盐地碱蓬（Suaeda salsa）又称黄须菜，含有蛋白质、矿物质、维生素、膳食纤维和黄酮类等多种物质[1]，其鲜嫩茎叶中蛋白质含量非常高，约占干物质的40%[2]。本课题组前期确定了盐地碱蓬的粗蛋白最佳提取工艺条件，发现其具有良好的持油性、溶解度、乳化性、起泡性和体外抗氧化性[3]，有望开发成优质的植物蛋白。
蛋白质的营养价值和功能特性是蛋白深度开发和利用的基础。目前，大豆蛋白是公认的营养价值较高的植物蛋白，也是一种全价蛋白，其价格相对较高[4]。盐地碱蓬广泛分布在我国盐碱地，只有少量作为饲料应用，将其开发利用有一定的实用价值。本文采用高效液相色谱测定盐地碱蓬蛋白质中氨基酸的组成和含量，对比参照联合国粮农组织和世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）模式标准、全鸡蛋蛋白标准以及大豆分离蛋白的氨基酸组成对其进行营养价值评价，以期为盐地碱蓬蛋白在食品方面的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
盐地碱蓬嫩茎叶：采摘于曹妃甸生态城华北理工大学校园及周边湿地（经华北理工大学药学院刘春艳教授鉴定）。摘取其叶子洗净，经30 ℃干燥、风选，采用粉碎机粉碎后，过140 目网筛，得盐地碱蓬粉，密封常温储存备用。
异硫氰酸苯酯、乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、辛烷磺酸钠、邻苯二甲醛、磷酸、胃蛋白酶（1∶3 000 U/mg）、胰蛋白酶（1∶250 U/mg）、甘氨酸、缬氨酸、L-亮氨酸、D-精氨酸、D-酪氨酸、D-脯氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、D-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、D-丝氨酸、D-天冬氨酸、D-蛋氨酸、D-谷氨酰胺、L-天冬酰胺（均为色谱纯）：麦克林生物有限公司；石油醚、乙酸、氢氧化钠、乙腈、甲醇、三乙胺、正己烷、盐酸（均为色谱纯）：天津市津东天正精细化学试剂；纯净水：哇哈哈集团有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9053BS-Ⅲ烘箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；FW-177 粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；S400-B pH 计：梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司；SHB-3 循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE-52AA 旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；RET basic 磁力加热搅拌器：广州仪器设备有限公司；KQ-300DE 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；XZ-16T 高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；移液枪：德国Eppendorf 公司；LC-2030 高效液相色谱仪：日本岛津公司；0.22 μm 有机过滤器、0.45 μm 有机过滤器：天津津隆医药科技发展有限公司；C18 高效液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：北京迪马科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 盐地碱蓬脱脂粉末的制备
盐地碱蓬整株植株去除根部并清洗，30 ℃烘箱内干燥。干燥后将盐地碱蓬剪成3 cm～5 cm 的小段，用粉碎机粉碎，过140 目分离筛。将粉碎好的盐地碱蓬粉末按9 mL/g 的比例加入石油醚并搅拌均匀，在4 ℃下，超声脱脂处理30 min，低温静置1 h 后抽滤，滤饼置于30 ℃烘箱中烘干，得脱脂盐地碱蓬粉，密封保存。
1.3.2 盐地碱蓬中的蛋白质含量的测定
采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定蛋白质含量。
1.3.3 盐地碱蓬中的蛋白质中相对分子质量的测定
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）测定蛋白质相对分子质量[5]。将先前课题组碱溶酸沉法提取的盐地碱蓬蛋白配制成10 mg/mL的蛋白溶液，按4∶1 的体积比加入5×SDS 上样缓冲液（含二硫苏糖醇），将样品摇匀，100 ℃煮沸10 min，10 000 r/min 离心5 min，上样量为15 μL。10%和5%分别作为分离胶和浓缩胶的浓度，起初电流10 mA，进入分离胶后20 mA，电泳时间2.5 h～3.5 h，考马斯亮蓝染色。
1.3.4 盐地碱蓬的氨基酸组成的测定
对柱前衍生高效液相色谱法进行改进[6]，测定盐地碱蓬蛋白中20 种常见氨基酸，采用外标法峰面积定量[7-8]。
其中17 种氨基酸测定的色谱条件为色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速：0.8 mL/min，进样量10 μL，柱温38 ℃，检测波长254 nm，流动相A：0.1 mol/L 无水乙酸钠∶乙腈体积比97∶3，混合均匀，调pH6.5（31.815 g 乙酸钠+3 880 mL 水+120 mL 乙腈）；流动相B：乙腈∶水体积比80∶20。
色氨酸测定的色谱条件为色谱柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.2 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测波长254 nm。流动相A：0.05 mol/L 磷酸二氢钾∶乙腈体积比98∶2；流动相B：乙腈。
谷氨酰胺测定的色谱条件为色谱柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.2 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测波长210 nm。流动相A：甲醇∶乙腈∶水体积比45∶45∶10；流动相B：40 mmol/L 磷酸氢二钠溶液，调节pH7.5～7.8。
天冬酰胺测定的色谱条件为色谱柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温40 ℃，检测波长338 nm。流动相A：甲醇∶乙腈∶水体积比45∶45∶10；流动相B：40 mmol/L 磷酸氢二钠溶液，调节pH7.5～7.8。
1.3.5 营养评价
计算氨基酸比值（ratio of amino score，RAA）、必需氨基酸比值系数（essential amino acid ratio coefficient，RC）、必需氨基酸比值系数评分（essential amino acid ratio coefficient，SRC）、必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）、营养指数（nutritional index，NI）和化学评分（chemical score，CS）[9]，FAO/WHO 模式标准、全鸡蛋蛋白标准以及大豆分离蛋白标准模式评价盐地碱蓬蛋白质的营养价值。计算公式如下。
式中：Ax 为待测蛋白质中某氨基酸含量，mg/g；As为FAO/WHO 模式中相应氨基酸含量，mg/g；CV 为变异系数；n 为比较的必需氨基酸（essential amino acid，EAA）个数；pp 为待测蛋白质的百分含量；Ae 为待测蛋白质中EAA 总含量；Ex 为标准鸡蛋白中相应EAA含量；Ee 为标准鸡蛋白中EAA 总含量。
2 结果与讨论
2.1 盐地碱蓬中的蛋白含量分析
结果显示盐地碱蓬叶子粉（简称全粉）中粗蛋白含量为（20.77±0.05）%，脱脂粉中粗蛋白含量为（24.09±0.02）%，表明盐地碱蓬叶子富含蛋白质。
2.2 盐地碱蓬中的蛋白质相对分子质量分析
盐地碱蓬蛋白的SDS-PAGE 结果分析见图1。
图1 盐地碱蓬蛋白的SDS-PAGE 结果分析
Fig.1 Analysis of SDS-PAGE results of proteins from Suaeda salsa
由图1 可知，盐地碱蓬蛋白约含有8 条亚基，分子量主要集中在10 kDa～70 kDa，其中10 kDa～15 kDa 有2 条带，一深一浅，说明这两个分子量蛋白质含量一多一少；15 kDa～35 kDa 有3 条带，两深一浅，即蛋白质含量两多一少；35 kDa～70 kDa 有3 条带，均较深，表明这段分子量的蛋白质含量较多。大豆中蛋白质分子量主要集中在29.2 kDa 以上，大分子量蛋白比较多，平均分子量比较大[10]，而盐地碱蓬蛋白质中蛋白分子量较小，易被人体吸收利用，易开发成营养物质[11]。
2.3 盐地碱蓬中20 种氨基酸HLPC 色谱图
17 种标准氨基酸标准品混合溶液HPLC 色谱图见图2。
图2 17 种标准氨基酸标准品混合溶液HPLC 色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of a mixture of 17 standard amino acid standards
盐地碱蓬蛋白中含有的17 种氨基酸HPLC 色谱图见图3。
图3 盐地碱蓬蛋白中含有的17 种氨基酸HPLC 色谱图
Fig.3 HPLC chromatograms of 17 amino acids contained in the protein of Suaeda salsa
色氨酸标准品HPLC 色谱图见图4。
图4 色氨酸标准品HPLC 色谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of tryptophan standard
盐地碱蓬中含有的色氨酸HPLC 色谱图见图5。谷氨酰胺标准品HPLC 色谱图见图6。盐地碱蓬中含有的谷氨酰胺HPLC 色谱图见图7。天冬酰胺标准品HPLC 色谱图见图8。盐地碱蓬中含有的天冬酰胺HPLC 色谱图见图9。
图5 盐地碱蓬中含有的色氨酸HPLC 色谱图
Fig.5 HPLC chromatogram of tryptophan in Suaeda salsa
图6 谷氨酰胺标准品HPLC 色谱图
Fig.6 HPLC chromatogram of glutamine standard
图7 盐地碱蓬中含有的谷氨酰胺HPLC 色谱图
Fig.7 HPLC chromatogram of glutamine contained in Suaeda salsa
图8 天冬酰胺标准品HPLC 色谱图
Fig.8 HPLC chromatogram of asparagine standard
图9 盐地碱蓬中含有的天冬酰胺HPLC 色谱图
Fig.9 HPLC chromatogram of asparagine contained in Suaeda salsa
GB/T 30987—2020 《植物中游离氨基酸的测定》中规定了21 种游离氨基酸[12]，徐红娟[13]从盐地碱蓬中分离得到了18 种，本研究在此基础上对柱前衍生高效液相色谱法进行改进，实现了20 种氨基酸的完全分离，仅γ-氨基丁酸未能测出。本方法简单易行，选择性好，灵敏度高，适用于盐地碱蓬中氨基酸的测定。
2.4 盐地碱蓬中氨基酸组成及含量
盐地碱蓬蛋白质氨基酸的含量及组分分析如表1所示。
表1 盐地碱蓬蛋白的20 种氨基酸组分分析
Table 1 Analysis of 20 amino acid components of protein from Suaeda salsa
峰号 氨基酸 回归方程 R2 含量/（mg/g）百分比/%1 天冬氨酸（Asp） y=1 959 681.5x-4 874.8 0.999 8 65.844±0.05 7.75 2 谷氨酸（Glu） y=1 921 169.2x-164 807.8 0.999 2 75.52±0.04 10.12 3 丝氨酸（Ser） y=2 337 440.7x+3 459.5 0.999 1 36.08±0.02 4.09 4 甘氨酸（Gly） y=4 063 7 21.6x+45 349.9 0.999 4 40.72±0.07 4.60 5 组氨酸（His） y=193 388.5x-26 751.3 0.999 3 18.80±0.02 2.21 6 精氨酸（Arg） y=1 128 569.7x-13 245.6 0.999 7 50.00±0.02 5.63 7 苏氨酸（Thr） y=2 162 107.3x+49 334.8 0.999 5 35.92±0.04 3.99 8 丙氨酸（Ala） y=4 003 169.7x+251.4 0.999 5 39.60±0.03 4.38 9 脯氨酸（Pro） y=2 511 484.1x+112 133.5 0.999 0 130.4±0.08 15.18 10 亮氨酸（Leu） y=1 494 706.3x-384.2 0.999 8 56.24±0.05 8.63 11 酪氨酸（Tyr） y=1 195 492.2x+114 436.5 0.999 5 26.80±0.02 2.96 12 缬氨酸（Val） y=2 690 074.9x+15 292.9 0.999 7 43.12±0.06 4.48 13 蛋氨酸（Met） y=2 104 644.4x-88 343.9 0.999 2 21.68±0.07 3.33 14 半胱氨酸（Cys） y=1 874 463.5x+27 086.3 0.999 5 39.36±0.04 4.03 15 异亮氨酸（Ile） y=2 511 873.5x+80 108.4 0.999 6 61.60±0.02 8.18 16 苯丙氨酸（Phe） y=1 820 758.2x+59 837.5 0.999 5 42.40±0.03 4.53 17 赖氨酸（Lys） y=3 976 452.9x-43 256.1 0.999 0 42.96±0.05 4.77 18 色氨酸（Trp） y=6 128.4x+362.2 0.999 5 7.58±0.07 0.61 19 谷氨酰胺（Gln） y=785.65x-4.309 6 1 2.61±0.03 0.21 20 天冬酰胺（Asn） y=7 679 289.0x+162 042.1 0.999 1 3.90±0.01 0.31药效氨基酸 456.96 54.33总氨基酸（T） 841.13必需氨基酸（E） 377.67非必需氨基酸（N） 460.83（E/T）/% 45.21（E/N）/% 82.53
由表1 可知，盐地碱蓬总氨基酸含量为841.13 mg/g，必需氨基酸含量占比为44.90%，高于大豆蛋白（38.5%）和FAO/WHO 标准（36%）[14]。其中脯氨酸含量最高达130.4 mg/g。有研究表明，脯氨酸通过抑制血管紧张素转化酶从而发挥抗高血压的作用[15]。盐地碱蓬含有Arg、Gly、Asp、Glu、Lys、Tyr、Met、Leu、Phe 全部9 种药效氨基酸[16]，含量占比为54.33%，具有较高的药用价值。
盐地碱蓬蛋白中主要味觉氨基酸的含量见表2。
表2 盐地碱蓬蛋白中主要味觉氨基酸的含量
Table 2 Content of main taste amino acids in protein of Suaeda salsa
?
氨基酸根据风味不同被分为无味[17]、鲜味[18]、甜味和苦味4 种[19]。如表2 所示，盐地碱蓬中，鲜味和甜味氨基酸含量占37.50%远高于苦味氨基酸。
必需氨基酸组成比较见表3。
表3 必需氨基酸组成比较
Table 3 Comparison of essential amino acid composition mg/g 蛋白
必需氨基酸 盐地碱蓬大豆分离蛋白苏氨酸（Thr） 35.92 40 47 30.1缬氨酸（Val） 43.13 50 66 42.7异亮氨酸（Ile） 61.60 40 54 40.9亮氨酸（Leu） 56.24 70 86 67.6苯丙氨酸（Phe）+酪氨酸（Tyr） 69.20 60 93 70.6赖氨酸（Lys） 42.96 55 70 47.9蛋氨酸（Met）+胱氨酸（Cys） 61.04 35 57 16.9色氨酸（Trp） 7.58 10 10 10.0总含量 377.67 360 483 326.7 FAO/WHO模式全鸡蛋蛋白模式
如表3 所示，盐地碱蓬中总必需氨基酸含量高于WHO/FAO 模式标准和大豆分离蛋白，其中Ile、Phe+Tyr、Met+Cys 含量分别高于WHO/FAO 模式标准，Ile 和Met+Cys 含量分别高于全鸡蛋蛋白模式，Thr、Val、Ile、Met+Cys 含量分别高于大豆分离蛋白。表明盐地碱蓬蛋白是营养价值相对较高且有营养特色的植物蛋白。
2.5 营养评价结果
RAA 是被测蛋白中必需氨基酸的含量与FAO/WHO 模式之比[9]。
盐地碱蓬必需氨基酸比值、氨基酸比值系数、氨基酸比值系数评分结果见表4。
表4 盐地碱蓬必需氨基酸中比值、氨基酸比值系数、氨基酸比值系数分结果
Table 4 The ratio of essential amino acids，amino acid ratio coefficient and amino acid ratio coefficient of Suaeda salsa
?
如表4 所示，盐地碱蓬蛋白中Met+Cys 含量为FAO/WHO 模式的1.74 倍。RC 值越接近1，表明被测蛋白中氨基酸组成与FAO/WHO 模式越接近，RC＞1 说明氨基酸过剩，RC＜1 说明氨基酸含量不足，RC 值最小为第一限制氨基酸。Trp 为盐地碱蓬蛋白质第一限制氨基酸，说明盐地碱蓬中色氨酸（Trp）相对不足，Phe+Tyr 的RC 值为1.06，表明盐地碱蓬蛋白中Phe+Tyr 组成与FAO/WHO 模式最接近，同时Ile、和Met+Cys RC值都大于1，说明盐地碱蓬中这3 种氨基酸相对过剩。异亮氨酸（Ile）被用于治疗神经系统疾病、厌食和贫血等，还具有增强机体免疫力的功效[20]，蛋氨酸（Met）具有促进肠道消化吸收和维持肠道屏障的功效[21]。蛋白利用率方面，氨基酸过剩或不足都会影响其营养价值，因此盐地碱蓬可以与其他蛋白互补来提高营养价值[22]。SRC 值越接近100，被测蛋白质必需氨基酸的分散性越好，营养价值越高。盐地碱蓬蛋白质的SRC 值为68.60，营养价值良好，接近大豆（78.08）[10]。
盐地碱蓬中必需氨基酸的必需氨基酸指数、营养指数结果见表5。
表5 盐地碱蓬中必需氨基酸的必需氨基酸指数、营养指数结果
Table 5 Results of essential amino acid index and nutritional index of essential amino acids in Suaeda salsa
?
EAAI 值越接近100，被测蛋白质EAA 组成与全鸡蛋蛋白越接近[23]。如表5 所示，盐地碱蓬蛋白质的必需氨基酸指数70.16 接近于100，因此盐地碱蓬是一种良好的蛋白质来源。NI 是综合了蛋白质含量与其氨基酸组成的评价参数[24]，盐地碱蓬蛋白质的必需氨基酸营养指数为16.84，略低于大豆（29.62）[22]。
盐地碱蓬中必需氨基酸的化学评分结果见表6。
表6 盐地碱蓬中必需氨基酸的化学评分结果
Table 6 Chemical scoring results of essential amino acids in Suaeda salsa
苏氨酸（Thr） 缬氨酸（Val） 异亮氨酸（Ile） 亮氨酸（Leu） 苯丙氨酸（Phe）+酪氨酸（Tyr） 赖氨酸（Lys） 蛋氨酸（Met）+胱氨酸（Cys） 色氨酸（Trp）0.98 0.84 1.46 0.84 0.95 0.79 1.37 0.97
CS 值越接近1，被测蛋白质中EAA 相对含量与全鸡蛋蛋白越接近[25]。如表6 所示，Phe+Tyr、Trp 和Thr都比较接近1，表明盐地碱蓬蛋白在营养价值上与全鸡蛋蛋白接近。
3 结论
本研究对盐地碱蓬蛋白的基本组分和营养价值进行分析和评价。在蛋白含量方面：盐地碱蓬的全粉和脱脂粉中蛋白含量分别为20.77%和24.09%，表明盐地碱蓬中蛋白质含量比较丰富，且蛋白分子量较小，更容易被人体吸收。在氨基酸组成方面：盐地碱蓬中氨基酸组成种类齐全，包含有20 种氨基酸，总氨基酸含量为841.13 mg/g，其中必需氨基酸占总氨基酸的44.90%，达到了FAO/WHO 推荐的理想蛋白标准。在营养价值方面：从RAA、RC、SRC、EAAI、NI 对盐地碱蓬进行非生物学评价，均显示出优良的营养价值。因此，盐地碱蓬可以作为一种优质的植物蛋白资源进行开发利用。
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