香菇是世界上栽培量较大的食用蘑菇，其产量在世界食用菌中排行第二，仅次于双孢蘑菇[1]。由于其富含多种营养成分和独特的风味，广受消费者的青睐[2]。香菇是担子菌纲的一种药食两用的真菌[3]。香菇在我国的人工栽培历史悠久，有“山宝之王”美称[4]，香菇富含蛋白质、维生素、矿物质、氨基酸等营养成分，具有很高的食用和营养价值[5]。
香菇多糖是香菇的主要有效活性成分，大量的研究证明香菇多糖具有免疫调节[6]、抗肿瘤[7]、抗炎[8]、抗病毒[9]、抗氧化[10-11]、提高免疫力[12]、抗疲劳[13]等功能，是很好的生物反应调节剂和免疫刺激剂，其在食品开发领域具有广阔前景[14]。香菇多糖在食品保鲜领域也有很大的发展潜力，Guo 等[15]研究以香菇多糖作为香菇收获后的处理涂层，可以有效防止香菇的褐变和软化，为生鲜储藏的优化提供参考。
目前国内外提取香菇多糖的方法有很多，物理方法主要包括有微波辅助提取法[16]、超声辅助提取法[17]，化学方法包括水提醇沉法[18]、酸碱提取法[19-20]，生物提取法包括酶解提取法[21]、发酵提取法[22]。此外孙林超[23]采用亚临界水法提取香菇多糖，测得香菇多糖含量为151 mg/g，该方法提取效率高，提取时间短；秦令祥等[24]采用闪式提取法提取香菇多糖，提取率为6.83%，此方法可以节省提取时间，节省能源和试剂。热水提取法操作简单，但提取时间长，提取效率低；酸碱提取法提取时间短，但容易破坏多糖的结构。相较于前两种化学方法，超声辅助提取法耗时较少，提取效率相对较高，但是超声时间过长则可能引起多糖降解影响试验结果。微波辅助提取法提取时间短，但提取率不高。酶解辅助提取法提取效率高，提取条件温和，操作简单，所需试验仪器少。目前采用纤维素酶辅助热水法提取香菇多糖和采用3，5-二硝基水杨酸法测定香菇多糖含量的研究甚少，本研究选用纤维素酶解辅助热水法提取香菇多糖，通过单因素和正交试验法来确定酶添加量、提取温度、提取时间、料液比等多因素对香菇多糖提取结果的影响，优选出香菇多糖最佳提取工艺，以期获得最佳工艺参数。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干香菇：黑龙江贵丰绿色食品有限公司；葡萄糖、苯酚、酒石酸钾钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：烟台市双双化工有限公司；无水亚硫酸钠（分析纯）：天津市红岩化学试剂厂；亚铁氰化钾（分析纯）：天津欧博凯化工有限公司；乙酸锌（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；纤维素酶（1×105 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；三氯乙酸、冰乙酸、抗坏血酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、30%过氧化氢、水杨酸（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
HH-4 型数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；FA1204B 型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；UV-5100 型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；TG-16C 型高速离心机：上海安亭科学仪器厂；FW100 型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄糖标准曲线的制作
取葡萄糖标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于比色管中，用蒸馏水补至2 mL，分别加入3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂2 mL，沸水浴5 min，流水冷却，在540 nm 波长下测定吸光度。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖溶液的标准曲线。得到回归方程y=2.276 43x-0.019 89，R2=0.998 59。
1.3.2 香菇多糖的提取
将香菇放入恒温干燥箱中干燥至恒重，粉碎成粉末，过60 目筛。称取一定质量的香菇粉末放入锥形瓶中，加适量水调pH 6.0。称取纤维素酶放入烧杯中，加入15 mL 蒸馏水在60 ℃下预热10 min。预热结束后，于锥形瓶中混合均匀，进行水浴加热。最后在90 ℃下灭酶10 min，得到香菇粗多糖提取液。
1.3.3 香菇多糖含量的测定
香菇多糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸法[25-26]。香菇多糖提取液中多糖含量计算公式如下。香菇多糖含量/%=香菇总糖含量（%）-香菇还原糖含量（%）
香菇多糖提取液中还原糖、总糖含量计算公式如下。
式中：C 为香菇多糖提取液中还原糖、总糖含量，%；M1 为香菇粉末质量，g；M2 为样品溶液吸光度值从标准曲线中查得的还原糖、总糖含量，mg；V 为提取体积，mL；V1 为分取体积，mL；V2 为定容体积，mL；V3为比色的样品液体体积；1 000 为将g 换算为mg 的系数；100 为换算为百分含量的系数。
1.3.4 单因素试验
试验均采用干燥过筛后的香菇粉末作为试验材料。以香菇多糖含量为指标，每个单因素试验设置3 组平行试验。分别研究和探讨纤维素酶添加量、提取温度、提取时间、料液比对香菇多糖含量的影响。
1）选取纤维素酶添加量分别为0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、料液比1∶20（g/mL）、提取时间2 h、提取温度50 ℃的条件对香菇样品进行处理，确定最佳纤维素酶添加量。
2）选取提取温度40、50、60、70、80 ℃、料液比1∶20（g/mL）、多糖提取时间2 h、酶添加量0.4%的条件对香菇样品进行处理，确定最佳提取温度。
3）选取提取时间1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h、料液比1∶20（g/mL）、提取温度50 ℃、酶添加量0.4%的条件对香菇样品进行处理，确定最佳提取时间。
4）选取2 g 的香菇干粉样品溶于水，考察不同的料液比[1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]、提取时间2 h、提取温度50 ℃、酶添加量0.4%的条件对香菇样品进行处理，确定最佳料液比。
1.3.5 正交试验
根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验，优化确定最佳工艺条件。
表1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal design
水平因素A 纤维素酶添加量/%D 料液比/（g/mL）1 0.4 1∶20 2 0.6 1∶25 3 0.8 1∶30 B 提取温度/℃C 提取时间/h 40 1.5 50 2.0 60 2.5
1.3.6 香菇多糖抗氧化活性测定
1.3.6.1 还原能力的测定
采用铁氰化钾比色法测定香菇多糖的还原能力。参照潘婉莲等[27]方法，在700 nm 处测定吸光度，吸光度越高，还原能力越强。
1.3.6.2 羟基自由基清除能力的测定
采用Fenton 反应水杨酸法测定香菇多糖的羟基自由基清除能力。参照林捷等[28]的方法，在510 nm 处测定吸光度，羟基自由基清除率计算公式如下。
式中：A 为空白对照的吸光度；A1 为测定样品的吸光度；A2 为不加显色剂水杨酸的吸光度。
1.4 数据处理
每组试验重复3 次，取平均值。采用Excel 2010、SPSS 25.0 和Origin 9.0 软件进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 纤维素酶添加量对香菇多糖含量的影响
纤维素酶添加量对香菇多糖含量的影响见图1。
图1 纤维素酶添加量对香菇多糖含量的影响
Fig.1 Effect of cellulose enzyme addition on the yield of polysaccharide from Lentinus edodes
由图1 可知，纤维素酶添加量在0%～0.6%时，多糖含量随酶添加量增加而增大，当酶添加量为0.6%时，多糖含量达到峰值，当酶添加量大于0.6%时，多糖含量增加幅度不大。纤维素酶可以分解香菇细胞壁，使细胞膜破裂，降低膜的通透性，使内容物更快地溢出，提高提取液中多糖含量。当纤维素酶添加量小于0.6%时，细胞壁未完全分解，多糖析出量少；酶添加量越大，细胞壁分解越多，多糖析出量越多，当纤维素酶添加量达到0.6%时，细胞壁分解完全。因此在单因素试验条件下，纤维素酶最佳添加量为0.6%。
2.1.2 提取温度对香菇多糖含量的影响
提取温度对香菇多糖含量的影响见图2。
图2 提取温度对香菇多糖含量的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide from Lentinus edodes
由图2 可以得出，提取温度对香菇多糖提取影响较大。提取温度在40 ℃～50 ℃时，多糖含量随着提取温度升高而增加，提取温度为50 ℃时，多糖含量达到最大，说明在相对低温度时，纤维素酶活性随温度上升而增大。提取温度大于50 ℃，多糖含量迅速降低，这是因为提取温度超出了纤维素酶最适温度范围，酶发生变性或失活，催化反应降低，多糖含量也降低。提取温度不仅影响香菇多糖的溢出速度，还会影响纤维素酶的活性。因此在单因素试验条件下，最佳提取温度为50 ℃。
2.1.3 提取时间对香菇多糖含量的影响
不同提取时间对香菇多糖含量的影响见图3。
图3 提取时间对香菇多糖含量的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide from Lentinus edodes
由图3 可知，提取时间为1.0 h～1.5 h 时，多糖含量随着提取时间的延长而上升，在提取时间为1.5 h 时，多糖含量达到最大，当提取时间大于1.5 h 后，多糖含量降低。说明在1.5 h 提取完全后，随着加热的继续进行，多糖会发生降解，多糖含量也随之降低。因此在单因素试验条件下，最佳提取时间为1.5 h。
2.1.4 料液比对香菇多糖含量的影响
料液比对香菇多糖含量的影响见图4。
图4 料液比对香菇多糖含量的影响
Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharide from Lentinus edodes
由图4 可知，料液比在1∶15（g/mL）～1∶20（g/mL）时，随着溶剂体积的增加，多糖含量增加，在料液比达到1∶20（g/mL），香菇多糖含量达到最大，之后随着溶剂体积继续增大，多糖含量逐渐减小。由于溶剂添加量较小时，混合溶液中水分增多，随着溶剂添加量增大，香菇底物被稀释，反应物和纤维素酶的浓度减小，催化效率也随之降低，导致提取液中香菇含量的降低。因此在单因素试验条件下，1∶20（g/mL）为最佳料液比。
2.2 正交试验结果
香菇多糖含量的正交试验结果图见表2。方差分析结果见表3。
表2 正交试验结果
Table 2 Results of orthogonal test
?
表3 方差分析结果
Table 3 Results of analysis of variance
?
对正交试验结果进行分析，由R 值可知，4 个因素对香菇多糖含量的影响由大到小依次为A＞C＞D＞B，即纤维素酶添加量影响最高，其余依次为提取时间、料液比，提取温度对香菇多糖含量影响最小，由k 值比较可以得出，通过正交试验结果分析得出最优工艺为A1B3C2D1，即纤维素酶添加量0.4%、提取温度60 ℃、提取时间2 h、料液比1∶20（g/mL）。
2.3 验证试验
为验证工艺的准确性和合理性，根据正交试验得出结果，在最优的提取工艺A1B3C2D1 条件下进行3 次重复试验。结果显示，最优工艺下，香菇多糖含量平均值为5.73%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.73%，说明该工艺条件稳定可行。
2.4 香菇多糖抗氧化活性测定结果
2.4.1 香菇多糖还原能力的测定
香菇多糖还原能力的测定结果见图5。
图5 香菇多糖的还原能力
Fig.5 Reducing ability of polysaccharide from Lentinus edodes
由图5 可知，香菇多糖的还原能力随着其浓度的增加而逐渐增强，当香菇多糖质量浓度为1.0 mg/mL时，其总还原能力在700 nm 处的吸光度值为0.17，表明所提取的香菇多糖具有一定的总还原能力。但与相同质量浓度的抗坏血酸相比，香菇多糖的吸光度较小，说明香菇多糖的总还原能力略低。
2.4.2 香菇多糖对羟基自由基清除率的测定
香菇多糖对羟基自由基清除率的测定结果见图6。
图6 香菇多糖对羟基自由基的清除作用
Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging activity of polysaccharide from Lentinus edodes
由图6 可知，随着香菇多糖的浓度的增加，其清除羟基自由基的能力增加。当香菇多糖浓度为1.0 mg/mL时，羟基自由基清除能力达到最大，清除率为31.34%。香菇多糖对羟基自由基的清除作用高于同浓度的抗坏血酸，说明所提取的香菇多糖具有较强的羟基自由基清除能力。
3 结论
本研究采用酶解辅助法提取香菇多糖，对纤维素酶添加量、提取时间、提取温度和料液比4 个因素进行考察，通过单因素和正交试验优化得出最佳提取工艺：纤维素酶添加量0.4%、提取温度60 ℃、提取时间2 h、料液比1∶20（g/mL），通过验证试验得到香菇多糖含量为5.73%。此工艺得到香菇多糖的羟基自由基清除能力高于抗坏血酸，说明其具有良好的体外抗氧化活性。
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