我国制茶、饮茶历史悠久，茶类繁多，茶叶按发酵程度分为不发酵茶（绿茶）、半发酵茶（白茶、乌龙茶）、全发酵茶（红茶）、后发酵茶（黑茶）四大类[1]。黑茶主要包括普洱茶、茯砖茶、青砖、康砖、六堡茶等[2]，其中普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青毛茶为原料，经后发酵加工而成的紧压茶或散茶[3]，按照其加工工艺，普洱茶又分为普洱生茶和普洱熟茶[4]。普洱熟茶是晒青毛茶经过潮水渥堆，在渥堆过程中微生物胞外酶酶促作用和湿热作用以及微生物内代谢作用下[5]，茶叶的内含物成分发生一系列的反应，从而形成具有显著陈香、色泽红褐、滋味醇厚的普洱茶[6-7]。
利用微生物发酵普洱茶是其品质形成的关键因素，通过紫色红曲霉接种发酵处理，使普洱茶发酵过程中的微生物群落结构发生变化，有利于普洱茶形成独具特色的优良品质。李亚莉等[8]采用专利菌株——紫色红曲霉MPT13（201010182965.9）接种发酵，得到了品质风味独特的普洱茶，其独特曲酯香极易与其他普洱茶区分。细胞和动物实验研究结果显示，接种紫色红曲霉进行发酵得到的普洱茶降脂、抗炎、抗动脉粥样硬化效果非常显著，对人体健康十分有益。徐瑞雪等[9]以云南大叶种晒青毛茶为原料，开发了液态自然发酵生产普洱茶粉新工艺。李桃[10]以云南大叶种晒青毛茶为原料进行液态发酵普洱茶，研究酶制剂添加和微生物接种对普洱茶的影响[11]。
本文将专利菌株紫色红曲霉接种于灭菌后的晒青毛茶茶粉水溶液中进行单菌液态发酵，研究其发酵过程中代谢变化，分析采用外源接种特定微生物进行液态发酵普洱茶的特征物，筛选出发酵后的差异代谢物，探究紫色红曲霉液态发酵对茶叶品质的影响。通过差异代谢物的筛选与分析，对特定有益微生物对普洱茶品质影响机制的研究和创新特色普洱茶产品的开发具有较强的指导价值和现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
云南大叶种晒青毛茶：产于云南省普洱市景东彝族自治县无量山；紫色红曲霉（Monascus purpureus）MPT13（专利号201010182965.9）：保藏于云南农业大学茶学院实验室；甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸（均为色谱纯）：德国默克公司。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱仪（1290 UPLC）：美国安捷伦公司；高分辨质谱仪（Q Exactive Focus）、离心机（Heraeus Fresco17）：赛默飞世尔科技有限公司；电子天平（BSA124S-CW）：赛多利斯公司；研磨仪（JXFSTPRP-24）：上海净信科技有限公司；超高液相色谱仪（SHIMADZU Nexera X2 型）：日本岛津公司；三重四极杆线性离子阱质谱仪（4500 Q TRAP 型）：美国AB SCIEX 公司。
1.3 方法
1.3.1 茶叶发酵
云南大叶种晒青毛茶→磨粉→制成1∶30（g/mL）（10 g 茶粉，300 mL 纯水）的茶粉水溶液→高温灭菌（121 ℃、20 min）→取250 mL 茶粉水溶液于500 mL 的锥形瓶→接种5 mL 紫色红曲霉→恒温摇床发酵（设定温度30 ℃、发酵时间9 d）→发酵样放置-80 ℃的冷冻柜保存。
标记R 代表灭菌原料（晒青毛茶粉），标记M9 代表单菌液态发酵9 d 后的最终样。
1.3.2 非挥发性物质测定方法
1.3.2.1 茶样预处理
样品提取：将样品从冷冻柜中取出后，于冻干机中真空冷冻干燥；利用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；称取100 mg 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min 涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6 次，样本置于4 ℃冰箱过夜；12 000 r/min 离心10 min后，吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，并保存于进样瓶中，用于液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析。
1.3.2.2 色谱与质谱检测
液相色谱条件为色谱柱：Agilent SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A 相为超纯水（加入0.1%甲酸），B 相为乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脱梯度：0 min B 相比例为5%，9.00 min 内B 相比例线性增加到95%，并维持在95%1 min，10.00 min ～11.10 min，B 相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。
质谱条件：在三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP）、AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS 系统扫描获得代谢物信息，该系统配备ESI Turbo 离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3 软件（AB Sciex）控制运行正负两种离子模式。喷雾电离源操作参数：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（ion spray voltage，IS）5 500 V（正离子模式）/-4 500 V（负离子模式）。
1.4 数据处理与分析
两组茶样均重复进行3 次生物学试验，数据以平均值±标准差表示；利用软件Analyst 1.6.3 处理质谱数据，进行代谢物分析；采用多元统计分析，基于正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）结果初步筛选出不同样品间差异代谢物，再通过组合单变量分析的P 值或差异倍数值进一步筛选差异代谢物；通过差异倍数（fold change，FC）和OPLS-DA 模型变量的变量权重值（variable important in proiection，VIP）相结合的方法来筛选差异代谢物。筛选标准：选取FC＞2（上调）和FC＜0.5（下调）的代谢物，一般VIP 大于1 的代谢物为差异显著。
2 结果与分析
2.1 代谢物分布概况
基于UPLC-MS/MS 检测平台和自建数据库共鉴定得到991 个化合物，主要包括氨基酸及其衍生物类（113 个）、苯丙素类（28 个）、苯的衍生物（58 个）、酚酸类（98 个）、核苷酸及其衍生物（64 个）、黄酮类（166个）、其他类（15 个）、生物碱类（72 个）、糖苷类（75个）、糖类（55 个）、维生素类（17 个）、有机酸类（113个）、脂肪酸类（65 个）、脂质（52 个）等14 个大类。
通过多元统计主成分分析（principal component analysis，PCA）对样品进行分析，R 与M9 样本的PCA得分图如图1 所示。
图1 R 与M9 样本的PCA 得分图
Fig.1 PCA score of R and M9 samples
由图1 可知，样本R 和M9 对应的代谢物谱明显分离，两个主要成分（PC1 和PC2）分别解释了总方差的88.25%和3.48%，表明模型可靠。在两个主成分中，PC1 值较大，说明R 和M9 具有较大差异。
2.2 差异代谢物变化分析
采用VIP＞1 和FC＞2 或FC＜0.5 的筛选标准，从R 和M9 组样品中共筛选到679 个差异代谢物，结果见表1。
表1 紫色红曲霉液态发酵茶叶后主要差异代谢物变化
Table 1 Main differential metabolites after Monascus purpureus liquid fermentation of tea
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续表1 紫色红曲霉液态发酵茶叶后主要差异代谢物变化
Continue table 1 Main differential metabolites after Monascus purpureus liquid fermentation of tea
调数量 显著下调表达 显著下调数量生物碱类 72 52 甲基黄嘌呤、红曲红胺、吲哚-3-乙酸、乙酰色胺类别 总数差异代谢物数量 显著上调表达 显著上20 咖啡碱、五羟色胺、对香豆酰基腐胺、3-吲哚丙酸、胆碱、色胺31糖苷类 75 64 鞣花酸-4-O-木糖苷、6-O-乙酰熊果苷、甲基-4，6-二-O-没食子酰-D-葡萄糖8 紫丁香苷、没食子酰-D-葡萄糖、东莨菪内酯-7-O-葡萄糖醛酸苷、异落叶松脂素-9＇-O-葡萄糖苷、6-O-阿魏酰-D-葡萄糖54糖类 55 37 D-甘露醇、D-山梨糖醇、半乳糖醇、木糖醇 16 D-果糖、葡萄糖酸、D-蔗糖、异麦芽酮糖、D-景天庚酮糖- 7-磷酸、D-潘糖20维生素类 17 11 吡哆醛、维生素B2、烟酸核糖核苷、叶酸、D-泛酸6异烟酸、烟酰胺、D-生物素、硫胺素 5有机酸类 113 65 2-氧代己二酸、2α，19α-二羟基-3-氧熊果-12-烯-28-酸、坡模酸、27，28-二羧基熊果酸、9-氧代壬酸、1-吡咯啉-4-羟基-2-羧酸、β-脲基异丁酸、2-羟基苯乙酸、庚二酸脂肪酸类 65 36 12，13-环氧-9-十八碳烯酸、9S-氢过氧-10E，12Z-十八碳二烯酸、9-羟基-10，12，15-十八碳三烯酸、9-过氧-10E，十八碳二烯-6-炔酸、8，15-二羟基-5，9，11，13-二十碳四烯酸脂质类 52 39 溶血磷脂酰胆碱19∶3、溶血磷脂酰胆碱20∶0、磷酸二乙酯40 磷酸肌酸、曲酸、3-糠酸、2-甲基-3-氧代己二酸、磷酸烯醇式丙酮酸、4-羟基-2-酮戊二酸、尿刊酸28 13-氢过氧化-9，11-十八碳二烯酸、9-羟基过氧-10E，12，15Z-十八碳三烯酸、9，10-二羟基-12，13-环氧十八酸、9，10，11-三羟基-12-十八碳烯酸4 溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、亚麻酸甘油酯、甘油醛21 7 31
由表1 可知，在发酵过程中，相较于原料R，发酵9 d 的M9 中筛得差异代谢物679 种（上调215 种、下调464 种）。
正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）是一种具有监督模式识别的多元统计分析方法，可以最大限度地提高群体分化并帮助发现差异代谢物。通过OPLS-DA模型进行样本两两比较，得分图如图2 所示。
图2 R 与M9 差异代谢物的OPLS-DA 成对比较的得分图
Fig.2 Score plot of R versus OPLS-DA pairwise comparison of M9 differential metabolite
由图2 可知，R 与M9 两个样本差异明显。火山图分析结果如图3 所示。
图3 R 与M9 样本的火山图
Fig.3 Volcano map of R and M9 sample
从图3 中能够直观得到样本R 与M9 的代谢物差异，图中的点均有与其一一对应的代谢物。R 中215 个显著上调，包括槲皮素、杨梅素、山奈酚、原花青素、儿茶素没食子酸酯、柚皮素、苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、肉桂酸、黄嘌呤、氨基苯甲酸、D-甘露醇、顺-11-十八碳烯酸等，其中山奈酚在两组样品中含量差异倍数最大（16.95）；464 个显著下调，主要包括儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、香豆素、O-磷酸胆碱、茶黄素、绿原酸、丁香醛、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、2-氧代己二酸等，其中2-氧代己二酸在两组样品中含量差异倍数最大（18.09）。
2.2.1 氨基酸及其衍生物
氨基酸及其衍生物中L-甲硫氨酸含量差异倍数最大（16.91）。其中L-甲硫氨酸甲酯、甲基多巴在发酵最终样中未检测到，在普洱茶发酵过程中，氨基酸类物质含量呈下降趋势，其中茶氨酸在两组茶样被检测到不断减少，与文献[12-13]研究相符。
2.2.2 黄酮类
在黄酮（苷）类差异代谢物中，胡桃苷/山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、3＇，4＇，7-三羟基黄酮、槲皮素-3-O-槐糖苷、番石榴苷/槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷、儿茶素-5-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（2″-对香豆酰）半乳糖苷、乔松苷/乔松素-7-O-葡萄糖苷、5，7，8，4＇-四甲氧基黄酮在灭菌原料中未被检出，其中胡桃苷/山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷含量差异倍数最大（16.95）。物质含量显著下降最多的是槲皮素，黄酮醇类在高温湿热微生物发酵过程中发生了转化和降解，与文献[14]研究相符。
2.2.3 生物碱类
生物碱类差异代谢物中6-羟基烟酸、红曲红胺、对香豆酰胍丁胺在灭菌原料中未被检出，6-羟基烟酸含量差异倍数最大（19.89）。其中对咖啡碱、五羟色胺、对香豆酰基腐胺、3-吲哚丙酸、胆碱、色胺等物质显著下调。咖啡酰精胺、芥子酰尸胺、N，N-二甲基-5-甲氧基色胺、5，8，11，14-十五烷酰胺、吲哚-3-甲醛在发酵最终样中未被检出，这也说明咖啡碱参与了茶褐素的形成，导致其含量增加缓慢或出现减少的情况，使咖啡碱[15]的变化不显著。
2.2.4 其他
酚酸类差异代谢物中3-羟基-2-氨基苯甲酸含量差异倍数最大（17.96）；有机酸类差异代谢物中2-氧代己二酸含量差异倍数最大（18.09）；几种重要的糖苷类物质均被检测到是显著差异代谢物，其物质含量整体上均显著下降；核苷酸及其衍生物中甲基胍含量差异倍数最大（18.09）；苯的衍生物差异代谢物中麦芽酚含量差异倍数最大（18.47）；糖类差异代谢物中D-甘露醇含量差异倍数最大（6.94）；脂肪酸类差异代谢物中12，13-环氧-9-十八碳烯酸含量差异倍数最大（20.71）；脂质类差异代谢物中溶血磷脂酰胆碱20∶0 含量差异倍数最大（15.86）；维生素类差异代谢物中吡哆醛含量差异倍数最大（3.12）。
3 讨论与结论
在普洱熟茶加工过程中，利用普洱熟茶发酵过程中的优势菌种，研制发酵剂，可以控制普洱茶的风味与研发特定功效。药淑娟[16]建议在普洱茶的实际生产中，在潮水过程中人工接种臭曲霉，可在一定程度上增加臭曲霉的菌种数量，从而增加甲氧基化合物的含量，提高发酵普洱茶的香气品质。周红杰等[17]对普洱茶进行单一菌株和复合菌株组合发酵，提高和稳定普洱茶品质，研发了γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）普洱茶[18]和洛伐他汀普洱茶，为提高普洱茶附加值、开发新产品奠定了基础。
本研究中，将紫色红曲霉接种于茶叶中进行液态发酵，发现黄嘌呤、山奈酚、氨基苯甲酸、槲皮素[19]、D-甘露醇、顺-11-十八碳烯酸、原花青素、香橙素、柚皮素等代谢物含量显著增加，而儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、香豆素、O-磷酸胆碱、茶黄素、绿原酸、丁香醛、原花青素等显著减少。在普洱熟茶后发酵过程中正是生物碱类和黄酮类的减少，缓和了茶叶的苦涩，使普洱熟茶的口感更加丝滑柔和[20]。这些代谢物的增加使滋味纯正尚涩、色泽黄绿、香气清鲜纯正的晒青毛茶转为色泽红褐、滋味醇和回甘、香气陈醇的普洱茶[21]。
紫色红曲霉液态发酵后茶叶中的物质组成和含量发生了显著变化，相较于发酵前的灭菌原料（R），在紫色红曲霉单菌液态发酵9 d 后的样品（M9）中共有215 个代谢物发生了显著上调，主要包括黄嘌呤、山奈酚、氨基苯甲酸、槲皮素、D-甘露醇、顺-11-十八碳烯酸等；此外，有464 个代谢物显著下调，主要包括儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、香豆素、O-磷酸胆碱、茶黄素、绿原酸、丁香醛、原花青素等。本研究为紫色红曲霉对茶叶品质的影响提供了可靠的数据支撑，有利于利用紫色红曲霉发酵进行新型普洱茶产品的开发，对实现普洱茶品质定向化和稳定化发展具有现实意义。
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