿童志愿者（体重指数18.5～23.9，饮食正常，过去6 个月未服用抗生素或益生元）的新鲜粪便迅速转移到厌氧手套箱中。粪便样品用含0.1% L-半胱氨酸盐酸的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）按固液比1∶5（g/mL）稀释，充分混匀后通过70 μm 细胞筛过滤得到粪便滤液。最后，将4 名志愿者的粪便滤液与适量等体积甘油混合，放入-80 ℃冰箱中保存[11]。
1.3.6.2 发酵样品的制备
模拟体外胃肠消化后的样品放入透析袋模拟小肠吸收和除去小分子物质，之后将透析袋内的样品冷冻干燥，收集在自封袋并放在干燥器中保存以供后续试验使用。
1.3.6.3 培养基的配制
参考Ayimbila 等[12]的方法稍作修改，每升培养基中含蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、NaCl 0.1 g、KH2PO4 0.04 g、K2HPO4 0.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl2·2H2O 0.01 g、NaHCO3 2 g、L-半胱氨酸盐酸盐1 g、胆盐0.5 g、吐温-80 2 mL、消泡剂0.5 mL、维生素K1 10 μL、氯化血红素0.05 g、刃天青0.5 mL（0.2%）。消化透析后的样品以0.5%的浓度加入培养基中，pH 值调至6.8 后，灭菌（121 ℃、15 min）。
1.3.6.4 体外酵解
每个无菌管中分别装有5 mL 培养基和2%粪便滤液，在37 ℃的厌氧环境中（5%H2、5% CO2、90% N2）发酵48 h。收集发酵不同时间点的样品后立即转移到-80 ℃冰箱储存。菊粉标准品和灭菌超纯水分别作为阳性对照和阴性对照。每个样品和每个时间点均设置3个平行，每个平行单独进行。
1.3.6.5 pH 值的测定
采用台式FE-28 pH 计测定发酵样品在不同时间点的pH 值。
1.3.6.6 糖消耗率的测定
参照Yue 等[13]的方法并适当调整。试管中加入蒸馏水490 μL、发酵上清液10～100 μL、3%苯酚500 μL和浓硫酸2 mL，涡旋混匀后静置30 min，最后在490 nm处测定吸光度。配制0.1 mg/mL 标准葡萄糖溶液，梯度稀释，绘制标准曲线。糖消耗率计算公式如下。
M=（CO-CT）/CO×100
式中：M 为糖消耗率，%；CO 为初始糖浓度，mg/mL；CT 为发酵结束时的糖浓度，mg/mL。
1.3.6.7 短链脂肪酸的分析
参考Birkeland 等[14]的方法并做修改，发酵液经离心（13 000 r/min、5 min、4 ℃）后，取上清液0.5～0.7 mL、10%硫酸0.2 mL、无水乙醚0.4 mL 至EP 管。充分涡旋混匀后静置30 min，上层有机相通过0.22 μm 有机过滤器。上清液（2 μL）注入装有熔融石英（HP-FFAP，30 m×320 μm×0.25 μm，）和火焰电离检测器（GC-FID 7890B）的毛细管柱中进行分析。
1.4 数据处理与分析
试验所得数据均用平均值±标准差表示，采用SPSS 软件（版本26.0）进行单因素方差分析，用邓肯两两比较，使用Graph Pad Prism 8.0 软件制图，p＜0.05 为有差异显著性。
2 结果与分析
2.1 面条的营养成分
面条的营养成分信息如表3 所示。
表3 9 种面条的营养成分信息
Table 3 Nutritional information of 9 kinds of noodles
注：数据均为营养成分在冷冻干燥面条中的占比；同列不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
面条种类 蛋白质/%灰分/%总淀粉/%粗脂肪/%LI19.69±0.04bc 1.25±0.13b 53.60±0.25de 0.61±0.16ab LFOS18.72±0.11g1.17±0.23b53.18±1.05e0.64±0.09a LGOS 19.60±0.08bcd 1.18±0.09b 54.15±0.21de 0.68±0.06a LHACS 19.34±0.12ef 1.23±0.04b62.53±1.02a 0.60±0.07ab LBG19.51±0.08cde 1.08±0.08b53.24±0.04e0.40±0.17b LAG19.44±0.13def 1.31±0.05b 54.69±0.50cd 0.66±0.08a LAX19.71±0.13b1.08±0.04b 54.78±1.04cd 0.80±0.11a LXOS19.30±0.01f1.17±0.05b55.57±0.11c0.70±0.14a L21.62±0.05a1.88±0.24a59.23±0.49b 0.60±0.05ab
由表3 可知，9 种面条的蛋白质、灰分、总淀粉和粗脂肪的含量分别为18.72%～21.62%、1.08%～1.88%、53.18%～62.53%和0.40%～0.80%。膳食纤维添加对面条脂肪含量无显著影响。和未添加膳食纤维的蔬菜小米面条相比，8 种膳食纤维添加均显著降低面条灰分和蛋白质含量（p＜0.05）。HACS 面条的总淀粉含量显著高于其他面条（p＜0.05）。综上，添加膳食纤维后面条仍有较高的蛋白质含量，该面条有利于保证儿童每日蛋白质的充足摄入和促进儿童生长发育。
2.2 面条品质的分析
不同膳食纤维添加的面条品质见表4。
表4 不同膳食纤维添加的面条品质
Table 4 Quality of noodles added with different dietary fiber
注：同列不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
?
由表4 可知，添加膳食纤维对面条的感官评分无影响，但BG 和HACS 的添加显著改善面条的断条率（p＜0.05），这可能是由于β-葡聚糖的黏性较大以及玉米淀粉在蒸煮过程中的湿热处理提升面条的黏合性从而减少了面条的断条率[15]。
2.3 面条中类胡萝卜素的生物可及性
食物成分的生物可及性是指可被小肠吸收细胞吸收的化合物比例。类胡萝卜素生物可及性是指肠道部分胶束水相（上清液）中的类胡萝卜素浓度与其在样品中的初始浓度的比率[16]。9 种面条的类胡萝卜素生物可及性见图1。
图1 9 种面条的类胡萝卜素生物可及性
Fig.1 Bioaccessibility of carotenoids in 9 kinds of noodles
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图1 可知，不同膳食纤维对面条中类胡萝卜素的生物可及性影响不同，BG 面条和FOS 面条经消化后类胡萝卜素生物可及性显著高于其他面条（p＜0.05）。β-胡萝卜素的绝对生物可及性受食物中β-胡萝卜素的数量限制，一般认为膳食纤维的含量和种类可能通过增加食糜黏度和阻碍胶束的形成影响类胡萝卜素在肠道的释放[17-18]，但也有研究显示，在含类胡萝卜素和膳食纤维的蔬菜中添加牛油果作为脂质来源能够促进类胡萝卜素的吸收[19]，可见膳食纤维食物基质组分以及膳食纤维和脂肪比例的不同也会影响类胡萝卜素的消化和其形成胶束的程度进而影响其生物可及性。因此，膳食纤维对类胡萝卜素生物可及性的影响还有待进一步研究。
2.4 体外模拟发酵糖消耗率情况
膳食纤维是公认的有益人体健康的营养物质，可被肠道纤维降解微生物获取和代谢[20]。糖含量的变化可以反映肠道细菌对面条消化产物中碳水化合物的利用情况。图2 为体外发酵48 h 健康儿童粪便菌群对9 种面条消化物中糖的利用情况。
图2 体外发酵过程中健康儿童粪便菌群对预消化面条的碳水化合物利用情况
Fig.2 Carbohydrates utilization of pre-digested noodles during in vitro fermentation using healthy children fecal microbiota
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图2 可知，糖含量在酵解前12 h 被快速消耗，12～48 h 糖含量下降速度变缓。可能是因为酵解开始时微生物需要利用大量糖进行繁殖，12 h 后，随着糖被大量消耗以及发酵体系中产生短链脂肪酸等酸性物质，不利于微生物的生长，对糖的消耗也放缓。酵解面条组中糖消耗率显著高于菊粉对照组（p＜0.05），这可能是因为蔬菜小米面条本身含有一定量比菊粉更易被菌群利用的膳食纤维，如Umar[21]发现每100 g 小米含有0.55～13.70 g 膳食纤维。在所有膳食纤维面条中，仅AX 面条的碳水化合物消耗量显著低于面条L（p＜0.05）。研究结果表明，菊粉、低聚果糖、高直链玉米淀粉和β-葡聚糖[22-23]均易于被肠内细菌发酵的膳食纤维，而AX 复杂的结构基质使酶降解变得困难，只有部分能够产生内切木聚糖酶的微生物群才能够有效利用[24]，本研究所采用的儿童粪便菌群中可能缺乏能够分解代谢这种膳食纤维的相关微生物群。综上，膳食纤维添加的面条消化物均被粪便菌群有效利用。
2.5 体外发酵后pH 值变化
短链脂肪酸（SCFAs）由肠道微生物代谢膳食纤维产生[25]，可以降低pH 值，刺激结肠对电解质液的吸收，并为宿主提供能量[26]。因此，pH 值作为体外发酵的重要指标，可以反映发酵过程中碳水化合物的消耗情况。预消化面条和健康儿童粪便菌群体外发酵过程pH值的变化见图3。
图3 预消化面条和健康儿童粪便菌群体外发酵过程pH 值的变化
Fig.3 Changes of pH during in vitro fermentation of pre-digested noodles using healthy children fecal microbiota
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图3 可知，发酵0～12 h 时pH 值迅速下降，12～24 h 时pH 值缓慢下降。面条组在发酵过程中pH 值变化显著低于菊粉对照（p＜0.05），这可能是因为发酵12 h时面条组中糖含量几乎被消耗完，而菊粉组依旧有充足的碳水化合物供菌群利用产生乳酸和琥珀酸等[27]并降低了pH 值，这与2.4 中糖的消耗速度一致。
2.6 体外发酵中短链脂肪酸的产生情况
预消化面条和健康儿童粪便菌群体外发酵过程SCFAs 浓度的变化见图4。
图4 预消化面条和健康儿童粪便菌群体外发酵过程SCFAs 浓度的变化
Fig.4 Change of SCFAs concentrations during in vitro fermentation of pre-digested noodles using healthy children fecal microbiota
不同字母表示差异显著（p＜0.05）。
研究表明，膳食纤维的摄入（提供SCFAs）对保持健康和预防非传染性疾病非常重要[28]。如图4 所示，随着发酵过程的进行，不同面条组中SCFAs 的浓度逐渐升高，产物以乙酸、丙酸和丁酸为主。乙酸是各组中产生较多的SCFAs，高水平的乙酸生产可以通过改变菌群组成来缓解结肠炎[29]，菊粉组在发酵结束时乙酸浓度显著高于面条组，I 组和HACS 组乙酸水平显著高于L 组（p＜0.05）；在丙酸产量方面，BG 组的浓度最高；在丁酸产量方面，所有面条组的丁酸浓度显著高于菊粉对照，I 组和HACS 组丁酸浓度显著低于未添加膳食纤维的L 组。丁酸盐作为一种促进健康的因子，能够调节能量稳态、脂质代谢和炎症，其水平和儿童肥胖发生负相关[30]，该面条发酵产生大量丁酸可能在预防儿童肥胖方面发挥有益作用。饮食驱动微生物群多样性变化产生不同的SCFAs，和未添加膳食纤维的面条相比，I 组和HACS 组发酵偏向于产生较多的乙酸和较少丁酸，而BG 组容易产生更多的丙酸。在本研究中，含有膳食纤维的面条在发酵后产生的SCFAs 水平和菊粉对照无显著性差异，均降低了酵解体系的pH值，这可能对肠道健康有益。
3 结论
本研究以小米、南瓜和胡萝卜为主要成分，分别添加8 种不同的膳食纤维制备面条。对面条基本营养成分分析和采用儿童粪便菌群体外模拟消化和酵解的试验结果表明，BG 和HACS 添加显著降低了面条断条率。此外，BG 面条消化后的类胡萝卜素生物可及性显著高于其他面条。面条中不可消化糖类在与健康儿童粪便体外发酵24 h 过程中被充分利用，产生大量SCFAs，降低了发酵体系的pH 值，其中BG 添加的面条在体外发酵24 h 过程中产生了最多的短链脂肪酸。说明添加膳食纤维的面条能够被儿粪便菌群发酵改善肠道环境从而发挥对儿童健康的益处，类胡萝卜素的生物可及性因膳食纤维添加种类的不同表现不一。
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