蓝莓又名越橘、越桔属，果实呈蓝紫色，椭圆形，原产于美国，1983 年由吉林大学首先引入我国种植栽培[1]。蓝莓富含维生素、纤维素、黄酮、多糖、超氧化歧化酶，还有大量的微量元素（如锰、钾、铁等）[2-3]。蓝莓易腐烂，开发研究较少，因此需要深度开发蓝莓加工技术提高其综合利用水平[4]。
蓝莓中除含维生素等物质外，还富含花青素。花青素是类黄酮类物质，在植物体内主要通过糖苷键与糖类物质结合，即花色苷[5]。同时，它也是一种存在于植物体内的天然色素[6]，具有抗氧化、抑菌、保护肝脏[7]、保护神经细胞[8]、提高记忆力[9]、防止衰老[10]等功效。因此，对蓝莓花青素进行提取及分离，将其应用于食品、药品及化妆品等行业，有利于促进深度开发蓝莓加工技术、提高蓝莓的综合利用率。
目前，提取蓝莓花青素的方法主要包括有机溶剂提取法[11]、酶提取法[12]、微波辅助提取法[13]、超声辅助提取法[14]等，其中微波辅助提取（microwave-assisted extraction，MAE）具有节能高效、破壁强度高、提取率高、操作简便等优点，但是在提取花青素的过程中，易造成花青素分解损失。超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction，UAE）具有穿透力强、提取率高、处理量大、速度快、操作简单等优点[15]，但是在提取花青素时耗能相对较高[16]。
超声-微波辅助提取（ultrasound-microwave-assisted extraction，UMAE）结合了UAE 和MAE 的优点，同时也弥补了两者的不足。因此，本文采用超声-微波辅助提取蓝莓花青素，研究不同溶剂对蓝莓花青素含量的影响并在最佳提取溶剂的基础上以UAE、MAE 作为对比，最后分析不同条件下花青素的稳定性与抗氧化性。以期为超声-微波协同辅助提取蓝莓花青素提供参考，对促进蓝莓花青素的开发及利用具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
L550 型离心机：湘仪离心机仪器有限公司；XOSM100 型超声波微波组合反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；TU-1900 型双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；INFINITE M PLEX酶标仪：德国帝肯Tecan 公司；PHS-3C 型pH 计：上海仪器电科学仪器股份有限公司；HH-J2 磁力搅拌水浴锅：常州金坛精达仪器制造公司；RV10 旋转蒸发仪：德国IKA 公司。
1.2 材料与试剂
蓝莓（云南怡颗莓）：市售；无水乙醇、甲醇、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、氯化钾、盐酸（均为分析纯）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2＇-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]试剂盒、铁离子总抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant powor，FRAP）检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.3 蓝莓花青素的提取
蓝莓打成酱后，准确称取30 g 蓝莓酱液，按料液比1∶30（g/mL）与溶剂混合，溶剂均含有0.1%HCl，在60 ℃下利用超声-微波辅助提取蓝莓花青素30 min。提取完毕后，5 000 r/min 离心10 min，取上清液于旋转蒸发仪中进行浓缩，浓缩后定容至统一体积，然后低温保存进行下一步分析。蓝莓花青素提取的工艺条件见表1。
表1 蓝莓花青素提取的工艺条件
Table 1 Technological conditions for extraction of anthocyanins from blueberry
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1.4 蓝莓花青素含量测定
采用pH 示差法测定花青素含量[17]，即分别用pH1.0氯化钾和pH4.5 乙酸钠缓冲溶液将样品溶液稀释20 倍，然后利用紫外分光光度计在520 nm 和700 nm中测定各pH 值样品溶液的吸光度。利用下列公式计算蓝莓花青素含量。
式中：A520 为各样品溶液在520 nm 处的吸光度；A700 为700 nm 处的吸光度；MW 为相对分子质量，449.2 g/mol；DF 为稀释倍数；V 为待测液体积，L；ε 为消光系数，26 900 L/（mol·cm）；m 为样品质量，g；L 为比色皿距离，1 cm。
1.5 抗氧化性测定
1.5.1 蓝莓花青素对DPPH 自由基清除能力的测定
根据Chen 等[18]研究方法，大多数分离的化合物清除DPPH 自由基的活性强，因此可将提取的样品对DPPH 自由基的清除能力作为花青素的抗氧化性评价指标。准确称取DPPH 于烧杯中，加入无水乙醇溶解，然后倒入棕色容量瓶中定容，配成浓度为0.04 mmol/L的DPPH 溶液，避光低温保存备用。测定前分别稀释样品至同一浓度，然后将2 mL 样品提取液与2 mL DPPH混合摇匀，避光反应30 min 后于酶标仪517 nm 处测定其吸光度，记为AY；2 mL DPPH 与2 mL 无水乙醇混合，避光反应30 min，吸光度记为A0；2 mL 提取液与2 mL 无水乙醇混合避光反应，吸光度记为AX，利用下列公式计算样品清除DPPH 自由基清除率。
1.5.2 蓝莓花青素对ABTS+·清除能力的测定
测定前分别稀释样品至同一浓度，然后根据试剂盒说明操作，得到样品吸光度以及标准曲线方程。通过测定得到标准曲线方程为y=-1.635 7x+0.961，相关系数R2=0.999 3。将测得样品的吸光度代入标准曲线得到蓝莓花青素对ABTS+·的清除能力。
1.5.3 FRAP 总抗氧化能力的测定
测定前分别稀释样品至同一浓度，然后根据FRAP 试剂盒说明操作，得到样品吸光度以及标准曲线方程。通过测定得到标准曲线方程为y=0.349 5x+0.130 4，相关系数R2=0.997 1。将测得样品的吸光度代入标准曲线中得到蓝莓花青素对铁离子的还原能力。
1.6 稳定性测定
参考孙倩怡[19]的测定方法，研究不同方法、温度、pH 值对蓝莓花青素稳定性的影响。将柠檬酸和柠檬酸钠按照一定比例配成一定pH 值的溶液。取5 支一次性管进行编号，向各管中加入2 mL 同种样品溶液，前4 支管依次加入2 mL 不同pH 值溶液，空白管中加入2 mL 无水乙醇，以此重复配制3 组相同溶液。将3 组溶液分别放入提前预热水浴温度为60、70、80 ℃的恒温水浴锅中进行温度和pH 值的稳定性试验。每小时用酶标仪在535 nm 下测定蓝莓花青素的吸光度，连续测定5 h，记录数据。通过下式计算蓝莓花青素保留率。
式中：Ai 为反应后测得的吸光度；A0 为反应0 min时的吸光度。
1.7 数据统计分析
试验均重复3 次，利用SPSS 分析数据，显著性水平P＜0.05，采用Excel 进行数据整理分析，Origin 2019进行作图。
2 结果与讨论
2.1 花青素含量分析
2.1.1 提取溶剂对花青素含量的影响
在超声-微波协同辅助作用下，采用不同溶剂分别提取蓝莓花青素。提取溶剂对花青素提取含量的影响见图1。
图1 提取溶剂对花青素含量的影响
Fig.1 Effect of extraction solvents on content of anthocyanins
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，蓝莓花青素含量随乙醇浓度的降低而降低，50%乙醇提取的蓝莓花青素含量仅为0.500 mg/g，而无水乙醇提取的蓝莓花青素含量最高，为0.846 mg/g，这可能是因为乙醇浓度较低，花青素较难被完全提取出来[20]。利用甲醇提取的花青素含量为0.738 mg/g，高于70%乙醇作为溶剂的花青素含量（0.520 mg/g）而低于无水乙醇，这与张振文等[21]的研究结果有所差异，原因可能是提取方式、试验材料等的不同而导致溶剂作用不一致。在本试验中，因为乙醇较甲醇穿过细胞的能力要强，破壁效果更好[22]，因此，提取效率更高。综上所述，本试验中提取蓝莓花青素效率最高的溶剂为无水乙醇，因此采用无水乙醇进一步研究UAE、MAE、UMAE 对蓝莓花青素提取效率的影响。
2.1.2 提取方式对蓝莓花青素含量的影响
提取方式对蓝莓花青素含量的影响见图2。
图2 提取方式对花青素含量的影响
Fig.2 Effect of extraction methods on content of anthocyanins
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
如图2 所示，微波辅助方式提取的花青素含量（0.588 mg/g） 略高于超声辅助提取的花青素（0.564 mg/g）。这可能是因为微波辐射会导致细胞壁与细胞膜被冲破，进而使得更多的花青素溶出，导致花青素的提取含量增大[23]。而超声-微波提取的花青素含量则为最高，达到0.846 mg/g，超声-微波辅助协同作用可以提高化合物产量，这与Garcia-Vaquero 等[24]的研究相似。可见超声-微波在提取蓝莓花青素时具有较好的协同作用，在提取蓝莓花青素方面具有潜在的应用前景。
2.2 提取方式对蓝莓花青素的抗氧化性的影响
提取方式对蓝莓花青素的抗氧化性的影响见图3。
图3 提取方式对花青素抗氧化能力的影响
Fig.3 Effect of extraction methods on antioxidant capacity of anthocyanins
A.样品对DPPH 自由基清除率；B.ABTS 法测定抗氧化性；C.FRAP 法测定抗氧化能力。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
结合张娣[25]和蔡珊等[26]的方法对花青素的抗氧化性进行研究，本文通过DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力3 个指标来比较UAE、MAE、UMAE 提取的花青素的抗氧化性。DPPH 自由基清除试验是基于DPPH 被抗氧化剂淬灭的能力。花青素分子中含多个酚羟基，可通过自身氧化来清除DPPH自由基。抗氧化剂存在时，会抑制ABTS+·的产生，通过测量ABTS+·在一定波长下的吸光度可得到样品的总抗氧化能力。与DPPH 自由基和ABTS+·不同，FRAP 则是基于样品的综合还原能力作为抗氧化评价指标。
如图3A 和图3B 所示，微波辅助提取的花青素（microwave-assisted extraction of anthocyanins，MAEA）对DPPH 自由基与ABTS+·的清除能力均为最强。其中由图3A 可知，DPPH 自由基清除率达到72.1%，分别为超声-微波辅助提取的花青素（ultrasound-microwave -assisted extraction of anthocyanins，UMAEA）（60.3%）和超声辅助提取的花青素（ultrasound-assisted extraction of anthocyanins，UAEA）（58.3%）的1.19 倍和1.24 倍；由图3B 可知，通过测定ABTS 指标所得的MAEA 抗氧化能力为0.51 mmol Trolox/10 μL，与UMAEA 的抗氧化性（0.50 mmol Trolox/10 μL）相近，抗氧化性较差的UAEA 为0.46 mmol Trolox/10 μL，差异显著。这可能是超声处理对花青素结构产生了不利影响以及热氧化造成了损失[27]。在超声处理过程中，空化泡沫剧烈压缩和崩溃的瞬间会产生热氧化效应进而造成花青素损失[28]。而UMAEA 在抗氧化性能方面也没有特别突出，UMAEA 对DPPH 自由基的清除率要高于UAEA 而略低于MAEA，表明提取效率与抗氧化活性之间并不呈正相关。UAEA 只有在FRAP 指标的抗氧化能力上表现较好，略高于MAEA，但不同提取方式间并没有表现出显著差异。不同指标由于反应原理不同以及受环境影响，因此，3 种方法所表现出的抗氧化性略有差异，但综合比较，微波辅助提取的样品表现出比超声方法更高的抗氧化能力[29]。
2.3 蓝莓花青素稳定性分析
2.3.1 提取方法对花青素稳定性的影响
为探究3 种提取方法对花青素稳定性的影响，将MAEA、UAEA、UMAEA 分别置于pH3、70 ℃条件下进行处理5 h，每隔1 h 测定1 次吸光度，并计算保留率，结果如图4 所示。
图4 提取方式对花青素稳定性的影响
Fig.4 Effect of extraction methods on the stability of anthocyanins
不同的提取方式对花青素的稳定性影响也有所差异，由图4 可知，所有样品的花青素保留率均随着加热时间的延长而不断下降。但降解的速率有所区别。前1 h，UMAEA 的保留率下降最快，降解率接近30%，随后保留率下降速度有所放缓；5 h 后，UMAEA 的花青素保留率降至约为63%。整个处理过程中，MAEA 始终保持相对较高的保留率，5 h 后保留率降至68.7%，而UAEA 一直处于较高的降解速率，5 h 后保留率仅为51.1%，原因可能是超声波的空化作用促进了样品暴露在溶剂中，加大样品与溶剂的接触面积，因此，更容易被分解。由此可知，仅通过超声辅助提取的花青素，其稳定性与抗氧化性相对较差，有待进一步增强。所以对于需要长时间保存的花青素，选择微波处理相对更有优势[30]。
2.3.2 温度对花青素稳定性的影响
选择稳定性较好的MAEA 进行试验，以便于分析不同温度下花青素的降解情况。温度对花青素稳定性的影响见图5。
图5 温度对花青素稳定性的影响
Fig.5 Effect of temperature on the stability of anthocyanin
如图5 所示，所有样品的花青素保留率均随着加热时间的延长呈整体下降趋势，温度越高降解速率越快。在加热5 h 时，60 ℃的花青素保留率约为82.3%，而80 ℃加热的样品保留率仅为55.1%。由于温度过高会促使共价键断裂、花青素糖苷的水解、花青素芘环水解产生链烃[31]、破坏花青素结构[32]，因此，高温条件下花青素会迅速降解。而在60 ℃与70 ℃加热下的样品，3 h 后的降解速率有所放缓，分析原因可能是3，5-二葡萄糖苷和3-葡萄糖苷的查尔酮型达到与其相应的黄烊盐阳离子的平衡，但花青素总体上还是处于不断分解的趋势。因此在食品工业生产过程中，由于花青素的热不稳定性，无论是储藏还是加工处理过程，都应避免高温长时间处理。综上，花青素的稳定性受温度影响较大，随着温度的不断升高，花青素的保留率迅速下降。
2.3.3 pH 值对花青素稳定性的影响
选择适中的70 ℃作为探究pH 值对花青素稳定性的处理条件。pH 值对花青素稳定性的影响见图6。
图6 70 ℃下pH 值对花青素稳定性的影响
Fig.6 Effect of pH on the stability of anthocyanins at 70 ℃
由图6 可知，不同pH 值对蓝莓花青素保留率的影响有一定差别，但均随着pH 值的增大与70 ℃恒温水浴时间的延长而不断下降；pH 值为3 的花青素保留率呈现相对缓慢的下降趋势，约3 h 后变得较为稳定。pH 值为4、5、6 时，在1 h 内，蓝莓花青素保留率剧烈下降，随着时间的延长，保留率逐渐趋于稳定，原因可能是残留的花青素结构较为稳定。相关研究表明：花青素的结构会随着pH 值的变化而变化，当pH 值较低时，花青素以红色的黄烊盐阳离子形式存在，随着pH值的升高，醌型碱会逐渐增多[33]。随后花青素会发生水合反应生成甲醇假碱形式，再形成查尔酮。强碱会导致花青素迅速降解，而pH 值较低时，花青素的稳定性会更好，颜色会偏向紫红色，较为适合储存。
3 结论
在本研究中，主要运用超声-微波协同辅助提取花青素，研究不同提取溶剂、提取方式对花青素含量的影响并与超声、微波辅助进行对比，探讨提取方式对花青素抗氧化性的影响以及各提取方式、温度和pH值对花青素稳定性的影响。结果表明，采用酸化无水乙醇的效率最高，提取含量为0.846 mg/g，其中超声-微波功率均为300 W，加入溶剂的HCl 体积分数为0.1%。仅超声或微波辅助提取的花青素含量明显偏低，超声-微波对于花青素的提取具有协同作用。DPPH、ABTS、FRAP 3 个指标都表明MAEA、UAEA、UMAEA具有较好的抗氧化能力。但MAEA 所体现的抗氧化性要强于UAEA 与UMAEA，提取含量与抗氧化性并不呈现正相关的关系。花青素的稳定性受温度、pH 值、提取方法等影响较大。花青素在低温酸性的环境中更为稳定、更有利于保存，而超声处理可能会导致花青素的稳定性与抗氧化性降低。
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