随着科技进步和人们健康意识的提升，果醋型风味饮料越来越受人们的欢迎，果醋饮料市场存在较大的发展潜力。果醋是以果品为原料经酒精、醋酸发酵而成，具有促进食物消化、消除疲劳感和运动后肌肉酸痛、降低老年人血压、分解血胆固醇、预防动脉硬化和心血管病发生的功能，因其风味良好和优越的保健性能被人们所喜爱[1-2]。在醋酸发酵阶段，醋酸菌是影响果醋品质的关键因素[3-4]。为了提高果醋生产过程中的产酸量和酒精转化率，对醋酸菌优势菌种的分离筛选尤为重要[5-6]。白龙律等[7]从11 种水果中分离筛选得到转化能力最强的优势菌株，并通过分子生物学鉴定确定该菌株属于醋酸菌属（Acetobacter）。张甜等[8]对腐烂苹果进行分离筛选，获得A1 醋酸菌株,研究其在不同乙醇浓度的产酸量，在乙醇浓度为11%时，产酸量最高，达到8 g/L 左右。李盈等[9]在葡萄酿酒皮渣中分离鉴定得到苹果醋酸菌（Acetobacter malorum）的菌株11，并研究其乙醇浓度，温度对其产酸量的影响，发现产酸量均随乙醇浓度、温度的增加呈现先增加后减小的趋势，最高产酸量可达4.2 g/100 mL，菌株11 是一株产酸效能优良的菌种。而采用天然发酵水果山楂为原料，通过培养筛选醋酸杆菌菌5 产酸量达到37.40 g/L，菌10 达43.64 g/L，经过16S rDNA 鉴定，确定该菌株为醋酸杆菌巴氏亚种（Acetobacter pasteurianu）[10]。研究发现，从残次果中分离醋酸菌作为发酵剂，通过醋酸发酵等工艺研制出的果醋饮料不但成本更低，且适口性及各项指标均较好[11]。因此，从天然发酵水果中筛选优良菌株对酿造高品质果醋意义重大。
在果醋发酵过程中，乙醇含量、温度、酸度是影响果醋发酵的重要因素[12]。乙醇含量会影响醋酸菌细胞膜的组织结构和通透性，过高的乙醇含量会导致醋酸菌生长缓慢和产酸量偏低[13]。而温度是醋酸菌在发酵过程中生长和代谢的重要条件，当温度过高时，会使醋酸菌发酵的酶变性、细胞膜发生损伤及细胞分散[14]。醋酸菌具有复杂的耐酸机制，在乙酸浓度较大时，醋酸菌将失去氧化乙醇的能力，导致醋酸的累积不足[15]。如何从天然发酵水果中获取更多耐乙醇、耐温、耐酸发酵特性的醋酸菌菌种是目前需要解决的问题。因此，本文对7 种常见天然发酵水果中的醋酸菌进行分离鉴定，对发酵特性进行评价，以期筛选出具有优良发酵特性的醋酸菌，促进果醋产业的发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与试剂
苹果（黄元帅）、草莓（甜查理）、香瓜（伊丽莎白）、芒果（高乐蜜）、杏（黄金）、樱桃（红宝石）、百香果（紫香）：市售；醋酸菌AS1.41（恶臭醋酸杆菌）：中国微生物菌种保藏中心；酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉：上海蓝季科技发展有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒：柯意哲（上海）机电工程有限公司；硫酸镁、无水乙醇、碳酸钙、酚酞、氢氧化钠、葡萄糖、磷酸二氢钾（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.1.2 培养基
基础培养基（每100 mL）：1 g 葡萄糖、1 g 酵母膏。在121 ℃条件下灭菌20 min，冷却后加入无水乙醇后使培养基中乙醇浓度达到3%。
分离培养基（每100 mL）：1 g 葡萄糖、1 g 酵母膏、2 g 碳酸钙、2 g 琼脂粉，在121 ℃条件下灭菌20 min，待温度降到50 ℃～60 ℃后加入无水乙醇，使乙醇浓度达到3%。
斜面保藏培养基（每100 mL）：1 g 葡萄糖、1 g 酵母膏、0.05 g 磷酸二氢钾、0.05 g 硫酸镁、2 g 琼脂粉，在121 ℃条件下灭菌20 min，待温度降到50 ℃～60 ℃后加入无水乙醇，使乙醇浓度达到3%，倒入试管将其摆成斜面待其冷却后即可接种菌株。
产酸试验培养基（每100 mL）：1 g 葡萄糖，1 g 酵母膏，加入蒸馏水100 mL，在121 ℃的条件下灭菌20 min，冷却后加入6%的无水乙醇。
发酵培养基（每1 L）：葡萄糖10 g、酵母膏5 g、在121 ℃条件下灭菌20 min，取出冷却，酒精含量接种前根据具体情况加入无水乙醇（浓度3%）。
1.2 仪器与设备
A300 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：杭州郎基科学仪器有限公司；SPT-250B-Z 生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；JA3003N 电子天平：上海精密科学仪器有限公司；SYQ-DST-280B 高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；OPticlean1300 超净台：力康精密科技（上海）有限公司；DL-电炉：中兴伟业仪器有限公司；HZQ-T10 恒温振荡培养箱：苏州培英实验设备有限公司；7890-5975 气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent 公司。
1.3 方法
1.3.1 水果的天然发酵
挑选干净新鲜且无病虫害、无变质的苹果（黄元帅）、草莓（甜查理）、香瓜（伊丽莎白）、芒果（高乐蜜）、杏（黄金）、樱桃（红宝石）、百香果（紫香）7 种天然发酵水果，各切300 g 水果放置于1 000 mL 密封容器内，并且在25 ℃的无菌培养箱下自然发酵1 个月。
1.3.2 增殖培养
从7 种天然发酵水果中取10 g 果肉，放入盛有100 mL基础培养基的250 mL 三角瓶内，在转速120 r/min、温度30 ℃的振荡培养箱下培养72 h。
1.3.3 菌种的分离培养
吸取增殖培养的醪液1 mL 装入有9 mL 无菌蒸馏水试管中，配制浓度梯度为10-1 的菌悬液，用无菌水依次稀释到10-5、10-6、10-7 浓度，吸取稀释液各0.2 mL涂布于平板分离培养基，在30 ℃培养箱中倒置培养3 d，挑取培养皿中单菌落生长优势明显和丰富的菌株接种于斜面保藏培养基中，每个菌株对应水果命名，杏（T）、芒果（Y）、樱桃（C）、草莓（S）、苹果（A）、香瓜（M）、百香果（N），并按照菌落从左到右，从上到下的顺序依次加入阿拉伯数字进行编号。放入生化培养箱中待用。
1.3.4 菌株的筛选
挑取一环斜面保藏培养基中菌株接种于100 mL产酸试验培养基中，在30 ℃、120 r/min 的振荡培养箱中振荡培养6 d，测定其产酸量。试验重复3 次，取平均值。
1.3.5 菌株的分子生物学鉴定
1.3.5.1 定性试验
将筛选后的菌株放在斜面保藏培养基中培养3 d，取出参照《伯杰鉴定细菌学手册》[16]和《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化试验[17]。
1.3.5.2 醋酸菌的16S rDNA 鉴定
用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取醋酸菌DNA，将所得DNA 产物进行PCR 扩增。扩增的引物序列为27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，1492R：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T；条件为4 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 个循环，72 ℃延伸5 min。PCR 产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，置于紫外灯下观察。若出现清晰的条带且无明显非特异性扩增，即判断PCR 扩增成功[18-19]。
筛选出的菌株送至北京亿鸣复兴生物技术有限公司完成测序工作。利用NCBI 与GenBank 数据库，进行BLAST 同源性对比分析，选择与目的基因序列同源性最高的序列，选取不同的模式菌株，采用MEGA7.0软件构建系统发育树。
1.3.6 醋酸菌发酵性能的鉴定
1.3.6.1 醋酸菌生长曲线测定
将鉴定后的醋酸菌各挑取1 环接种于含有100 mL基础培养基的250 mL 锥形瓶中，置于120 r/min、30 ℃振荡培养箱中培养，每隔6 h 测定菌株在600 nm 分光光度计下的吸光度。以商业菌株AS1.41 为参照，确定种子液的最适培养时间。
1.3.6.2 乙醇浓度对发酵性能的影响
将醋酸菌活化后的种子液1 mL 接入发酵培养基中（乙醇浓度分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%），在120 r/min、30 ℃振荡培养箱中培养6 d，测定其生长量和产酸量。以醋酸菌AS1.41 为参照，每株醋酸菌重复3 次。
1.3.6.3 培养温度对发酵性能的影响
将醋酸菌活化后种子液1 mL 接入发酵培养基中，分别于27、30、33、36、39、42 ℃条件下在转速120 r/min的振荡培养箱中培养6 d，测量菌株的生长量及产酸量。以醋酸菌AS1.41 为参照，每株醋酸菌重复3 次。
1.3.6.4 乙酸含量对发酵性能的影响
将醋酸菌活化后种子液1mL 分别接种于含有0、10、20、30、40、50 g/L 的醋酸发酵培养基中，于120 r/min、30 ℃振荡培养箱中培养6 d，测量菌株的生长量及产酸量。以醋酸菌AS1.41 为参照，每株醋酸菌重复3 次。
1.3.6.5 菌株生长量及产酸量的测定
生物量以OD600nm 值表示；产酸量测定参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[20]，以乙酸计算产酸量。
1.3.7 数据统计与分析
利用BLAST 程序对16SrDNA 测序结果进行同源性比对分析。采用IBM SPSS Statistics 20 软件进行数据处理，每组试验重复3 次，取其平均值进行各数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选
菌株筛选结果见表1。
表1 产酸筛选结果
Table 1 Initial screening results of acid producing strains
?
由表1 可知，从分离培养基中筛选出菌落较大的33 株菌株，经过6 d 培养，从产酸培养基中筛选得到天然发酵水果中杏T11、芒果Y11 及Y21、樱桃C7、草莓S21、苹果A12、香瓜M8 以及百香果N8 产酸量均能达到30 g/L，此结果大于孙一帆等[21]从葡萄醋中分离筛选的醋酸菌SP001 的产酸量。因此，经过筛选获得产酸量相对较高的T11、Y11、Y21、A12、C7、S21、M8、N8八种菌株作为后续菌株进行鉴定。
2.2 菌株的生物分子学鉴定
2.2.1 菌株的生理生化鉴定
8 株菌株放大1 000 倍的革兰氏染色镜检图见图1。
图1 8 株菌株放大1 000 倍的革兰氏染色镜检图
Fig.1 The Gram stain microscopic picture of the bacterial 8 strain by 1 000 times
由图1 可知，筛选得到的8 株菌株均为革兰氏阴性菌，其形状为短杆状或椭圆状，以单个、成对存在，无芽孢。
对8 株菌进行淀粉水解、乙醇氧化、产纤维素、甘油生酮以及产酸定性试验，为其进一步的鉴定提供理论依据。生理生化试验结果见表2。
表2 生理生化试验结果
Table 2 The results of physiological and biochemical experiments
注：-表示不利用；+表示利用。
菌株 淀粉水解试验甘油生酮试验A12 - + - + +C7 - + - + +M8 - + - + +N8 - + - + +S21 - + - + +T11 - + - + +Y11 - + - + +Y21 - + - + +乙醇氧化试验产纤维素试验产酸定性试验
由表2 可知，8 株菌均能利用乙醇产生醋酸，甘油生酮、产酸定性试验中产生沉淀现象，不产生纤维素，无利用淀粉水解能力。通过《常见细菌系统鉴定手册》对比可初步确定8 株菌株均为醋酸杆菌属。
2.2.2 醋酸菌的16S rDNA 鉴定结果
将8 株菌株的16S rDNA 通过PCR 扩增后进行凝胶电泳检测，结果如图2 所示。
图2 8 株菌株的16S rDNA 的PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification products of 8 strains
如图2 所示，扩增的基因大小在1 500 bp 左右，条带整齐完整，无明显非特异扩增，得到PCR 产物无需纯化可用于序列分析，以满足后续的试验需求[22]。
2.2.3 16S rDNA 序列对比结果
将8 株菌株的16S rDNA 序列在NCBI 上进行BLAST 比对分析[23]，结果见表3。
表3 菌株16S rDNA 序列同源分析鉴定
Table 3 Identification of isolates based on 16S rDNA sequencing
?
如表3 所示，成功鉴定出这8 株菌株均为醋酸菌属（Acetobacter），其中包括5 株Acetobacter tropicalis，1株Acetobacter fabarum，2 株Acetobacter senegalensis，可见天然发酵水果中具有较丰富的醋酸菌。苹果、草莓、香瓜、芒果、杏、樱桃、百香果7 种天然发酵水果中Acetobacter tropicalis 菌株较多，具有明显生长的优势，此结果与梁丛颖等[24]通过自然发酵汁种筛选出的最多的醋酸菌Acetobacter fabarum，石庆叠等[25]在赤水晒醋中筛选的Acetobacter pasteurianus 以及郭梦瑶等[26]在柿子醋醋醅中分离筛选的Acetobacter xylinum 不同种。因此，本研究在7 种天然发酵水果中筛选醋酸菌，发现不同水果中的醋酸菌具有相同的菌株，在其他文献中未见相同结论。
2.2.4 系统发育树的构建
醋酸菌的16S rDNA 的系统发育树见图3。
图3 醋酸菌的16S rDNA 的系统发育树
Fig.3 The Phylogenetic tree of acetobacter acid bacteria based on their 16S rDNA sequences
如图3 所示，系统发育树显示所筛选8 株醋酸菌，其中C7 与A12 具有相同的Acetobacter tropicalis strain HWWW67 16S 分支，T11 与Acetobacter tropicalis strain HWWW112 16S 在同一分支，M8 和Y21 与多个Acetobacter tropicalis 处于同一分支。S21 和Acetobacter fabarum strain KF27 16S 在一个分支。M8 和Y11 与多个Acetobacter senegalensis 分支具有较高的相似度。综合菌落形态学特征、生理生化特征试验结果、16S rDNA 序列同源性比较及系统发育树分析结果，鉴定筛选8 株醋酸菌株，其中百香果N8、芒果Y21、苹果A12、杏T11、樱桃C7 为热带醋酸杆菌（Acetobacter tropicalis），草莓S21 为可可豆醋酸杆菌（Acetobacter fabarum），香瓜M8 和芒果Y11 为塞内加尔醋杆菌（Acetobacter senegalensi），16S rDNA 序列分析发现无其他杂菌序列，确定为醋酸菌种。
2.3 发酵特性测定结果
2.3.1 菌株生长曲线
醋酸菌生长曲线见图4。
图4 醋酸菌生长曲线
Fig.4 Growth curves of acetic acid bacteria
由图4 可知，8 株醋酸菌和AS1.41 的生长曲线趋势相同，大部分菌株的对数期在0～48 h 之间，其中菌株S21 生长量最少，OD600 nm 最大为0.983；C7、M8、Y21与AS1.41 最大生长量无明显差异，OD600 nm 均能够达到1.108 以上且不超过1.200；A12、N8、T11 生长量都大于1.200。其中，T11 的菌生长量最大为1.280。说明筛选出的菌株S21 具其他菌株相比，适应该条件能力较弱。C7、M8、Y21、Y11 有和AS1.41 相似的生长对数期。
由图4 可知，8 株醋酸菌均有相同的对数生长期，在对数生长期的醋酸菌菌种活性和繁殖能力最强、生长代谢活跃、对外界环境相对敏感，此阶段进行接种和后续试验可使醋酸菌菌体活性达到最佳状态[27]，因此确定各菌株种子液培养时间确定为48 h。
2.3.2 乙醇浓度对菌株发酵性能影响
不同乙醇浓度对8 株纯醋酸菌的生长量和产酸量的影响如图5 所示。
图5 乙醇浓度对8 株菌生长量和产酸量的影响
Fig.5 Effect of ethanol content on growth and producing acid amount of eight pure strains
由图5 可知，随着乙醇浓度的增加，不同醋酸菌均呈现生长量逐渐下降，产酸量先增加后下降的趋势。8 株菌的生长量均在乙醇浓度为2%时达到最大值，其中Y21 和N8 在此时的生长量无明显差异，且Y21 的OD600nm=1.750 明显高于AS1.41。当乙醇浓度达到10%时，除T11（OD600 nm=0.471）外，其余菌株均停止生长，原因是由于乙醇既是醋酸菌生长的必要物质，也是醋酸菌发酵的底物，乙醇含量较高时将会抑制醋酸菌的生长和代谢速率[28]，因此T11 能够适应较高的乙醇浓度。在产酸量方面，N8、A12、Y11、T11、C7 和AS1.41 在乙醇浓度6%时产酸量最高，其余S21、M8、Y21 在乙醇浓度4%时产酸量最高，说明乙醇浓度较低时不利于醋酸菌的产酸代谢。N8、A12、T11、Y21 最大产酸量均高于商业菌株AS1.41，且均大于30 g/L，其中T11 明显高于AS1.41，达到36.36 g/L。当乙醇浓度大于8%时，8 株醋酸菌的OD600 nm 值和产酸量都受到不同程度的抑制，Y21、Y11 受抑制影响程度较重，故其耐乙醇能力较弱。此结果与张志燕等[29]在香醋的醋醅中筛选醋酸菌D-3-4，乙醇含量为5%～11%时，产酸量随着乙醇含量的上升而下降的研究结果基本一致。综合推断，N8、A12、T11、Y21 对不同乙醇浓度有较高的适应性，故可作为未来果酒酿造果醋的优势菌株。
2.3.3 温度对菌株发酵性能影响
醋酸菌的不同种属具有不同的最适生长温度。在一定的温度范围内，温度的适度增加有利于醋酸菌的生长及代谢，当温度过高时，会引起醋酸菌菌体老化、产酸量降低，导致菌体内酶结构被破坏，甚至停止生长繁殖[30]。温度对8 珠菌生长量和产酸量的影响见图6。
图6 温度对8 株菌生长量和产酸量的影响
Fig.6 Effect of temperatures on growth and producing acid of eight pure strains
由图6 可知，在一定范围内随着温度的升高，醋酸菌的生长速率和产酸代谢速率呈现先升高后下降的趋势。此结果与董书阁[31]在苹果醋中选育及发酵醋酸菌菌株的工艺发现醋酸菌受温度的影响相同。在30 ℃时，菌株与对照菌株AS1.41 相比，A12、N8 生长量均大于AS1.41，分别为1.742 和1.783，T11 以及Y21 的生长量小于AS1.41，其余各菌生长量均明显低于AS1.41。在30 ℃时，T11 的产酸量大于AS1.41，达到35.76 g/L。其余菌株产酸量均低于AS1.41。说明T11 在30 ℃的产酸量最高，酶活性最好。在27 ℃～42 ℃范围内，9 株菌在27 ℃～36 ℃醋酸菌的生长量和产酸量波动相对较小，醋酸菌菌株在此范围内影响较小，当温度达到39 ℃时，A12、T11、Y21 和AS1.41 生长量大于0.400，产酸量大于10 g/L，仍然具有一定的产酸量，说明该条件下，具有较高的乙醇利用率，能产生较多的乙酸。
2.3.4 乙酸含量对菌株发酵性能的影响
乙酸含量对8 株菌生长量和产酸量的影响如图7所示。
图7 乙酸含量对8 株菌生长量和产酸量的影响
Fig.7 Effect of acetic acid content on growth and acetic acid production of eight pure strains
如图7 所示，乙酸含量的增加使除AS1.41 外，其他8 株菌株生长量和产酸量呈现下降趋势，乙酸含量对醋酸菌的影响较大。当乙酸含量由0 g/L 增加到10 g/L时，9 株菌株的生长量下降，此时T11 具有最高生长量。乙酸含量到达20 g/L，产酸量均下降，Y21 产酸量最高，为22.62 g/L。当乙酸含量到达40 g/L 时，N8、A12、T11、Y21 均产少量酸，比对照菌株AS1.41 产酸量高，其中的Y21 产酸量最大，为8.86 g/L，其它菌株几乎停止产酸。说明AS1.41 和S21、Y11、C7、M8 在过酸、碱性环境下不宜生长繁殖和代谢，且由于机体中的大多数反应与酶有关，过酸、过碱都会导致酶活力降低，从而导致产酸速率和产酸量下降[32]。同时，也说明了在相同发酵条件下N8、A12、T11、Y21 均具有较高的耐酸性，其中Y21 的耐酸性最大。
3 结论
从7 种天然发酵水果中增殖、分离培养得到29 株菌，其中8 株产酸量大于30 g/L 的醋酸菌株，经过生理生 化 和16S rDNA 鉴 定，Acetobacter tropicalis 5 株、Acetobacter senegalensis 2 株、Acetobacter fabarum 1 株。对这8 株醋酸菌与AS1.41 进行耐乙醇、耐温、耐酸的发酵特性比较。结果表明Acetobacter tropicalis N8、A12、T11、Y21 具有良好的生长特性，发酵产酸能力强，因此可考虑作为优势醋酸菌株。本试验对天然发酵水果醋酸菌的多样性及耐受性进行研究，不仅丰富了水果中醋酸菌种属信息，同时为相关发酵产品的开发利用提供参考。
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