食源性致病菌通常指摄取了随食物或饮水进入人体中的致病性细菌后，引起人畜共患传染病的病原菌[1]。由致病菌污染引起的疾病严重威胁着人们的健康，并且已经被认为是全球重大公共安全问题之一[2]。致病菌污染可导致反复的肠道刺激、败血症、感染性休克，甚至死亡[3-5]。因此，致病菌的早期检测和表征对于食品安全分析和环境监测是十分必要的。食品中致病菌的传统检测方法一般包括样品均质化、微生物培养以及生化鉴定[6]。虽然这种测定方法准确可靠，但操作步骤过于繁琐[7]，耗时较长[8]。因此，迫切需要建立更为快速简便的检测技术以应对新的食品安全挑战。
目前，生物传感器由于其准确性好，灵敏度高等优势被广泛用于细菌的识别和检测，并作为食品分析和食品安全监测有效的方法之一，引起了学者极大的兴趣[9-12]。大多数生物传感器只能对致病菌进行检测，并不能对检测后的致病菌进行清除，这会导致细菌在传感器表面存活，甚至大量繁殖形成更为顽固的生物膜，进而对检测人员的身体健康和传感器的灵敏度都造成不利的影响。因此，在检测过程中杀死致病菌是另一个需要实现的重要目标。
光热疗法（photothermal therapy，PTT）是一种新型的基于热疗的致病菌杀死策略，它依靠光热剂（photothermic agent，PTA）在适当的光照射下产生的局部热量，致使细胞膜破裂，蛋白质变性和不可逆的细菌损伤，进而杀死细菌[13-15]。PTT 相对于传统的杀菌剂杀菌方式有其独特的优点，比如对多种病原体（包括耐药细菌和生物膜）具有广谱抗菌活性，治疗时间短（只需几分钟）且对细菌的抗性可以忽略[16]。因此，本研究分别以大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）为研究对象，探讨了CuS NPs 浓度、4-巯基苯硼酸（4-mercaptophenylboronic acid，4-MPBA）浓度以及光照时间对合成的CuS@MPBA NPs 光热性能的影响，从而得出反应的最佳条件，在此条件下利用CuS@MPBA NPs 的光热信号对致病菌进行检测，原理如图1 所示。
图1 CuS@MPBA NPs 检测及杀菌原理示意图
Fig.1 Schematic diagram of detection and sterilization of CuS@MPBA NPs
CuS@MPBA NPs 与致病菌表面糖类物质的顺式二醇结合，吸附在致病菌表面，形成CuS@MPBA NPs 和致病菌的复合物，激光对复合物持续照射，利用CuS@MPBA NPs 的光热特性产生光热信号，对致病菌进行检测，同时利用CuS@MPBA NPs 在检测过程中产生的热实现对致病菌的杀死，减少了检测完成后的二次污染，可以实现食品中致病菌的快速检测，对食品安全控制具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Cu（NO3）2·3H2O：上海麦克林生化科技有限公司；Na2S·9H2O、牛血清蛋白：上海阿拉丁试剂有限公司；NaCl、NaOH（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）：广东省微生物菌种保藏中心；胰蛋白胨、琼脂、酵母提取液：北京索莱宝科技有限分公司；牛肉膏：天津市赛默飞实验室仪器销售中心；脱脂牛奶：市售。
1.2 仪器与设备
电子分析天平（BT25S）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；超声波清洗机（SB-120DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；微量台式高速离心机（H1650-W）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；808nm 激光激发器（220VAC）：海特光电有限责任公司；恒温培养箱（DHP-2042 BS）：美国Thermo 有限公司；漩涡振荡器（Vortex-Genie-2）：上海仪电科学仪器股份有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2600）：岛津仪器（苏州）有限公司；红外热成像仪（225s）：美国FOTRIC 公司。
1.3 方法
1.3.1 CuS@MPBA NPs 的制备
用天平准确称取250 mg 牛血清蛋白，溶于7.5 mL超纯水中并充分振荡至其完全溶解，随后向混合溶液中加入1 mL 0.2 mol/L 的Cu（NO3）2，得到蓝色混合物后快速加入0.5 mL 1 mol/L 的NaOH 继续进行磁力搅拌，混合物变成紫色，最后加入2 mL 0.2 mol/L 的Na2S，溶液颜色立即变成砖红色；将配制好的砖红色溶液90 ℃水浴0.5 h，颜色逐渐变为深绿色，形成CuS NPs。将制得的CuS NPs 透析纯化24 h，冷冻干燥，4 ℃保存备用。
用天平准确称取0.015g 的4-MPBA 溶于1mL 乙醇中，随后将4-MPBA 加入到制得的CuSNPs 中，使用漩涡振荡器将二者充分振荡2h，得到CuS@MPBANPs 溶液。
1.3.2 CuS@MPBA NPs 的表征
利用紫外可见分光光度计获得CuS NPs 和CuS@MPBA NPs 的光学吸收图谱，以验证CuS NPs 和CuS@MPBA NPs 的光学性质。
1.3.3 CuS@MPBA NPs 的光热稳定性表征
将制得的CuS@MPBA NPs 用808 nm 的激光照射5 min 后，关闭激发器，使其温度自然降低，在此过程中每隔60 s 记录一次溶液的温度数据，待降低到原始温度时，再用相同功率的激光进行照射，升温-降温过程重复4 次，并绘制温度循环曲线图。
1.3.4 检测致病菌原理验证
配制3 种不同的溶液分别为Ⅰ：CuS NPs+E.coli；Ⅱ：CuS@MPBA NPs；Ⅲ：CuS@MPBA NPs+E.coli。将上述溶液3 000 r/min 离心5 min 取沉淀，用808 nm 的激光分别对沉淀进行持续照射，照射时间为5 min，用红外热成像仪测定激光照射完成后的温度。
1.3.5 条件优化
1.3.5.1 优化CuS@MPBANPs 的浓度
选取CuS@MPBA NPs 的浓度为20、50、100、150、200 mmol/L，用功率密度为3.0 W/cm2 的激光（808 nm）对其进行照射，时间为5 min，每隔30 s 使用红外热成像仪拍照记录温度图像，并根据图像记录的温度绘制出温度变化曲线图，以评价各自的光热性能。
1.3.5.2 优化4-MPBA 浓度
将100 μmol/L 的CuS@MPBA NPs 分成5 组，分别向其中加入不同量的4-MPBA，使得溶液中4-MPBA的浓度分别为50、100、150、200 μg/mL，用功率密度为3.0 W/cm2 的激光（808 nm）对其进行照射，时间为5 min，记录照射完成时溶液的温度，以确定最佳的4-MPBA的浓度。
1.3.5.3 优化照射时间
将经洗涤稀释后的E.coli 加入到100 μmol/L 的CuS@MPBANPs 中，使用漩涡振荡器充分振荡混合均匀，离心取沉淀，用功率密度为3.0 W/cm2 的激光（808 nm）对其照射不同时间，分别为1、2、3、4、5 min 和6 min 并记录对应温度，以选择激光照射的最佳照射时间。
1.3.6 细菌的检测
通过对CuS@MPBA NPs 浓度、4-MPBA 浓度、照射时间进行优化，确立了反应的最优条件。固定CuS@MPBA NPs 浓度为100 μmol/L，4-MPBA 浓度为100 μg/mL，照射时间为3 min。
在该反应条件下，CuS@MPBA NPs 分别与不同浓度的（10、102、103、104、105、106 CFU/mL 和107 CFU/mL）的E.coli 和S.aureus 孵育。3 000 r/min 离心5 min 后，取沉淀，用808 nm 激光对沉淀照射3 min，利用红外热成像仪监测照射完成时的温度变化。重复上述操作3 次，确定温度与细菌浓度变化的关系，用于温度传感器对细菌的定量检测。
1.3.7 市售牛奶的加标回收试验
由于E.coli 和S. aureus 在环境中分布范围广且有极强的适应能力，因此极有可能出现在大多数食品中。为了验证本试验中构建的CuS@MPBA NPs 一体化平台在实际样品中的可行性，使用牛奶作为实际样品对其进行加标回收试验。将在实际样品中加标回收的检测值与线性范围内S.aureus 和E.coli 的理论值进行数据分析，最后根据公式计算样品加标回收率，从而验证该体系的精确度。
由于脱脂过程较为复杂，因此购买脱脂牛奶，以避免脂质对试验体系的干扰。同时，为了去除蛋白质的干扰，将牛奶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液体积比为1∶1 混合，测得pH4.7，水浴锅40 ℃加热30 min 后装入离心管，1×104 r/min 离心10 min，除去下层沉淀的蛋白质，吸取上层液体稀释1 000 倍后放入4 ℃冰箱待用[17]。根据以上步骤进行检测，并采用涂布平板法验证待测牛奶中是否还有E.coli 和S.aureus。向牛奶中分别添加不同浓度的E.coli 和S.aureus（103、104、105CFU/mL）作为添加目标物，验证其杀菌效果。固定CuS@MPBANPs 浓度为100 μmol/L，4-MPBA 浓度为100 μg/mL，分别向缓冲液中加入终浓度为103、104、105 CFU/mL 的E.coli 和S.aureus，用功率密度为3.0 W/cm2 的激光（808 nm）照射3 min。每个样品设3 组平行样。回收率的理论计算公式[18-20]如下。
1.3.8 光热抗菌
利用涂布平板法来探究CuS@MPBA NPs 在808 nm激光照射下的光热抗菌能力。首先，将试验所用的E.coli 和S.aureus 悬液浓度稀释至104 CFU/mL，分别对E.coli 和S.aureus 进行激光照射处理，以研究近红外激光对E.coli 和S.aureus 活性的影响。将E.coli 和S.aureus 与CuS@MPBA NPs 混合，进行激光照射处理，探究CuS@MPBA NPs 对E.coli 和S.aureus 的杀菌性能。将混合溶液进行稀释，取稀释后的30 μL 细菌悬液滴加至营养琼脂固体培养基上，放入37 ℃恒温培养箱培养16 h，菌落计数。
2 结果与分析
2.1 材料表征
试验材料合成后，使用紫外可见分光光度计对CuS NPs 和CuS@MPBA NPs 进行表征，验证CuS NPs和CuS@MPBA NPs 的光学性质，结果见图2。
图2 CuS NPs 和CuS@MPBA NPs 的紫外特征吸收光谱
Fig.2 Characteristic UV absorption spectra of CuS NPs and CuS@MPBA NPs
由图2 可知，CuS NPs 在400 nm～900 nm 处有宽吸收，进一步修饰4-MPBA 以后，并没有对CuS NPs 的紫外吸收造成影响，表明4-MPBA 的修饰并没有显著影响材料的光热特性，同时这种宽近红外区的强吸收能力可以增强光诱导电子的产生，从而赋予CuS@MPBA NPs 具有优异的光热性能，可高效杀灭细菌。
2.2 试验原理验证
使用红外热成像仪对CuS@MPBA NPs 在检测及杀菌过程中的温度进行监测，对CuS@MPBA NPs 的检测及杀菌原理进行了验证，结果见图3。
图3 对应物质经激光照射后的最终温度
Fig.3 The final temperature of the corresponding material after laser irradiation
柱上插图为对应温度下的红外热成像图
如图3 所示，经808 nm 激光照射后Ⅰ、Ⅱ能达到的温度大致相同，为30 ℃左右，Ⅲ为83.8 ℃。
离心处理后上清液的颜色：Ⅰ、Ⅱ均为深绿色，而Ⅲ为透明颜色，表明CuS@MPBA NPs 可以通过4-MPBA与E.coli 结合，并吸附在E.coli 表面，经离心处理后，CuS@MPBA NPs 被E.coli 带到沉淀中，此时上清液中没有CuS@MPBA NPs，因此溶液呈现出透明色。
2.3 材料光热稳定性研究
为了研究CuS@MPBA NPs 的光热稳定性，通过近红外的激光照射测试了其光热循环性能，结果见图4。
图4 CuS@MPBA NPs 溶液的升温和冷却曲线
Fig.4 Heating and cooling curves of CuS@MPBA NPs solution
从图4 可以看出，在测试的4 次循环中，每个循环的最高温度未出现明显的下降，温度在52 ℃～54 ℃内，降到室温（26 ℃）所需时间也基本相近，为15 min 左右。因此所制备的CuS@MPBA NPs 具有良好的光稳定性和抗激光消融性，在光控生物分析方面具有很大的发展潜力。这一数据结果表明，CuS@MPBA NPs 可以作为近红外窗口的优良光热剂，并且具有良好的杀菌潜力。
2.4 条件优化
为了提高试验体系的灵敏度，对CuS@MPBA NPs的浓度、4-MPBA 浓度和反应时间进行了优化。
2.4.1 优化CuS@MPBA NPs 浓度
对CuS@MPBA NPs 的浓度优化结果如图5、图6所示。
图5 不同浓度的CuS@MPBA NPs 在不同时间的近红外激光照射下溶液的红外热成像图
Fig.5 Infrared thermal imaging of solutions with different concentrations of CuS@MPBA NPs under NIR laser irradiation at different times
图6 不同浓度CuS@MPBA NPs 在不同时间的近红外激光照射下溶液的温度曲线
Fig.6 Temperature curves of solutions with different concentrations of CuS@MPBA NPs under NIR laser irradiation at different times
从图5 中可以看出，随着CuS@MPBA NPs 溶液浓度的增加，其在相同时间内的最高温度也逐渐上升。
由图6 可知，100 mmol/L 的CuS@MPBA NPs 经照射后3 min 内温度能达到64.8 ℃，大多数细菌在60 ℃左右即可被杀灭，为节约成本、节省材料，因此本试验选用的CuS@MPBA NPs 浓度为100 mmol/L。
2.4.2 优化4-MPBA 浓度
对4-MPBA 的浓度优化结果如图7 所示。
图7 4-MPBA 浓度优化
Fig.7 Optimization of 4-MPBA concentration
柱上插图为对应温度下的红外热成像图
从图7 中可以看出，在激光照射5 min 后，50 μg/mL的溶液温度仅有40.1 ℃，100 μg/mL 的溶液温度可达54.3 ℃，而后两组经过激光照射后溶液所达到的最终温度与100 μg/mL 接近。当4-MPBA 的浓度为100 μg/mL时，溶液既可以达到最高温度，又可以节省4-MPBA的用量。因此，选用4-MPBA 的浓度为100 μg/mL 的CuS@MPBA NPs 开展后续试验。
2.4.3 优化照射时间
对照射时间的优化结果如图8 所示。
图8 照射时间优化
Fig.8 Optimization of irradiation time
柱上插图为对应温度下的红外热成像图
从图8 中可以看出，激光照射的前2 min，温度随着照射时间的延长而升高，激光照射3 min 后温度逐渐稳定在50.6 ℃，为了保证溶液达到最高温度，同时又可以节省时间，因此本试验选用的照射时间为3 min。
综上所述，选用100 mmol/L 的CuS@MPBA NPs、100 μg/mL 的4-MPBA 和照射3 min 进行后续的细菌检测和灭活实验。
2.5 细菌检测
将CuS@MPBA NPs 与不同浓度的细菌孵育后离心，CuS@MPBA NPs 和细菌的复合沉淀物分散在超纯水中。在808 nm 的近红外激光照射下，沉淀复合物中附着在细菌表面的CuS@MPBA NPs 能利用良好的光热性能使溶液温度升高，进而杀死细菌。在一定范围内，细菌浓度越高，沉淀复合物中附着在细菌表面的CuS@MPBA NPs 越多，经激光照射后沉淀所产生的温度高。因此，可以根据此变化建立温度与细菌浓度的变化关系。温度与E.coli 对数浓度的线性关系见图9。
图9 温度与E. coli 对数浓度的线性关系
Fig.9 Linear relationship between temperature and E. coli logarithmic concentration
如图9 所示，E.coli 浓度在10 CFU/mL～107 CFU/mL之间与温度存在良好的线性关系，其R2=0.996 28。
温度与S.aureus 对数浓度的线性关系见图10。
图10 温度与S. aureus 对数浓度的线性关系
Fig.10 Linear relationship between temperature and S. aureus logarithmic concentration
如图10 所示，S. aureus 浓度在10 CFU/mL ～107 CFU/mL 之间与温度存在良好的线性关系，其R2=0.994 65。
2.6 实际样品中的细菌检测
为了进一步评估CuS@MPBA NPs 检测体系在实际样品中检测E.coli 和S.aureus 的准确性和可靠性，对牛奶进行加标回收试验，结果见表1～表2。
表1 牛奶中E. coli 的检测
Table 1 Detection of E. coli in milk
注：-表示不存在相关数值。
添加量/（CFU/mL） 检测值/（CFU/mL） 回收率/% 变异系数/%0 0--1×103 0.95×103 95 5.18 1×104 0.99×104 99 4.71 1×105 1.03×105 103 9.42
表2 牛奶中S. aureus 的检测
Table 2 Detection of S. aureus in milk
添加量/（CFU/mL） 检测值/（CFU/mL） 回收率/% 变异系数/%0 0--1×103 1.02×103 102 6.13 1×104 0.98×104 98 5.66 1×105 1.00×105 100 7.54
由表1～表2 可知，CuS@MPBA NPs 对E.coli 的回收率为95%～103%，对S. aureus 的回收率为98%～102%。以上试验表明本方法对检测牛奶中的E.coli 和S.aureus 具有实际可行性。
2.7 光热杀菌
采用传统的平板涂布法研究CuS@MPBA NPs 的光热杀菌性能（图11）。
图11 E. coli 和S. aureus 在激光照射前后细菌的平板照片
Fig.11 Plate images of E. coli and S. aureus bacterial colonies before and after laser exposure
由图11 可知，E. coli 和S. aureus 在有/无近红外808 nm 激光照射下，其平板中都可观察到大量的菌落，两者菌落数无明显差异，表明试验条件温和，激光照射本身并不影响E.coli 和S.aureus 的生物活性。
复合沉淀物CuS@MPBA NPs+E.coli 和CuS@MPBA NPs+S.aureus 在光热处理前后细菌的平板照片见图12。
图12 复合沉淀物CuS@MPBA NPs+E. coli 和CuS@MPBA NPs+S. aureus 在光热处理前后细菌的平板照片
Fig.12 Plate images of bacteria from composite sediments CuS@MPBA NPs+E. coli and CuS@MPBA NPs+S. aureus before and after photothermal treatment
由图12 可知，在无近红外808 nm 激光照射的情况下，离心后的复合沉淀物经培养后可以在营养琼脂平板上观察到大量的菌落，其菌落数量与空白组相差无几，表明CuS@MPBA NPs 无明显生物毒性，对E.coli 和S.aureus 的生长几乎没有抑制作用，但经过近红外808 nm 激光照射后，E.coli 和S.aureus 被高效地杀死，几乎没有留下完整菌落，表明CuS@MPBA NPs具有良好的光热特性，可以将激光输入的能量转化为热能，进而实现致病菌的热灭活。
CuS@MPBA NPs 对E.coli 的抗菌能力见图13。
图13 CuS@MPBA NPs 对E. coli 的抗菌能力
Fig.13 Antibacterial ability of CuS@MPBA NPs against E. coli
***表示不同组之间差异高度显著，p＜0.001。
CuS@MPBA NPs 对S.aureus 的抗菌能力见图14。
图14 CuS@MPBA NPs 对S. aureus 的抗菌能力
Fig.14 Antimicrobial capacity of CuS@MPBA NPs against S. aureus
***表示不同组之间差异高度显著，p＜0.001。
通过统计分析得出菌落统计数据，并计算出CuS@MPBA NPs 对E.coli 和S.aureus 的光热抗菌效率分别为98.3%（图13）和98.7%（图14），表明CuS@MPBA NPs 具有很好的光热特性，可以将808 nm 的激光能量转换为热能，进而实现对E.coli 和S.aureus 的热灭活，降低二次污染。
3 结论
本研究在CuS NPs 的基础上进一步修饰4-巯基苯硼酸，形成CuS@MPBA NPs，从而增强CuS@MPBA NPs 与致病菌的结合能力，通过优化CuS@MPBA NPs 浓度、4-MPBA 浓度以及光照时间确定了以CuS@MPBA NPs 的光热为信号进行致病菌检测的最佳条件，研究结果显示，CuS@MPBA NPs 对致病菌检测的最优条件：CuS@MPBA NPs 的浓度为100 mmol/L、4-MPBA 的浓度为100 μg/mL 以及照射3 min。在该条件下，对常见的食源性致病菌E.coli 和S.aureus 均在浓度10 CFU/mL～107CFU/mL 之间与温度存在良好的线性关系。在对牛奶的加标回收试验中回收率在95%～103%之间，表明其在实际样品中具有良好的适用性。同时，在光热过程中可实现对致病菌的原位杀死，对E.coli 和S.aureus 的光热抗菌效率分别高达98.3%和98.7%，表明CuS@MPBA NPs 具有优异的光热杀菌特性。本方法的成功构建为食品安全检测与质量控制研究提供了新的策略。
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