肠道菌群是人体内最大且最复杂的微生态系统，包括超过100 万亿种微生物，如病毒、细菌、原生动物和真菌等[1]。肠道菌群在人体健康中起着十分重要的作用，是人类的重要器官。影响肠道菌群多样性的因素有很多，包括个体差异（种族、性别、年龄和健康状况等）和环境因素等。高分类群多样性、高微生物基因丰富度和稳定的微生物组功能核心是健康肠道菌群的特征。研究表明，肠道菌群失调与多种常见的代谢紊乱疾病有关，包括肥胖、Ⅱ型糖尿病、非酒精性肝病、心脏代谢疾病和营养不良等[2]。Turnbaugh 等[3]发现，将肥胖相关微生物群转移到瘦弱小鼠体内可导致其体重增加，且厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）的比例增高。另一项针对瘦弱个体和肥胖个体的宏基因组关联的研究表明，在肥胖个体中，谷氨酸发酵共生体多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）的丰度显著降低，并且与血清谷氨酸浓度呈负相关[4]。此外，用多形拟杆菌（B. thetaiotaomicron）灌胃小鼠可预防肥胖，这表明未来可以利用潜在的益生菌或微生物化合物针对肠道微生物群进行肥胖干预。
多糖是由十个以上的单糖分子通过糖苷键连接而成的生物大分子，广泛存在于植物、微生物、藻类和动物中[5]。多糖能够不被小肠消化，到达大肠被肠道菌群利用，影响肠道菌群的结构且产生有益代谢产物，进而影响人体健康。已有大量研究证实了多糖对肠道菌群结构的影响，例如，短链纤维低聚半乳糖的补充可以促进双歧杆菌（Bifidobacterium）和普氏栖粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）的丰度增加[6]，阿拉伯木聚糖可以促进超重人群中普氏菌属（Prevotella）和直肠真杆菌（Eubacterium rectale）的丰度增加[7]，金针菇多糖和枸杞多糖可以提高有益肠道微生物群的相对丰度，特别是双歧杆菌（Bifidobacterium） 和拟杆菌（Bacteroides）[8-9]。多糖经肠道菌群发酵后的主要代谢产物是短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），主要包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs 在胃肠道中有许多关键作用，动物研究表明，SCFAs 通过增加兴奋性胆碱能神经元的数量来刺激结肠收缩活动，从而影响胃肠道运动[10]。SCFAs 还具有介导作用，在黏膜微生物群和黏膜免疫系统之间架起沟通的桥梁，临床证据表明它具有与肠道炎症性疾病相关的显著抗炎和免疫调节作用[11]。在动物研究中，SCFAs 还与维持肠道屏障完整性[12]和通过多种机制调节食欲有关，包括刺激肝脏中的糖异生[13]。此外，SCFAs 通过降低肠道pH 值间接维持胃肠道稳态，这对于抑制酸敏感肠道病原体的生长很重要[14]。
关于多糖的体外酵解特性已经有大量的研究，但是不同结构的多糖对相同初始肠道菌群的影响研究较少。阿拉伯胶（gum arabic，GA）、山楂果胶（hawthorn pectin，HP）、阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）、瓜尔豆胶（guar gum，GG）、铁皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharides，DOP）和燕麦β-葡聚糖（oat βglucan，OG）是6 种研究较广泛的典型多糖，它们结构复杂，具有多种生物活性，表1 总结了6 种多糖的组成、结构及其生物功能[15-20]。体外酵解模型被广泛用来研究多糖的酵解特性，接种源可以来自选定微生物的纯培养物，也可以来自混合细菌培养物。与其他动物相比（小鼠、鸡等），猪在肠道菌群组成、解剖学、生理学和消化系统代谢方面与人类的相似度更高[21]。因此，本试验以6 种典型多糖为研究对象，利用体外酵解模型分析不同多糖对猪结肠微生物的影响，为多糖肠道酵解特性的构效关系研究奠定理论基础，促进多糖在食品工业中的应用。
表1 6 种多糖组成、结构及生物功能
Table 1 Composition，structure and biological function of six polysaccharides
多糖 组成 结构 生物功能阿拉伯胶 葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖主链：（1→3）和（1→6）连接的β-D-半乳糖单元以及（1→6）连接的β-D-吡喃葡萄糖醛酸单元；侧链：（1→3）、（1→4）和（1→6）连接的α-L-吡喃鼠李糖，β-D-葡萄糖醛酸，β-D-吡喃半乳糖，α-L-呋喃阿拉伯糖单元降血糖、抗糖尿病、调节免疫山楂果胶 半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖延缓胃排空，减少葡萄糖吸收，提高持水能力阿拉伯木聚糖同型半乳糖醛酸聚糖：（1→4）连接的α-D-半乳糖醛酸；鼠李半乳糖醛酸聚糖I：（1→2）连接的α-L-鼠李糖和（1→4）连接的α-D-半乳糖醛酸残基交替；阿拉伯糖、木糖 主链：β-1，4-吡喃木糖；支链：2，3 位L-呋喃阿拉伯糖 降低血糖水平、抑制胆固醇升高、调节免疫瓜尔豆胶 甘露糖、半乳糖 主链：α-D-甘露糖基单元通过β-D-（1-4）-糖苷键连接；侧链：α-D-半乳吡喃糖 降血糖、降胆固醇、预防肥胖铁皮石斛多糖调节免疫、抗肿瘤、胃肠保护燕麦β-葡聚糖甘露糖、葡萄糖 主链：葡甘露聚糖，1，4-β-D-吡喃甘露糖和1，4-β-D-吡喃葡萄糖；侧链：1，3-、1，4-或1，6-连接的糖基残基葡萄糖 β-D-吡喃葡萄糖由1，3-和1，4-糖苷键连接 调节免疫、抗肿瘤、抗糖尿病、降胆固醇
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阿拉伯胶、瓜尔豆胶：北京索莱宝科技有限公司；山楂果胶[22]、阿拉伯木聚糖[23]、铁皮石斛多糖：由天津科技大学食品科学与工程学院512 实验室分离纯化制得；燕麦β-葡聚糖：广州中康食品有限公司；混合短链脂肪酸标准品（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、己酸、庚酸）：美国Sigma 公司。猪结肠消化物取自天津地区6 只健康长白猪（3～4 月龄）结肠，市场体重约65 kg，实验用猪在天津农博养猪场经过专业饲养。
1.2 仪器与设备
GC2010 Plus 热脱附气相色谱仪：日本岛津公司；LDZH-200KBS 高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；YOX-II 厌氧培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；LD-10 高速大容量冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；LP Vortex Mixer 加热磁力搅拌器：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ZWY-103B 摇床：上海智能分析仪器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 猪结肠消化物制备
将收集到的6 头猪的结肠消化物等量混合，储存在-80°C 中备用。
1.3.2 体外酵解
体外酵解体系中6 种多糖样品分别作为唯一碳源，浓度为1%。根据Ying 等[24]的方法，接种10%的猪结肠消化物。按照Ding 等[25]的方法进行体外酵解试验。称取0.02 g 多糖置于离心管中，加入2 mL 厌氧培养基，在60 ℃磁力搅拌器上溶解过夜，称取0.2 g 猪结肠消化物在15 mL 离心管中，将多糖溶液加入其中，搅拌均匀。以不添加多糖的厌氧培养基为空白对照组（blank control，BC）。离心管用密封膜密封，放入厌氧袋中，于37 ℃摇床中进行酵解培养。分别在酵解0、12、24 h 和48 h 后取出相应的样品，以11 000 r/min 离心20 min，上清液用于短链脂肪酸的测定，沉淀物用于肠道菌群的测定。
1.3.3 SCFAs 的测定
取1 mL 上清液，加入0.5 μL 二乙基丁酸作为内标，混匀后过0.22 μm 水系滤膜，进热脱附气相色谱仪检测。以混合酸标准品（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、己酸、庚酸）与内标物质（二乙基丁酸）的质量之比为横坐标，以标准品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，建立标准曲线。
气相色谱测定条件：载气为氮气，流速14 mL/min，色谱柱为NukolTM Fused Silica Capillary Column（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度200°C，检测器（flame ionization detector，FID）温度250°C，升温程序：100 ℃下以10 ℃/min 升温到200 ℃，然后保持10 min，共运行20 min。
1.3.4 肠道菌群的测定
将6 种多糖酵解液离心后得到的菌体沉淀送检，完成16S rDNA 基因测序，进行肠道菌群的分析。
1.4 数据处理
试验测定得到的数据使用SPSS 17.0 分析软件通过单因素方差分析ANOVA 和多重比较法Duncan 进行统计分析，分析得到的结果使用平均值±标准差进行表示，当P＜0.05 时说明差异显著，结果具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 6 种多糖酵解液中SCFAs 的变化
6 种多糖样品体外酵解产生的SCFAs 结果如表2所示。
表2 6 种多糖样品体外酵解产生的SCFAs 含量
Table 2 SCFAs production of six polysaccharides samples after fermetation
SCFAs 含量/（mmol/L）BC GA HP AX GG DOP OG SCFAs 酵解时间/h乙酸 0 4.26±0.89a 2.77±0.19a 4.13±0.98a 7.71±1.28a 5.06±0.46a 15.13±0.72a 6.69±2.02a 12 7.37±5.08a 8.19±2.78a 10.87±2.98ab 16.47±1.09a 19.39±7.32a 48.40±9.28b 44.03±18.08b 24 7.54±1.73a 5.80±0.05a 4.51±2.26a 7.25±0.51a 3.80±0.75a 18.50±5.85a 10.08±2.85ab 48 8.70±4.73a 19.71±1.35b 15.07±0.90b 36.72±24.95a 10.36±4.03a 17.17±0.06a 13.85±1.72ab丙酸 0 1.34±0.01a 1.15±0.02a 1.51±0.52a 2.43±0.30a 1.80±0.13a 2.54±0.23a 1.87±0.38a 12 2.22±1.21a 2.25±0.67a 3.48±0.90ab 3.86±0.40a 6.41±3.03a 6.66±0.74b 6.25±1.92ab 24 1.99±0.04a 2.41±0.07a 1.70±0.55ab 3.62±0.07a 2.69±0.39a 4.01±0.91a 3.55±1.59a 48 3.03±1.15a 12.75±0.28b 4.22±0.62b 12.24±7.38a 5.12±1.31a 6.99±0.04b 9.63±1.20b异丁酸 0 0.26±0.02a 0.29±0.04a 0.28±0.06a 0.36±0.01a 0.35±0.05a 0.40±0.10a 0.27±0.02a 12 0.36±0.08a 0.29±0.03a 0.42±0.01a 0.52±0.18a 0.41±0.08a 0.73±0.32a 0.58±0.13a 24 0.50±0.02ab 0.45±0.01b 0.41±0.08a 0.44±0.04a 0.33±0.04a 0.46±0.01a 0.42±0.10a 48 0.83±0.17b 0.46±0.01b 0.78±0.11b 1.11±0.49a 0.74±0.03b 0.92±0.02a 1.27±0.05b丁酸 0 1.33±0.08a 1.18±0.01a 1.37±0.56a 2.31±0.04a 1.67±0.01a 2.09±0.26a 1.61±0.15a 12 2.71±1.32a 2.55±0.51b 4.22±0.90bc 3.76±0.48a 3.84±1.06ab 5.78±0.48b 4.68±0.84b 24 2.35±0.03a 2.47±0.07b 3.09±0.71ab 5.10±0.09a 2.11±0.27a 3.47±0.61a 1.94±0.29a 48 3.36±1.06a 4.41±0.01c 6.14±0.51c 12.53±6.77a 6.34±1.51b 15.03±0.48c 8.81±0.58c
续表2 6 种多糖样品体外酵解产生的SCFAs 含量
Continue table 2 SCFAs production of six polysaccharides samples after fermetation
注：同列不同字母表示具有显著性差异（P＜0.05）；-表示未检出。
SCFAs 含量/（mmol/L）BC GA HP AX GG DOP OG SCFAs 酵解时间/h异戊酸 0 0.32±0.01a 0.38±0.03ab 0.29±0.08a 0.44±0.03a 0.38±0.02ab 0.44±0.02a 0.45±0.05a 12 0.43±0.10a 0.34±0.01a 0.54±0.04b 0.64±0.22a 0.45±0.01b 0.61±0.01b 0.50±0.04a 24 0.53±0.06a 0.47±0.02c 0.47±0.05ab 0.51±0.02a 0.34±0.02a 0.44±0.01a 0.32±0.03a 48 0.82±0.09b 0.44±0.01bc 0.88±0.06c 1.73±0.31b 1.07±0.05c 1.60±0.01c 2.29±0.08b戊酸 0 0.23±0.02a 0.21±0.03a 0.25±0.09a 0.40±0.01a 0.31±0.01a 0.35±0.04a 0.28±0.04a 12 0.30±0.13a 0.32±0.04b 0.38±0.04a 0.41±0.05a 0.48±0.06a 0.67±0.01a 0.58±0.10a 24 0.28±0.01a 0.28±0.01ab 0.19±0.04a 0.83±0.01a 0.36±0.06a 0.46±0.07a 0.29±0.03a 48 0.40±0.14a 0.42±0.01c 0.64±0.05b 3.79±0.81b 2.53±0.82b 5.29±0.22b 6.70±0.17b异己酸 0 0.09±0.01a 0.09±0.01a 0.09±0.01a 0.10±0.01a 0.09±0.01a 0.09±0.01a 0.09±0.01a 12 0.09±0.01a - 0.10±0.01a 0.10±0.01a 0.13±0.03a 0.11±0.01a 0.17±0.01b 24 0.28±0.01b 0.26±0.02b 0.15±0.04a 0.11±0.01a 0.10±0.01a 0.10±0.01a 0.09±0.01a 48 0.36±0.09b 0.29±0.01b 0.31±0.02b 0.10±0.01a 0.09±0.01a 0.10±0.01a 0.09±0.01a己酸 0 0.09±0.01a 0.09±0.01a 0.10±0.01a 0.13±0.01a 0.11±0.01a 0.12±0.01a 0.12±0.01a 12 0.11±0.02a 0.12±0.01a 0.14±0.01a 0.13±0.01a 0.15±0.01a 0.19±0.01a 0.16±0.01a 24 0.12±0.02a 0.08±0.03a 0.09±0.02a 0.14±0.01a 0.10±0.01a 0.16±0.03a 0.08±0.03a 48 0.11±0.02a 0.12±0.01a 0.27±0.03b 0.68±0.11b 0.34±0.09b 0.77±0.04b 0.96±0.04b庚酸 0 0.09±0.01a - 0.09±0.002a 0.1±0.01a 0.10±0.01a 0.09±0.01a 0.10±0.01a 12 0.10±0.01a - 0.09±0.01a - 0.09±0.01a 0.11±0.01b 0.10±0.01a 24 - - - - - - -48 0.09±0.01a - - 0.11±0.01b 0.09±0.01a 0.09±0.01a 0.11±0.01a总酸 0 8.01±1.01a 6.25±0.13a 8.12±2.31a 13.98±1.60a 9.88±0.63a 21.25±0.05a 11.48±2.66a 12 13.69±7.96a 14.22±4.03a 20.25±4.87ab 25.96±2.43a 31.35±11.44a 63.27±10.18c 57.04±20.89b 24 13.70±1.74a 12.30±0.02a 10.70±3.74a 18.08±0.71a 9.91±1.53a 27.70±7.46ab 16.84±4.80ab 48 17.69±7.44a 38.68±1.60b 28.40±2.30b 69.01±40.82a 26.68±7.83a 47.97±0.70bc 43.72±3.75ab
由表2 可以看出，6 种多糖样品组在酵解48 h 时产生的总酸含量均高于无碳源的空白对照组。乙酸、丙酸和丁酸是6 种多糖样品体外酵解过程产生的主要SCFAs。与空白对照组相比，添加了不同多糖的样品组产生的乙酸、丙酸和丁酸的含量整体较高。GA、HP和AX 在酵解48 h 后乙酸含量达到最大值，GG、DOP 和OG 在酵解12 h 后乙酸含量达到最大值。相比于其他多糖组，DOP 和OG 在酵解12 h 产生的乙酸含量较高，分别为（48.40±9.28）mmol/L 和（44.03±18.08）mmol/L，GA 产生的乙酸含量最低。酵解12 h后，GG 的丙酸含量达到最大值，其余多糖组均在酵解48 h后丙酸含量达到最大值。GA 产生的丙酸含量最高，酵解48 h 时最高含量为（12.75±0.28）mmol/L，其次是OG，HP 产生的丙酸含量最低。DOP 和OG 在酵解的48 h产生的丁酸含量较高，分别为（15.03±0.48）mmol/L 和（8.81±0.58）mmol/L，GA 产生的丁酸含量最低。此外，除乙酸、丙酸和丁酸外，其他6 种SCFAs 的含量变化并不明显。
多糖被肠道菌群利用，产生的SCFAs 对宿主有许多有益的健康结果。本试验中，乙酸是产生的最主要的SCFAs，乙酸既是肠道外周细胞和肝脏的能量来源，也是糖异生和脂肪生成代谢途径中的信号分子[26]。丙酸和丁酸也是6 种多糖体外酵解产生的较为重要的SCFAs。大约90%的丙酸通过门静脉输送到肝脏，其中很大一部分用于糖异生和抑制胆固醇合成[27]。丁酸作为结肠上皮细胞的能量来源，提供60%～70%的总能量需求[28]。它还可以调节细胞凋亡途径，这有助于预防结肠癌、减少炎症发生并改善屏障功能[29]。Kishimoto 等[30]研究表明，GA 可以被肠道菌群利用产生SCFAs 且能够促进丙酸的产生。本试验中GA 体外酵解产生的丙酸含量最高。与其他多糖相比，HP 在酵解48 h 时产生的总脂肪酸含量较低，可能是因为它含有较高的半乳糖醛酸，而猪结肠消化物发酵糖醛酸的能力很差[31]。
2.2 6 种多糖对猪结肠微生物的影响
本试验采用16S rDNA 扩增子测序技术，评估了6 种多糖样品在酵解24 h 后对肠道菌群组成的影响（24 h 是发酵过程中的一个重要时间点，此时大部分多糖被肠道菌群降解，代谢物及菌群结构都发生较大变化）。肠道菌群样品的各组命名情况如下：BC0、BC24分别代表酵解0 h 和24 h 的空白对照组，GA24、HP24、AX24、GG24、DOP24 和OG24 分别代表酵解24 h 时的各样本组。
2.2.1 物种多样性曲线
稀释曲线和等级聚类曲线是两个从不同角度来阐述物种多样性的曲线。稀释曲线逐渐趋于平稳，说明物种达到饱和状态，此时说明测序数据量是合理的。等级聚类曲线可以用来反映物种的丰富度和均匀度，水平方向上线条的宽度越大，代表物种种类就越多，垂直方向上曲线越平滑代表物种分布越均匀。图1 为8 组样品的稀释曲线，图2 为8 组样品的等级聚类曲线。
图1 稀释曲线
Fig.1 Rarefaction curve
图2 等级聚类曲线
Fig.2 Rank cluster curve
由图1 可知，随着横坐标测序量的逐渐增加，各组曲线都逐渐走向平稳，说明测序数据量渐进合理。
由图2 可知，在垂直方向上8 组曲线均越来越平缓，说明物种分布都越来越均匀。
2.2.2 基于OTU 的韦恩图分析
根据聚类得到的OTU 结果，绘制韦恩图分别展示了6 种多糖样品酵解24 h 与空白对照组酵解0 h 共有和特有的OTU，韦恩图如图3 所示。
图3 6 种多糖样品组和空白对照组基于OTU 的韦恩图
Fig.3 Venn figure based on OTU of the six polysaccharide sample groups and the blank control group
由图3 可知，与空白对照组酵解0 h 相比，GA、HP、AX、GG、DOP 和OG 酵解24 h 后特有的OTU 数分别为134、87、60、51、41 和42。可以看出，与其他4 种样品相比，酵解24 h 后的GA 和HP 特有的OTU 数较高，说明酵解24 h 后，GA 和HP 更能促进肠道微生物的多样性。
2.2.3 Alpha 多样性指数分析
Chao1 指数、Abundance-based Coverage Estimator指数（ACE 指数）、Shannon 指数、Simpson 指数、覆盖率等都是Alpha 多样性指数，可以衡量物种丰度及物种多样性，指数越高，表明物种数量和多样性越高。表3 展示了6 组样品的Alpha 多样性指数。
表3 Alpha 多样性指数统计
Table 3 Alpha diversity index statistics
样品名称观察到的物种数Shannon指数Simpson指数Chao1指数ACE指数 覆盖率GA24 363 5.229 0.920 402.060 408.709 0.998 HP24 279 3.507 0.745 311.571 320.707 0.998 AX24 205 3.650 0.837 258.636 274.240 0.998 GG24 195 2.824 0.664 244.500 245.894 0.998 DOP24 179 3.099 0.768 221.500 224.375 0.998 OG24 192 3.111 0.810 216.256 225.648 0.998
由表3 可以看出，此次测序各组的覆盖率均在0.99 以上，说明结果可以代表样本中微生物群落的真实情况，可信度较高。GA24 的Chao1 指数、ACE、Shannon 指数、和Simpson 指数是6 组样品中最高的，说明GA24 中的包含的物种数量较多且物种的均匀度和多样性也较高。综合来看，HP24 的各指数排在第二位，这与韦恩图的结果相符。与其他5 组样品相比，OG24 中Chao1 指数和ACE 指数较低，说明其含有的物种数量较少。GG24 的Shannon 指数和Simpson 指数最低，说明其物种多样性低于其他组。综上所述，6 组样品分别展示了不同的Alpha 多样性指数，说明6 组样品的物种丰富度和多样性存在差异，且GA24 的物种丰富度和多样性较高。
2.2.4 UPGMA 聚类树分析
非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）是一种聚类分析方法，以距离为标准对样品进行聚合，两个样品合并成一个再与另外的样品进行比较，重复这个过程直到所有被测样品都聚到一起，形成聚类树，以此分析样品间的相似与差异。图4 展示了8 组样品基于Weighted Unifrac距离的UPGMA 聚类树。
图4 基于weighted unifrac 距离的UPGMA 聚类树
Fig.4 The UPGMA clustering tree based on weighted unifrac distance
由图4 可以看出，酵解24 h 后，GG 和DOP 是距离最小的，二者与AX 的距离也较近，说明3 组的微生物群落较相似。GA 和HP 与其他组的距离较远，说明这两组与其他组的微生物群落之间存在较大差异。
2.2.5 肠道菌群物种组成变化分析
物种分布柱状图可以显示不同物种在菌群中所占的相对丰度比例。图5 为6 种多糖样品酵解24 h 时在门水平对肠道菌群的影响（图中显示了丰度水平前十的物种）。
图5 6 种多糖样品在门分类水平上的物种相对丰度柱形图
Fig.5 Bar plot of prevalence at the phylum level of six polysaccharides samples
由图5 可以看出，各组均主要由厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、软壁菌门（Tenericutes）、放线菌门（Actinobacteria）、广古菌门（Euryarchaeota）和螺旋体门（Spirochaetes）等组成，其中，厚壁菌门（Firmicutes）在每个样本中的相对丰度最大。与空白对照组相比，酵解24 h 后，GA 和HP 的拟杆菌门（Bacteroidetes）所占比例升高，HP、AX、GG、DOP 和OG 的厚壁菌门（Firmicutes）所占比例升高，变形菌门（Proteobacteria）所占比例降低。酵解24 h 后，GA 和HP 的厚壁菌门（Firmicutes）/拟 杆 菌 门（Bacteroidetes） 的 比 值（9.93，35.62）低于空白对照组（40.80）。研究表明，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的比例与肥胖有很大的相关性，在肥胖模型中，厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes）的比值会有所升高[32-33]，说明GA 和HP 在一定程度上对肥胖的抑制有积极作用。此外，厚壁菌门和拟杆菌门的比例与其他疾病之间也有一定关系，如Ⅱ型糖尿病患者中厚壁菌门和拟杆菌门的比例显著升高，而炎症性肠病患者中二者的比例有所降低[34]。
图6 为6 种多糖样品酵解24 h 时在属水平对肠道菌群的影响。
图6 6 种多糖样品在属分类水平上的物种相对丰度柱形图
Fig.6 Bar plot of prevalence at the genus level of six polysaccharides samples
由图6 可以看出，与空白对照组相比，酵解24 h后，6 组中嗜冻菌属（Peptoniphilus）、链球菌属（Streptococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、土孢杆菌属（Terrisporobacter）的相对丰度降低，HP、AX、GG、DOP 和OG 的厌氧球菌属（Anaerococcus）的相对丰度降低，乳杆菌属（Lactobacillus）和梭菌目（Clostridiales）所占比例升高，且DOP 中梭菌目（Clostridiales）的相对丰度最高，OG 中的乳杆菌属相对丰度最高，其次是AX和DOP。GA 中布劳特氏菌属（Blautia）的相对丰度升高。研究表明，消化链球菌属（Peptostreptococcus）的丰度与口腔鳞状细胞癌呈正相关[35-36]。乳杆菌属（Lactobacillus）大多为有益菌，在健康个体肠道中大量存在，不仅可以抑制致病菌的生长，维持胃肠道正常生理功能，还有着降血压、降血脂、提高免疫力的作用[37]。马红梅等[38]研究发现Ⅱ型糖尿病患者空腹血糖水平与肠道乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度呈负相关。Ma 等[39]研究表明，梭菌属（Clostridium）可以代谢胆汁酸，使其含量增加，促进循环中自然杀伤T 细胞数量的增加，从而增强小鼠细胞免疫力。布劳特氏菌属（Blautia）是一种重要的SCFAs 产生菌，具有抗炎作用，有助于恢复肠黏膜损伤，与内脏脂肪含量呈负相关，并在代谢紊乱中发挥有益的治疗作用[40]。总体而言，6 种多糖可以抑制有害菌属的增长，促进有益菌属的增殖，对人体健康存在潜在益处。
物种丰度聚类热图的颜色对比可以明显看出各样品的差异，不同颜色的绘制依据每组样品的物种组成和相对丰度信息情况，颜色越深代表菌群越丰富，颜色越浅代表菌群含量较低。图7 是选取丰度排名前35 的种作出的BC0、BC24 和6 种多糖样品组酵解24 h 时的物种丰度聚类热图。
图7 物种丰度聚类热图
Fig.7 Species abundance cluster heatmap
由图7 可知，GG24 中尖锐粪球菌（Coprococcus catus）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、双孢梭菌（Clostridium disporicum）的丰度升高，AX24 中粘膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae）含量较高，GA24 中卵形布劳特氏菌（Blautia obeum）、杜雷拟杆菌（Bacteroides dorei）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）的丰度升高，DOP24 中丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、博尼曼梭菌（Clostridium bornimense）、瘤胃乳酸杆菌（Lactobacillus ruminis）的丰度升高，OG24 中食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、厄尔纳拉乳杆菌（Lactobacillus ultunensis）的丰度升高。整体来看，各组中丰度较高的物种主要属于乳杆菌属（Lactobacillus） 和梭菌属（Clostridium），这与属水平上的物种相对丰度柱形图相对应。Alavi 等[41]通过分析卵形布劳特氏菌（B.obeum）基因组发现存在编码胆盐水解酶的基因（bile salt hydrolases，bsh），该酶通过降解牛磺胆酸盐抑制毒素共调菌毛蛋白A 基因（toxin-coregulated pilin A，tcpA）表达，从而减少人类腹泻病原体霍乱弧菌的定殖。反之，缺乏这种肠道微生物将会增加霍乱弧菌感染负荷。丁酸梭菌（C.butyricum）是常见的产丁酸盐的细菌，可以通过调节Wnt 信号传导和肠道微生物群来抑制肠道肿瘤的发展[42]，DOP 中此菌含量较高，同时这与SCFAs 结果中DOP 产生了较高含量的丁酸相呼应。Yang 等[43]的研究结果表明，瘤胃乳酸杆菌（L.ruminis）可缓解小鼠的结肠炎，包括抑制结肠缩短和结肠组织损伤，这可能与抑制促炎细胞因子表达、上调SCFAs 和恢复肠道菌群失衡有关。这些结果再次表明了6 种多糖可以促进有益菌的产生，具有作为益生元潜力。
2.3 构效分析
多糖的酵解特性受到多种因素影响，从而导致其对肠道菌群结构及一系列代谢产物的影响不同。多糖的结构是影响其酵解特性的一个十分重要因素，如分子量、单糖组成以及糖苷键的类型等。Charoensiddhi 等[44]从一种棕色海藻边花昆布中提取出4 种多糖组分，体外酵解试验表明，富含高分子量多糖部分（high molecular weight polysaccharide-enriched fraction，HPF）与富含低分子量多糖的部分（low molecular weight polysaccharide-enriched fraction，LPF）均能促进SCFAs 产生并促进益生菌的增殖，如双歧杆菌、乳酸菌等，但是，HPF比LPF 显示出更大的改善肠道健康的潜力。Min 等[45]通过对青钱柳叶多糖的体外酵解结果分析发现，半乳糖醛酸更容易被肠道菌群降解，可能是发酵过程中乙酸的主要生产者。Hu 等[46]研究表明富含阿拉伯糖和木糖的多糖发酵主要导致丙酸产量增加。此外，Cantu-Jungles 等[47]的研究表明，与支链（1→3）、（1→6）连接的β-D-葡聚糖相比，（1→3）连接的β-D-葡聚糖表现出更快的发酵曲线。Gu 等[48]表明，与α-（1→6）连接相比，异麦芽糖/麦芽多糖的α-（1→4）连接的葡糖基残基被肠道微生物群优先利用。一般来说，多糖越复杂，肠道中能够发酵它的细菌就越少。这是因为结构更复杂的多糖需要更多的细菌酶协同作用才能完全糖化。虽然许多拟杆菌属物种可以在木糖和葡萄糖上生长，但只有少数类群具有利用木葡聚糖的遗传机制[49]。低聚果糖可以归类为低特异性膳食纤维，因为许多细菌类群能够获取和降解它们[50]。
Jonathan 等[31]对柑橘果胶和海藻酸盐的体外酵解特性进行了比较，它们都含有较高含量的糖醛酸，尽管两种接种物在化学结构以及气体产量和总SCFAs产量方面存在差异，但二者酵解后产生的乙酸盐比例同样高。本研究中，GA 和HP 产生的乙酸含量最接近，且乙酸变化趋势相同，可能是二者都含有一定量的糖醛酸。Mikkelsen 等[51]研究表明，几种混合膳食纤维发酵产生的乙酸含量较高，可能是因为其葡萄糖含量较高，刺激乙酸产生。本研究中，DOP 和OG 产生的乙酸含量较高，这可能是因为与其他多糖相比，二者的葡萄糖含量较高。GG 和魔芋葡甘聚糖都可以被相同的（1→4）连接的β-D-甘露聚糖酶降解[52]。本研究中，基于weighted unifrac 距离的UPGMA 聚类树分析结果表明，GG 和DOP 的微生物群落较相似，这可能是因为二者都含有（1→4）连接的β-D-甘露聚糖，可以被相同的（1→4）连接的β-D-甘露聚糖酶降解，从而刺激产生（1→4）连接的β-D-甘露聚糖酶的微生物群的生长。然而，除了结构之外，多糖的一些物理特性，如溶解性、黏度等，酵解过程中的各种因素如温度、时间、pH 值、肠道菌群等都会对多糖的酵解特性产生影响，因此，不同多糖表现出的酵解特性受到各种因素限制，需要更进一步的实验研究进行分析及验证其酵解特性和结构的关系。
3 结论
本试验通过体外酵解模型对6 种多糖的酵解特性进行分析。通过在厌氧条件下酵解0、12、24、48 h，测定6 种多糖对SCFAs 和肠道菌群的变化的影响。SCFAs变化结果表明，6 种多糖产生的SCFAs 均以乙酸、丙酸和丁酸为主。肠道菌群结果分析表明，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为酵解过程中的优势菌门。综合SCFAs 和肠道菌群的结果来看，DOP 和OG 的酵解特性较好。
多糖的酵解特性受多种因素的影响，从而导致其对肠道菌群结构及一系列代谢产物的影响不同，多糖自身的结构是其中的一个重要因素，导致6 种多糖不同酵解特性的原因有待进一步研究。
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