百香果（Passiflora edulis）又称西番莲、鸡蛋果，属西番莲科，西番莲属植物，原产于澳大利亚和巴西，属于热带多年生草质至半木质藤本攀附果树，现广泛分布于热带和亚热带地区，目前在我国的广东、广西、海南、福建等地大量种植[1]。现代医学研究表明，百香果中的多种有效成分对人类健康具有有益作用，如多糖具有增强细胞免疫、抑制肿瘤、降血糖等活性功能[2]；膳食纤维能促进肠胃蠕动，明显缓解便秘症状，明显降低肠癌发病率[3]；多种维生素能促进人体内胆固醇的代谢，有效预防高血压、高血脂的发生[4]；花青素对提高人体自身抗衰老能力有积极作用[5]。
水果中一般都具有丰富的果胶，需要在酿酒时添加果胶酶提高出酒率，但是果胶分解会产生大量的甲醇[6]。果酒中的甲醇一旦超标对人体的危害极大，会引起脑组织血液循环紊乱，产生弥漫性病变，严重会导致中枢性呼吸衰竭而死亡。甲醇对视神经及视网膜也有明显的毒作用，当含量过高时，会引起视网膜及视神经病变，最后引起视神经萎缩；甲醇还会抑制某些氧化酶，使糖分解及机体代谢受到障碍，导致乳酸蓄积，引起酸中毒；甲醇不易排出体外，即使少量也能引起人慢性中毒[7-10]。因此各国对酒中甲醇含量均有规定，欧盟标准规定，以水果为原料的蒸馏酒的甲醇含量应小于4.00 g/L（以酒精度40%vol 计算），美国标准为小于2.80 g/L。我国对果酒中甲醇含量的限定也非常严格，GB/T 15037—2006《葡萄酒》规定红葡萄酒中甲醇含量不得超过400 mg/L，白、桃红葡萄酒中甲醇含量不得超过250 mg/L，但目前我国对其他水果酿造的发酵酒中甲醇含量尚无明确规定，主要参考葡萄酒标准[11]。因此在酿造过程中对甲醇含量进行调控，对提升果酒的品质和安全具有重要意义。
果酒酿制过程中不可避免有甲醇产生。一般认为甲醇主要是通过果胶分解和甘氨酸代谢这两个途径产生的[12]。首先，果胶是生成甲醇的重要因素，水果中含有大量的果胶质，这些果胶质在酶、酸碱、热等条件下会被分解成果胶酸以及甲醇[13-14]。在酿酒过程中，主要使用的发酵手段包括热和酶处理。高温会造成果胶中的甲氧基被还原，导致甲醇的生成。而果胶酶会使果胶分解生成甲醇[15]，因此这两个途径是果胶途径中的主要途径。其次，进行果酒酿造时，酵母会进行甘氨酸代谢。甘氨酸代谢会生成甲醇，一是甘氨酸在脱氨脱羧酶作用下进行脱氨脱羧生成甲醇、氨气以及二氧化碳；二是甘氨酸在甘氨酸脱羧酶作用下被裂解为甲胺和二氧化碳后，甲胺与亚硝酸反应生成甲醇[16-17]。
目前利用百香果果壳进行果酒发酵的研究鲜有报道，因此，本文以百香果壳为原料，通过正交试验对发酵预处理中影响甲醇含量的因素进行研究，得出百香果壳果酒的最佳工艺条件，为生产低甲醇含量的果酒提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
百香果壳：桂林市万禾农产品有限公司；白砂糖（食品级）：云南耿马南华糖业有限公司；安琪RW 活性果酒干酵母（食品级）：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（3 万U/g）：上海麦克林生化科技有限公司；焦亚硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙醇（均为色谱纯）：上海易恩化学技术有限公司。
1.2 仪器与设备
折光仪（0-40）：东莞市三量精密量仪有限公司；酒精计（0-50）：新林仪器仪表有限公司；电子天平（SQP）、酸度计（PB-10）：北京赛多利斯科学仪器有限公司；旋转蒸发器（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器有限公司；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：郑州长城科工贸有限公司；数显恒温水浴锅（VIS-722ON HHS2）：金坛市医疗仪器厂；可见分光光度计（VIS-722ON）：北京瑞利分析仪器有限公司；台式高速离心机（TG16-WS）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；气相色谱仪（GC1690）：杭州捷岛科学仪器有限公司；破壁机（SP530）：浙江苏泊尔股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵流程
百香果壳原料破碎→加水和果胶酶酶解→加焦亚硫酸钠→加活化的酵母→加白砂糖→搅拌均匀密封常温（20 ℃～28 ℃）发酵→糖度低于10°Bx 补加糖维持在10°Bx 左右→发酵至第8 天用纱布粗滤→继续发酵2 d～4 d 过滤→密封陈酿。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 不同处理方法对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
1）破碎方式对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响：称取两份新鲜百香果果皮，一份切块，一份用破壁机进行打浆处理后分别倒入锥形瓶中按照工艺进行发酵。
2）加热对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响：称取两份新鲜百香果果皮，打浆处理后分别倒入锥形瓶中，按照工艺加入原辅料。加入果胶酶进行酶解后，一份不加热，一份80 ℃加热15 min 进行灭酶处理。
3）果胶酶对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响：称取两份新鲜百香果果皮，打浆处理后分别倒入锥形瓶中。一瓶不加果胶酶，另一瓶加入0.15%果胶酶酶解2 h，一起进行发酵。
1.3.2.2 热处理温度对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
称取新鲜百香果果壳，用破壁机粉碎后加入到锥形瓶中。果胶酶酶解后，4 组分别放在75、80、85、90 ℃中加热15 min 灭酶后，取出。待温度降至40 ℃左右时，加入酵母和焦亚硫酸钠进行发酵。发酵结束后测定果酒中甲醇和乙醇含量，确定最佳热处理温度。
1.3.2.3 热处理时间对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
称取新鲜百香果果壳，用破壁机粉碎后加入到锥形瓶中。果胶酶酶解后，分别放在80 ℃水浴中加热5、10、15、20 min 后取出。待温度降至40 ℃左右时，加入酵母和焦亚硫酸钠进行发酵。发酵结束后测定果酒中甲醇和乙醇含量，确定最佳热处理时间。
1.3.2.4 果胶酶添加量对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
称取新鲜百香果果壳，用破壁机粉碎后加入到锥形瓶中。称取0.05%、0.10%、0.15%、0.20%果胶酶分别加入瓶中。酶解后，在80 ℃水浴中加热15 min 后，取出。待温度降至40 ℃左右时，加入酵母和焦亚硫酸钠进行发酵。发酵结束后测定果酒中甲醇和乙醇含量，确定最佳果胶酶添加量。
1.3.2.5 果胶酶抑制剂种类对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
称取新鲜百香果果壳，用破壁机粉碎后加入到锥形瓶中。加入果胶酶酶解后，在80 ℃水浴中加热15 min后，取出。分别加入10 mg/L 的没食子酸、皂土。待温度降至40 ℃左右时，加入酵母和焦亚硫酸钠进行发酵。发酵结束后测定果酒中甲醇和乙醇含量，确定最佳果胶酶抑制剂。
1.3.3 正交试验
在单因素试验结果上，选取热处理温度（A）、热处理时间（B）、果胶酶添加量（C）为因素，以发酵后酒中甲醇和乙醇含量为指标，选用L9（34）正交表，设计正交试验，确定最佳工艺条件。正交试验因素水平如表1所示。
表1 正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 因素A 热处理温度/℃ B 热处理时间/min C 果胶酶添加量/%1 83 13 0.13 2 85 15 0.15 3 87 17 0.17
1.3.4 试验指标测定方法
1.3.4.1 果胶含量测定
原料和发酵液的果胶含量测定方法参照NY/T 2016—2011《水果及其制品中果胶含量的测定分光光度法》[18]。
1.3.4.2 糖度测量
酒的糖度采用折光仪进行检测。
1.3.4.3 乙醇含量测定
乙醇含量的测定方法参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[19]中气相色谱法进行检测。
1.3.4.4 甲醇含量检测
甲醇含量的测定方法参照GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》[20]中气相色谱法进行检测。
1.4 数据处理
数据通过Excel 进行处理和作图，以SPSS 21 软件进行方差分析。所有试验均做3 次平行试验，结果以平均值±标准差来表示。
2 结果与分析
2.1 标准曲线绘制
2.1.1 乙醇标准曲线
乙醇标准曲线见图1。
图1 乙醇标准曲线
Fig.1 The standard curve of ethanol
由图1 可知，乙醇含量在0～16 mL/100 mL 内与峰面积有良好的线性关系。其回归方程：y=0.279 3x-0.118 9，R2=0.995 5。
2.1.2 甲醇标准曲线甲醇标准曲线见图2。
图2 甲醇标准曲线
Fig.2 The standard curve of methanol
由图2 可知，甲醇含量在0～1 000 mg/L 内与峰面积有良好的线性关系。其回归方程：y=0.003 3x+0.053，R2=0.991 5。
2.2 果胶含量
2.2.1 半乳糖醛酸标准曲线
半乳糖醛酸标准曲线见图3。
图3 半乳糖醛酸标准曲线
Fig.3 The standard curve of galacturonic acid
如图3 所示，半乳糖醛酸浓度在0～120 mg/L 内与吸光度有着良好的线性关系。其回归方程：y=1.067 3x-0.031 5，R2=0.991 7。
2.2.2 不同处理方法下发酵果酒生产中果胶及甲醇含量的变化
不同处理方法下发酵果酒中果胶及甲醇含量变化见表2。
表2 不同处理方法中果胶及甲醇含量
Table 2 The pectin and methanol content with different treatment methods
处理方法 原料果胶含量/（g/kg）甲醇含量/（mg/L）加热温度75 ℃ 4.755±0.541 1.455±0.018 659.05±11.71加热温度80 ℃ 4.772±0.797 1.768±0.240 451.10±38.70加热温度85 ℃ 4.733±0.300 2.609±0.323 269.04±8.59加热温度90 ℃ 4.752±0.632 1.514±0.157 589.39±12.04加热时间5 min 4.752±0.286 1.533±0.137 574.57±31.86加热时间10 min 4.791±0.524 1.592±0.326 528.15±15.55加热时间15 min 4.791±0.410 1.768±0.064 452.85±15.89加热时间20 min 4.772±0.817 1.905±0.519 401.74±8.77加酶量0.05% 4.811±0.163 2.570±0.107 272.73±15.21加酶量0.10% 4.772±0.552 1.866±0.136 426.01±4.52加酶量0.15% 4.752±0.619 1.729±0.146 468.38±5.82加酶量0.20% 4.713±0.268 1.396±0.034 751.63±31.63发酵后果胶含量/（g/kg）
如表2 所示，不同的处理条件对果胶含量和甲醇含量的影响各不相同。加热温度对甲醇含量影响比较明显，在85 ℃时发酵后果胶含量最高，甲醇含量最低。随着加热时间的延长，甲醇含量不断降低，但是变化不明显。加酶量越低甲醇含量越低，说明果胶酶越多，分解果胶后产生的甲醇越多。此结果与白凤岐[21]报道的果胶分解产生甲醇而自身被消耗这一结论相同。因此，结果表明发酵后的果胶含量与甲醇含量呈负相关。
2.3 单因素试验
2.3.1 不同处理方法对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
不同处理方法对果酒中甲醇和乙醇含量的影响结果见表3。
表3 不同处理方法对果酒中甲醇和乙醇含量的影响
Table 3 Effects of different treatment methods on methanol and ethanol content of fruit wine
?
如表3 所示，切块和打浆处理后果酒中甲醇和乙醇含量相差不大，考虑工厂生产酒的成本与便利，因此以打浆作为处理原料的最佳条件。对比不加热组和加热组处理的甲醇、乙醇含量发现，加热后酒中甲醇和乙醇含量变化明显，确定温度对其甲醇含量有影响，确定工艺中进行加热处理，后续对加热的温度和时间进行研究。对比不加酶组和加酶组的试验数据发现，不加酶的甲醇含量尽管极低，但是乙醇含量也是非常少，因此确定酶对果酒中甲醇和乙醇存在影响，因此确定加酶处理，后续对加酶量进行研究。
2.3.2 热处理温度对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
热处理温度对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响见图4。
图4 热处理温度对果酒甲醇和乙醇含量的影响
Fig.4 Effect of heat treatment temperature on methanol content and ethanol content of fruit wine
由图4 可知，随着热处理温度的上升，甲醇含量随之降低，在85 ℃时达到最低，此时甲醇含量为269.044 mg/L。甲醇含量在85 ℃～90 ℃开始上升，考虑到可能是温度过高，导致果胶质自行分解过快，产生较多的甲醇。乙醇含量随着热处理温度的上升逐渐下降，在85 ℃达到最低，当热处理温度继续上升时，乙醇含量开始增加。因此，选择85 ℃为最佳热处理温度进行正交试验。
2.3.3 热处理时间对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
热处理时间对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响见图5。
图5 热处理时间对果酒甲醇和乙醇含量的影响
Fig.5 Effect of heat treatment time on methanol content and ethanol content of fruit wine
由图5 可知，随着热处理时间的延长，甲醇含量不断降低，在20 min 时，甲醇含量最低，为401.74 mg/L。乙醇含量在热处理5 min～15 min 时下降平缓，热处理15 min～20 min 时下降幅度增大，在20 min 时达到最低。虽然热处理20 min 时甲醇含量最低，但由于此时的乙醇含量过低，不符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》[22]标准。因此综合考虑，选择热处理15 min 为最佳热处理时间进行正交试验。
2.3.4 果胶酶添加量对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
果胶酶添加量对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响见图6。
图6 果胶酶添加量对果酒甲醇和乙醇含量的影响
Fig.6 Effect of pectinase addition on methanol content and ethanol content of fruit wine
由图6 可知，随着果胶酶添加量增加，甲醇和乙醇含量均不断增加。果胶酶添加量为0.10%和0.15%时，甲醇含量相近，分别为426.006 mg/L 和468.382 mg/L；果胶酶添加量为0.20%时，甲醇含量最高，达到751.631 mg/L。乙醇含量变化趋势基本相同，但是果胶酶添加量为0.10%和0.15%时乙醇含量相差较大，为5.089 mL/100 mL和10.401 mL/100 mL。因此，综合考虑乙醇和甲醇的含量，选择最佳果胶酶添加量为0.15%进行正交试验。
2.3.5 果胶酶抑制剂种类对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响
果胶酶抑制剂种类对发酵果酒中甲醇和乙醇含量的影响见图7。
图7 果胶酶抑制剂种类对果酒甲醇和乙醇含量的影响
Fig.7 Effects of types of enzyme inhibitors on methanol content and ethanol content of fruit wine
如图7 所示，与空白组比较，果胶酶抑制剂均可以降低甲醇含量，其中10 mg/L 没食子酸组的甲醇含量下降得较多，10 mg/L 皂土组的甲醇含量下降得较少。乙醇含量变化也有同样的变化趋势。由于乙醇含量的变化幅度不大，因此根据甲醇的结果对比，选择10 mg/L没食子酸作为最佳果胶酶抑制剂。
2.4 正交试验结果
在单因素试验基础上进行正交试验，结果见表4，方差分析结果见表5 和表6。
表4 正交试验结果
Table 4 Results of orthogonal test
注：K 值以甲醇含量为指标计算，K＇值以乙醇含量为指标计算。
序号C 果胶酶添加量1 1 1 1 371.93±2.74 13.97±0.72 2 1 2 2 423.37±24.51 12.83±0.35 3 1 3 3 137.46±10.00 4.36±0.76 4 2 1 3 163.82±20.38 10.78±0.28 5 2 2 1 279.03±14.54 12.47±0.42 6 2 3 2 257.13±4.01 11.63±0.36 7 3 1 2 436.56±22.86 11.45±0.19 8 3 2 3 158.11±3.65 9.84±0.67 9 3 3 1 88.99±8.24 3.47±0.51 K1 307.59 324.10 246.65 K2 233.33 286.84 372.36 K3 227.89 159.19 153.13 R 76.37 162.91 219.23 K＇1 10.39 12.07 9.97 K＇2 11.63 11.71 11.97 K＇3 8.25 6.49 8.33 R＇ 3.37 5.58 3.64 A 热处理温度因素 甲醇含量/（mg/L）B 热处理时间乙醇含量/（mL/100 mL）
表5 以甲醇含量为指标的正交试验方差分析结果
Table 5 The variance analysis results of orthogonal experimental with methanol content as index
注：P＜0.05 表示差异显著。
?
表6 以乙醇含量为指标的正交试验方差分析结果
Table 6 The variance analysis results of orthogonal experimental with ethanol content as index
注：P＜0.05 表示差异显著。
?
由表4 可知，影响甲醇含量的因素主次顺序：果胶酶添加量＞热处理时间＞热处理温度。正交试验表中最佳条件为热处理温度87 ℃、热处理时间17 min、果胶酶添加量0.13%，此条件下甲醇含量为88.99 mg/L。影响乙醇含量的主次顺序：热处理时间＞果胶酶添加量＞热处理温度，正交试验表中最佳工艺条件为热处理温度83 ℃、热处理时间13 min、果胶酶添加量0.13%，此条件下乙醇含量为13.97 mL/100 mL。
由表5 和表6 可知，通过方差分析，果胶酶添加量对甲醇含量影响显著，而热处理温度和时间对甲醇含量影响不显著，3 个因素对乙醇含量影响均不显著。
以甲醇含量为指标确定的最佳工艺条件获得的果酒乙醇含量过低，达不到生产要求，因此，综合甲醇和乙醇的试验结果最终确定正交试验中的第8 号试验作为最佳工艺。即热处理温度为87 ℃、热处理时间为15 min、果胶酶添加量为0.17%，在此条件下发酵生产的果酒乙醇含量为9.84 mL/100 mL，甲醇含量为158.11 mg/L。
3 结论
本文通过研究发现百香果果壳破碎方式对发酵果酒中的甲醇和乙醇含量影响并无明显差距，百香果壳原料加热会导致酒中的甲醇和乙醇含量降低，加酶后会使酒中的甲醇含量大幅度增加，使用没食子酸作为酶抑制剂可以明显降低甲醇含量，但是对于没食子酸的使用浓度没有进行详细研究，有待于以后继续研究。通过单因素和正交试验最终确定百香果果壳发酵果酒生产中最佳处理工艺：热处理温度87 ℃、热处理时间15 min、果胶酶添加量为0.17%，得到的果酒甲醇含量为158.11 mg/L，乙醇含量为9.84 mL/100 mL。通过此工艺生产的果酒甲醇含量远低于GB/T 15037—2006《葡萄酒》标准要求。
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