桑葚为桑科桑树的果实，是我国种植与消费最为广泛的水果之一，因其丰富的营养价值而受到消费者广泛青睐[1]。桑葚果实艳丽，口感酸甜，并且富含多种功能活性成分，特别是花青素类物质含量丰富，赋予了桑葚紫红色果皮，相关研究表明桑葚中花青素类物质能够加快自由基清除速率，减少机体自由基产生[2]。也有研究表明桑葚提取物可以很大程度上减少DNA损伤，抑制癌细胞生成，防止细胞癌变[3]。基于其丰富的活性成分含量，我国将其作为功能食品进行加工销售，桑葚营养丰富但极不耐贮藏，除将其干制外，食品加工行业还将大量桑葚榨汁后进行发酵制作桑葚酒以延长其贮藏期，提高产品附加值[4-5]。桑葚酒色泽是其感官品质的重要指标，也是决定其销量和消费者满意程度的决定因素之一[6]。相关研究表明桑葚酒中游离花青素及花青素聚合物的互补效应对桑葚酒的颜色及风味品质起到了决定性作用[7]，然而在发酵及陈酿过程中，桑葚酒中花青素对光照、pH 值、温度等因素极为敏感，这导致桑葚酒的感官特性及其抗氧化效果欠佳[8]。此外，在桑葚酒酿造过程中需要将其陈酿以获得更加柔和的风味，但是陈酿过程极为缓慢，无形之中增加了桑葚酒生产成本。
随着人们对于经济环保类加工方式需求的增加，超声波作为重要的非热加工技术而广泛应用于食品加工行业，超声波处理果蔬制品具有机理简单、无化学残留物、安全性较高、能耗较低及产品质量劣变较小等优点。超声波技术目前已广泛应用于辅助提取、杀菌、干燥、冻融、清洗及均质等食品加工领域，能够显著提高处理速率及产品品质[9]。相关研究表明超声波处理液体酒样时存在空化效应，这种效应是指液体在超声作用下被激活或产生空化气泡，并伴随着空化气泡的振荡、增大和破裂，并在很短的时间内导致局部高温和高压[9]。这种作用加速了酒类老化过程中的复杂反应，如聚合、缩醛化、酸化、酯化和裂化的进程。大量相关研究表明适宜的超声波处理能够促进葡萄酒中花青素类物质的转化，加速其陈酿过程，提高葡萄酒的色泽及营养品质[10]。但与葡萄不同的是，桑葚中花青素种类及含量与其差异明显，不同花青素的物理及化学性质差异显著。此外极少文献报道超声波处理对桑葚酒中花青素含量及抗氧化能力的影响。因此本文研究超声波处理对桑葚酒色泽、花青素含量及抗氧化能力的影响以期为促进桑葚酒的陈酿，降低其加工成本、提高其生产品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚品种为红果2 号，2021 年6 月采自河南省。桑果采摘遵循随机性原则，采摘全紫色成熟期无病虫害且大小均匀桑果，采摘完毕后及时预冷并带回实验室待后续榨汁发酵。
酒石酸钾钠、氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、亚铁氰化钾、亚甲基蓝、焦亚硫酸钾（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；2，2-二苯基-1-吡啶并肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2＇-Azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、水溶性维生素E（Trolox）、维生素C（均为色谱纯）：上海源叶股份科技有限公司；F15 商业酵母：法国拉氟德公司。
1.2 仪器与设备
HH-S6 型双列六孔型电热水浴锅：北京科伟有限公司；SB—5200DTNT 型超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；LC—JY88—IIN 型超声波处理器：上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV-mini1240 型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；Thermo Vanquish 型超高效液相色谱仪（配备Q-Exactive HF 型高分辨质谱）：美国赛默飞世尔科技公司；CM-5 型LAB 色差计：日本柯尼卡公司。
1.3 方法
1.3.1 桑葚酒发酵条件
桑葚酒发酵条件参考孔燕等[8]的方法，将桑葚洗净后榨汁，加入50 mg/kg 的偏亚硫酸氢钾作为防腐剂以获得抗菌效果，利用蔗糖调整糖度为21°Brix，加入0.03%商业酵母菌F15 在25 ℃恒温培养箱中发酵8 d，发酵结束后，倒灌除去酒脚。桑葚酒的理化特性：酒精度8%vol，总酸度（以酒石酸计）为7.9 g/L，pH3.55。
1.3.2 超声波处理桑葚酒
在室温（25 ℃）下使用频率为20 kHz、直径为10 mm的聚能探针式超声波粉碎器对所得桑葚酒进行超声处理[7]。经过前期预试验及查阅相关文献确定超声功率为100、200、300 W 和400 W，处理时间为20 min，每个试验处理重复3 次。经过超声波处理后，桑葚酒立即倒入玻璃瓶中密封并在黑暗室温下贮藏，一个月之内每隔两周进行取样测定。
1.3.3 桑葚酒CIELAB 颜色参数分析
利用标准LAB 色差计测量桑葚酒的L*值（亮度值）、a*值（红色值）及b*值（黄色值），并计算色差值ΔE、饱和度C*值及色调角h 值，计算公式如下[7]。
式中：ΔL*为超声处理前后桑葚酒亮度值差；Δa*为超声处理前后桑葚酒红色值差；Δb*为超声处理前后桑葚酒黄色值差。
1.3.4 桑葚酒色度及色调值测定
色度值（color density，CD）定义为桑葚酒在620、520 nm 和420 nm 处吸光度的10 倍加和，色调值（color tint，CT）定义为桑葚酒在420 nm 及520 nm 处吸光度的比率，相关公式如下所示[11]。
1.3.5 桑葚酒总色素、聚合色素、亚硫酸盐稳定颜色及酒龄参数的测定
采用紫外分光光度法对桑葚酒中与花色苷相关的色值进行测定[12]，其总色素（wine color due to pigments，WCP）测定方法：利用1.0 mol/L 盐酸将0.5 mL桑葚酒稀释20 倍。混匀后在黑暗中平衡30 min 后利用紫外分光光度计在520 nm 处测量其吸光度。计算公式如（6）所示。
桑葚酒中聚合色素（wine color，WC）的测定方法：将15 mg 亚硫酸钠加入5.0 mL 桑葚酒中，45 min 后，利用紫外分光光度计在520 nm 处测量混合溶液的吸光度。计算公式如（7）所示。
桑葚酒亚硫酸盐稳定颜色（color due to pigment resistant to SO2，CDRSO2）的测定方法：将75 μL 20%焦亚硫酸钠溶液加入至5.0 mL 桑葚酒中。混匀平衡10 min后利用紫外分光光度计在520 nm 处测量溶液吸光度。
桑葚酒酒龄（chemical age of wine，CAW）为亚硫酸盐稳定颜色与聚合色素百分比（%），计算公式如（8）所示[7]。
1.3.6 桑葚酒中单体花青素含量测定
利用超高效液相色谱串联质谱法对桑葚酒中单体花青素含量进行测定[7]。利用反相C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）分离花青素。色谱条件：流动相A 为5%甲酸，溶流动相B 为乙腈，梯度程序:0～3 min，6%B；3 min～6 min，6%～13% B；6 min～26 min，13%～30% B；26 min～28 min，30%～95%B；28 min～30 min，95%～95%B；30 min～32 min，95%～6%B；32 min～35 min，6%B。进样量为2.0 μL，流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃。电喷雾电离分析设置为正离子模式，氮气为碰撞气体。质谱参数：毛细管电压为3 kV，锥电压为30 V，源温度为300 ℃，去溶剂温度为250 ℃，洗脱剂为流速为650 L/h的氮气。
1.3.7 桑葚酒抗氧化能力测定
桑葚酒的抗氧化能力以DPPH 自由基清除能力、铁离子还原力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）、羟基自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力表示，具体步骤参考Azevedo 等[13]研究方法。
1.4 数据分析
使用SPSS 18.0 进行数据分析，所得数据之间的相关性采用标准皮尔逊相关性分析，数据结果以3 个独立试验的平均值±标准差表示。利用邓肯氏检验分析，p＜0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 超声波处理对桑葚酒外观色泽的影响
2.1.1 超声波处理对桑葚酒L* 值、a* 值、b* 值、ΔE值、C*值及h 值的影响
从超声波产生的空化效应来看，超声功率是其产生的重要因素[7]。果酒在贮藏过程中颜色特征通常利用L*值、a*值、b*值、ΔE 值、C*值及h 值进行评估[14]。不同功率超声波处理及贮藏时间下桑葚酒的L*值、a*值、b*值、ΔE 值、C*值及h 值如图1 所示。
图1 不同超声功率下桑葚酒的L*值、a*值、b*值、ΔE 值、C*值及h 值
Fig.1 L*，a*，b*，ΔE，C*，and h values of mulberry wine at different ultrasonic power
不同小写字母代表具有显著性差异（p＜0.05）。
由图1 可知，未经超声波处理的桑葚酒在贮藏过程中其L* 值、a* 值及b* 值皆呈现先上升后下降趋势，并且在贮藏结束后其值均显著小于初始阶段（p＜0.05），这也导致了果酒色差值ΔE 的显著增加。产生这一现象的主要原因为花青素在贮藏过程中的降解。桑葚酒经贮藏4 周后，超声处理组L*值、a*值、b*值整体上均显著高于未处理对照组，这表明所有功率条件下超声波处理均对其颜色具有积极的保护效应，这也与Li 等[7]的研究结果类似。在富含花青素类果酒的制作过程中，红色值a*被视为一个重要的衡量其色泽的指标，高a*值果酒通常被认为其色泽品质更佳[15]，因此超声波可作为增强果酒红色值a*的良好方式，提高桑葚酒色泽品质。贮藏结束后，相较于其他功率超声处理，300 W超声波处理下桑葚酒的L*值及a*值较高，ΔE 值较低，分别为4.5、23.6 及4.2，较低的ΔE值果酒被认为其在贮藏过程中花青素降解较为稳定。此外果酒的饱和度C*值及色调角h 值也是衡量果酒色泽的重要参数，未超声处理桑葚酒经过4 周贮藏后其饱和度C*值下降，色调角h 值略有上升。桑葚酒经不同功率超声波处理贮藏4 周后其饱和度C*值及色调角h 值均显著高于未处理组，其中300 W 功率超声波处理下桑葚酒的C*值及色调角h 值较高，分别为24.4 及0.24。综上，超声波处理能够提高桑葚酒L*值、a*值、b*值、C*值及h 值，降低ΔE 值，300 W功率超声波处理可能是保护桑葚酒色泽的良好条件。
2.1.2 超声波处理对桑葚酒CT 值及CD 值的影响
众多研究表明，诸如超声波、超高压及微波等非热加工技术是缩短果酒陈酿时间的理想方法。与传统的热加工相比，超声波处理果酒几乎对其风味成分无不良影响，超声波产生的空化可以抑制色素转化，并对果酒颜色产生影响。相关文献表明CD 值与CT 值分别与花青素衍生物的形成及葡萄酒中游离花青素与无色多酚之间产生聚合反应有关[7]。不同功率超声波处理及贮藏时间下桑葚酒的CD 值及CT 值如图2所示。
图2 不同超声功率下桑葚酒的CD 值及CT 值
Fig.2 CD and CT values of mulberry wine under different ultrasonic power treatment
不同小写字母代表具有显著性差异（p＜0.05）。
CD 值越大表明桑葚酒色泽更深[16]，由图2 可知，所有处理组桑葚酒经贮藏4 周后其CD 值与CT 值皆明显提高，表明其陈酿过程存在花青素衍生物及酚类物质聚合物的产生，经较低功率超声波（100 W～200 W）处理后的桑葚酒经贮藏4 周后与未处理组对比，其CD值无明显变化，其CT 值略微升高，这也与Zhang等[16]针对葡萄酒的研究结果类似。当超声波功率为400 W时，桑葚酒贮藏4 周后的CD 值与CT 值较其他处理组明显降低，主要原因为高功率超声波处理导致桑葚酒中花青素类物质降解速率高于其聚合物产生速率，色泽损失严重[16]。综上，较低功率超声波（100 W～300 W）处理能够维持桑葚酒的颜色密度，提高其色调值。
2.1.3 超声波处理对桑葚酒WCP 值、WC 值、CDRSO2值及CAW 值的影响
桑葚酒的色泽主要由其高含量的花青素形成，因此评估由花色苷引起的颜色变化对于了解超声波处理对其色泽影响具有重要意义。不同功率超声波处理对桑葚酒WCP、WC、CDRSO2 及CAW 值影响如表1 所示。
表1 不同超声功率处理下桑葚酒的WCP 值、WC 值、CDRSO2 值及CAW 值
Table 1 WCP，WC，CDRSO2，and CAW values of mulberry wine under different ultrasonic power treatment
注：同列肩标不同小写字母代表具有显著性差异（p＜0.05）。
?
WCP 被定义为包括游离和聚合花色苷在内的总色素，相关研究表明在陈酿早期WCP 与游离花色苷含量呈现正相关关系[16]。由表1 可知，所有处理组中，贮藏4 周后桑葚酒的WCP 值显著降低（降低了4.26%～7.41%），这与其游离花色苷含量降解有关。经不同功率超声波处理后贮藏4 周桑葚酒的WCP 值与未处理相比无显著性变化，因此可以认为超声处理不会对其总色素值产生影响。WC 值被认为与花色苷及酚酸或黄烷醇之间的反应呈正相关，在桑葚酒的贮藏过程中发现其数值稳步升高，这表明其花色苷与其他酚类物质逐步反应结合。不同超声处理组桑葚酒经4 周贮藏后其WC 值为4.47～4.65，超声处理对其WC 值影响较小。桑葚酒中的亚硫酸盐离子可以与游离的花青素发生反应，形成无色且不稳定的聚合物，游离的花青素和一些花青素衍生物容易被二氧化硫漂白。研究结果表明，在4 周的陈酿过程中桑葚酒抵抗SO2 漂白作用的能力不断增强，陈酿结束后分别增强了33.98%～84.31%，其中300 W 功率超声处理条件下的CDRSO2值最高，达2.52。因此此条件下处理的桑葚酒具有更高的抵抗SO2 漂白作用的能力。这可能由于此条件下促进了桑葚花青素转化为更稳定的聚合物[17]。不同处理条件下陈酿4 周的桑葚酒CAW 值（44.13～56.30）显著高于陈酿前，并且不同功率超声波处理显著提高了其CAW 值（分别提高了5.53%～27.57%），300 W功率超声处理后桑葚酒的CAW 值最高为56.30。
2.2 超声波处理对桑葚酒单体花青素含量的影响
相关研究表明，果酒中紫红色主要来源于花青素，花青素作为一类活性多酚，由于其特殊的性质使得其结构不稳定并且容易降解[4]。不同功率超声波处理前后贮藏结束后（4 周）单体花青素类物质含量如表2 所示。
表2 不同超声功率处理下贮藏4 周后桑葚酒中花青素含量
Table 2 Anthocyanin content in mulberry wine after storage for 4 weeks under different ultrasonic power treatment mg/L
注：同列肩标不同小写字母代表具有显著性差异（p＜0.05）。
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由表2 可知，桑葚酒中共检测到5 种花青素类物质，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷及矢车菊素-3-芸香苷含量较高，是桑葚酒中最主要的花青素类物质，这与Cheng 等[18]的研究结果一致。桑葚酒经不同超声波条件处理后的矢车菊素-3-葡萄糖苷及矢车菊素-3-芸香苷含量分别达到了125.57 mg/L ～145.02 mg/L 和94.65 mg/L～134.47 mg/L。经不同功率超声波处理贮藏4 周后两种主要的花色苷含量均显著高于未处理组，尤其是300 W 超声条件下两种花色苷分别含量提高了19.45%及42.07%，这与Li 等[7]的研究结果一致。主要原因可能为超声波处理促进了结合类花青素物质的释放。此外还检测到了3 种其他花青素类物质，含量较低并且超声处理对其影响较小。相关表明较低功率超声波处理对花青素结构稳定性影响有限，因此低频功率超声波处理对桑葚酒中花青素类物质影响较小[19]。300 W 处理下桑葚酒的高矢车菊素-3-葡萄糖苷及矢车菊素-3-芸香苷含量可能也是其高a*值及C*值的主要原因。
2.3 相关性分析
相关研究表明在葡萄酒的陈酿过程中，花青素降解及转化将直接决定不同储存期酒的颜色特征[20]，桑葚酒色泽指标与花青素含量相关性分析研究结果如表3 所示。
表3 桑葚酒中色泽指标与花青素含量相关性分析
Table 3 Correlation analysis between color index and anthocyanin content in mulberry wine
注：#表示差异显著相关（p＜0.05）。
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由表3 可以看出，亮度值L*与红色值a*与矢车菊素-3-葡萄糖苷含量存在显著正相关关系（r＞0.6，p＜0.05）。a*值与矢车菊素-3-芸香苷也存在显著的正相关关系（r=0.62，p＜0.05）。此外CD 值与矢车菊素-3-葡萄糖苷、CT 值与矢车菊素-3-芸香苷皆存在显著的正相关关系（r＞0.6，p＜0.05）。
2.4 超声波处理对桑葚酒抗氧化能力的影响
相关研究表明桑葚富含花青素及其他酚类物质，这些活性成分具有突出的抗氧化活性[21]。桑葚酒经不同功率超声波处理并贮藏4 周后的抗氧化能力如图3 所示。
图3 不同超声功率处理下贮藏4 周后桑葚酒的抗氧化能力
Fig.3 Antioxidant capacity of mulberry wine after storage for four weeks under different ultrasonic power treatment
不同小写字母代表具有显著性差异（p＜0.05）。
由图3 可知，桑葚酒经超声波处理后与未处理组相比其DPPH 自由基清除能力无显著变化，其羟基自由基清除能力随着超声功率的提高呈现出先升高后降低趋势，铁离子还原力也呈现出类似的趋势，这说明高超声波功率处理桑葚酒造成其抗氧化能力下降。300 W 处理条件下桑葚酒的羟基自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及FRAP 铁离子还原力均较强，分别达到了73.6%、81.5%及1.62 mg AAE/mL，这可能与300 W 超声波处理桑葚酒中花青素类物质含量较高有关，因此300 W 超声处理条件可能是维持其活性功能的较好条件。
3 结论
通过对不同功率超声波处理下桑葚酒陈酿过程中的色泽、花青素含量及抗氧化能力进行比较分析可得：较低频率超声波处理对于桑葚酒早期陈酿阶段的色泽及花青素含量具有积极影响，300 W 超声波处理的桑葚酒具有更高的L*值、a*值、C*值，并显示出较强的CDRSO2 及CAW。此外在陈酿4 周后桑葚酒中检测到了5 种单体花色苷，并且发现300 W超声波处理的桑葚酒具有更高含量的矢车菊素-3-葡萄糖苷及矢车菊素-3-芸香苷。通过对色泽指标及单体花色苷进行相关性分析结果表明，L*、a*及CD 值与矢车菊素-3-葡萄糖苷含量存在显著正相关关系（r＞0.6，p＜0.05）。通过对其抗氧化能力进行分析可得，300 W 超声波处理条件下桑葚酒的羟基自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及FRAP 铁离子还原力均较强，超声处理并不会对桑葚酒的抗氧化能力产生负作用。综上超声波作为一种非热处理技术有利于桑葚酒陈酿过程中颜色的呈现，300 W 超声条件可作为优良条件应用到桑葚酒的陈酿处理中。
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