银杏在我国广泛种植，其果仁（俗称白果）每年产量高达6 万t。银杏作为一种药食同源资源[1]，具有抗氧化、抗炎、神经保护、抗菌、降血糖等多种功能活性[2-3]。银杏因具有独特的健康益处，大量用于食品加工，采用不同的烹饪方法将其制成各种美食，如盐烤银杏、鱼片银杏粥、银杏炖鸡等[4]。银杏由35%碳水化合物、6%蛋白质和2%脂肪组成，淀粉含量占干重的70%[5]，银杏淀粉具有结晶度为27%～41%的A 型晶型[6]，包含约26%～36%的直链淀粉和64%～74%的支链淀粉[7]。银杏含有黄酮类、萜烯和酚类等160 多种化学物质[8]，银杏内酯B 是一种二萜类内酯[9]，是银杏提取物的主要成分之一[10]，可用于改善血液循环和发挥神经保护作用[11]。银杏中的酚类物质具有抗氧化和抗炎等活性，对改善动脉粥样硬化和影响中枢神经系统的疾病发展具有重要作用[12]。
银杏含有大量的淀粉、银杏内酯B 与多酚类物质，结构中都含有较多的羟基，可以通过氢键、静电及范德华力等发生相互作用并以吸附和包埋等方式形成复合物，从而限制了银杏内酯B 和多酚的释放[13]。银杏内酯B 和多酚的提取方法主要有溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、闪式提取法和树脂吸附提取法等[14]，但现在研究者逐渐关注到使用酶解法从植物中提取活性成分[15]。目前，生物酶降解法因具有快速、高效、反应条件温和、专一性强等诸多优点逐步受到了关注，但采用复合酶处理银杏从而促进银杏内酯B 和多酚等活性物质释放的研究相对较少。α-淀粉酶可液化淀粉，使长碳链水解成十几个碳链的小分子糊精[16]，糖化酶进一步水解糊精生成葡萄糖[17]，使银杏淀粉被彻底降解成小分子[18]。α-淀粉酶和糖化酶复合处理可有效降低淀粉与银杏内酯B 和多酚的结合，加速有效成分银杏内酯B 和酚类物质的溶出[19]。牟佳红等[20]研究发现α-淀粉酶和糖化酶的添加量、酶解温度和酶解时间是影响酶解效率的重要因素。
因此，本研究采用α-淀粉酶和糖化酶复合处理银杏汁，通过设计正交试验优化银杏汁的酶解条件，并以银杏汁中溶出的银杏内酯B 和总酚含量为考察指标，从而评估酶解后银杏汁中活性物质的含量，以期为后续银杏的开发和利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
银杏：产自江苏泰兴；α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（10 000 U/g）（均为食品级）：隆科特酶制剂有限公司；甲醇（色谱纯）：德国默克公司；银杏内酯B 标准品（色谱纯）、没食子酸（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；福林酚、无水碳酸钠（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
数显分散机（T25）：德国艾卡公司；液相色谱仪（ZX-13）、蒸发光散射检测器（1260）：美国安捷伦科技公司；超声波细胞破碎仪（XO-1000D）：南京先欧仪器制造有限公司；酶标仪（E-poch）：美国伯腾仪器有限公司；0.22 μm 有机系过滤器：天津市津腾实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 银杏汁的制备
将银杏解冻，称取100 g，加入500 mL 纯净水，打汁后用数显分散机于10 000 r/min 下匀浆30 s。
1.3.2 银杏内酯B 含量的测定
1.3.2.1 色谱条件
参考Zheng 等[21]的方法设定色谱条件。色谱柱为CORTECS C18 柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相为水∶乙腈=30∶70；柱温30 ℃；流速1.5 mL/min；进样体积20 μL；检测器为蒸发光散射检测器。
1.3.2.2 标准曲线的绘制
精密称取银杏内酯B 标准品0.002 0 g，70%乙醇水溶液溶解，定容到10 mL 容量瓶中，摇匀，制备得浓度为200 μg/L 的母液。用70%乙醇水溶液将母液梯度稀释，制备得到浓度为5、10、20、40、80 μg/L 银杏内酯B 标准品溶液，用0.22 μm 有机系过滤器过滤后备用。以银杏内酯B 浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2.3 银杏内酯B 的提取及测定
参考吴昊等[22]的方法，吸取样品3 mL，加入3 mL 70%乙醇水溶液，使乙醇终浓度为35%，超声辅助提取30 min，每间隔15 min 摇匀，8 000 r/min 离心15 min，取上清液，0.22 μm 有机系过滤器过滤，得待测样液。
1.3.3 总酚含量的测定
参考董彩文等[23]的方法，取1.0 mL 样品，加入1.5 mL蒸馏水，混匀；加入0.5 mL 福林酚，混匀；1 min 后，加入1.0 mL 20%碳酸钠溶液，混匀。将上述溶液在20 ℃下放置2 h 后，于765 nm 波长下测定吸光度，根据标准曲线计算出样品中的总酚含量。
1.3.4 单因素试验
分别考察α-淀粉酶添加量（0、2、4、6、8 U/mL）、糖化酶添加量（0、3、6、9、12 U/mL）、酶解温度（30、40、50、60、70 ℃）、酶解时间（0、1、2、3、4 h）4 个因素对银杏内酯B 和总酚含量的影响，测定酶解前后银杏汁中的银杏内酯B 和总酚含量。
1.3.5 正交试验
根据单因素试验结果，选取酶解温度、酶解时间、α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量4 个因素设计正交试验，每个因素设置3 个水平，研究其对银杏内酯B 和总酚含量的影响，正交试验因素与水平如表1所示。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 A α-淀粉酶添加量/（U/mL）B 糖化酶添加量/（U/mL）1 2 3 D 酶解时间/h 2 4 6 3 6 9 C 酶解温度/℃40 50 60 234
1.4 数据处理
所有试验3 个重复，确定平均值和标准偏差。使用SPSS 软件对试验数据进行方差分析，结果以平均值±标准差表示，用Origin 软件绘图。
2 结果与分析
2.1 酶解单因素试验
2.1.1 α-淀粉酶添加量对银杏内酯B 和总酚含量的影响
分别添加α-淀粉酶0、2、4、6、8 U/mL，糖化酶6 U/mL，60 ℃水浴酶解2 h，测定银杏内酯B 和总酚含量，结果如图1 所示。
图1 α-淀粉酶添加量对银杏内酯B 和总酚含量的影响
Fig.1 Effects of α-amylase additive amount on the content of ginkgolide B and total phenols
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1 可知，当α-淀粉酶添加量为0～4 U/mL 时，银杏内酯B 含量随α-淀粉酶添加量的增加而升高，可能是由于增加α-淀粉酶添加量，酶与底物接触机会增加。当α-淀粉酶添加量为4 U/mL 时，银杏内酯B 含量达到最高，为（30.14±0.72）μg/mL；随着α-淀粉酶添加量继续增加，银杏内酯B 含量反而降低，可能是当酶浓度升高到一定程度，酶分子过于饱和，一部分没有机会与底物结合，导致酶解效率降低[24]，而且过量的α-淀粉酶作为大分子物质会结合部分银杏内酯B，从而使银杏内酯B 含量降低。总酚含量随α-淀粉酶添加量的增加先升高后趋于平缓，表明增加α-淀粉酶添加量有利于酚类物质的溶出，当酶与底物结合达到饱和时，总酚含量趋于稳定，α-淀粉酶添加量为8 U/mL时，总酚含量最高，为（443.38±3.82）μg/mL。考虑到α-淀粉酶添加量为8 U/mL 时，会明显降低银杏内酯B含量，因此，选择2、4、6 U/mL 3 个α-淀粉酶添加量进行后续正交试验。
2.1.2 糖化酶添加量对银杏内酯B 和总酚含量的影响
分别添加糖化酶0、3、6、9、12 U/mL，α-淀粉酶4 U/mL，60 ℃水浴酶解2 h，测定银杏内酯B 和总酚含量，结果如图2 所示。
图2 糖化酶添加量对银杏内酯B 和总酚含量的影响
Fig.2 Effects of glycosylase additive amount on the content of ginkgolide B and total phenols
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2 可知，银杏内酯B 含量随糖化酶添加量的增加呈先升高后降低然后趋于平缓的趋势，当糖化酶添加量为6 U/mL 时，银杏内酯B 含量达到最高，为（29.24±0.53）μg/mL。进一步增加糖化酶添加量，会使释放的部分银杏内酯B 被酶分子包裹，从而使银杏汁中溶出的银杏内酯B 含量降低。总酚含量随着糖化酶添加量的增加先升高后趋于平缓，表明增加糖化酶添加量有利于酚类物质的溶出，当酶与底物结合达到饱和时，总酚含量趋于稳定，糖化酶添加量为9 U/mL 时，总酚含量最高，为（439.47±3.08）μg/mL。因此，选择3、6、9 U/mL 3 个糖化酶添加量进行后续正交试验。
2.1.3 酶解温度对银杏内酯B 和总酚含量的影响
添加4 U/mL α-淀粉酶和6 U/mL 糖化酶，分别于30、40、50、60、70 ℃下水浴酶解2 h，测定银杏内酯B和总酚的含量，结果如图3 所示。
图3 酶解温度对银杏内酯B 和总酚含量的影响
Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on the content of ginkgolide B and total phenols
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3 可知，随着酶解温度的升高，银杏内酯B含量呈先升高后趋于平缓的趋势。酶解温度为30 ℃～60 ℃时，随着酶解温度的升高，总酚含量整体呈上升的趋势。在酶解温度低于酶的最适温度前，升高温度可增加包括酶和底物分子在内的溶液体系的热能[25]，既可使胞内活性物质分子运动速度加快，又能提供酶促反应所需的能量，使酶解效率加强[26]，促进了银杏内酯B 和总酚的溶出；酶解温度为60 ℃时，银杏内酯B和总酚含量均达到最高，分别为（29.85±0.26）μg/mL 和（422.51±4.62）μg/mL。继续升高温度，银杏内酯B 含量无明显变化，总酚含量降低，可能是因为温度过高使样品中的酶逐渐失去活性[27]，银杏内酯B 耐热性好，而多酚类化合物部分被降解。因此，选择40、50、60 ℃3 个酶解温度进行后续正交试验。
2.1.4 酶解时间对银杏内酯B 和总酚含量的影响
添加4 U/mL α-淀粉酶和6 U/mL 糖化酶，60 ℃下分别水浴酶解0、1、2、3、4 h，测定银杏内酯B 和总酚的含量，结果如图4 所示。
图4 酶解时间对银杏内酯B 和总酚含量的影响
Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis time on the content of ginkgolide B and total phenols
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4 可知，酶解时间为0 h 时，银杏汁的银杏内酯B 含量为（27.13±0.01）μg/mL，总酚含量为（344.10±7.44）μg/mL。随酶解时间的延长，银杏内酯B 和总酚含量均整体呈先升高后趋于平缓的趋势。当酶解时间为0～3 h 时，银杏内酯B 和总酚含量随着酶解时间的延长而升高，酶解时间为3 h 时，银杏汁中的淀粉已酶解完全，银杏内酯B 和总酚含量最高，分别为（34.35±1.55）μg/mL 和（450.65±3.02）μg/mL；在3 h～4 h 时，随着酶解时间的延长银杏内酯B 和总酚含量均无明显变化。因此，选择2、3、4 h 3 个酶解时间进行后续正交试验。
2.2 正交试验
2.2.1 酶解条件的正交试验优化
正交试验设计与结果见表2。
表2 L（93）4正交试验设计与结果
Table 2 L（934）orthogonal experimental design and results
项目 因素 银杏内酯B含量/（μg/mL）总酚含量/（μg/mL）A B C D 1 1 1 1 1 29.22±1.88 353.15±5.62 2 1 2 2 2 27.00±0.68 390.85±8.16 3 1 3 3 3 29.30±1.29 380.38±7.19 4 2 1 2 3 29.06±3.62 392.51±7.61 5 2 2 3 1 29.85±1.45 422.51±9.07 6 2 3 1 2 27.49±0.35 379.18±1.36 7 3 1 3 2 43.04±0.23 400.59±8.88 8 3 2 1 3 28.26±0.53 372.00±3.99 9 3 3 2 1 31.12±1.05 429.44±8.70 K11 85.52 101.32 84.97 90.19 K12 86.4 85.11 87.18 97.53 K13 102.42 87.91 102.19 86.62 k11 28.51 33.77 28.32 30.06 k12 28.8 28.37 29.06 32.51 k13 34.14 29.3 34.06 28.87 R1 5.63 5.4 5.74 3.64主次顺序C＞A＞B＞D K21 1 124.38 1 146.25 1 104.33 1 205.10 K22 1 194.20 1 185.36 1 212.80 1 170.62 K23 1 202.03 1 189.00 1 203.48 1 144.89 k21 374.79 382.08 368.11 401.7 k22 398.07 395.12 404.27 390.21 k23 400.68 396.33 401.16 381.63 R2 25.89 14.25 36.16 20.07主次顺序C＞A＞D＞B
由表2 可知，影响银杏内酯B 含量的因素主次顺序为C＞A＞B＞D，即酶解温度＞α-淀粉酶添加量＞糖化酶添加量＞酶解时间，最佳组合为A3B1C3D2。影响总酚含量的因素主次顺序为C＞A＞D＞B，即酶解温度＞α-淀粉酶添加量＞酶解时间＞糖化酶添加量，最佳组合为A3B3C2D1。根据k 值变化趋势综合预测组合A3B3C3D1酶解处理的银杏汁中银杏内酯B 和总酚含量也可能较高，可用于试验进行验证。
2.2.2 酶解条件对银杏内酯B 和总酚含量的影响
酶解条件对银杏内酯B 含量影响的正交试验方差分析见表3，酶解条件对总酚含量影响的正交试验方差分析见表4。
表3 酶解条件对银杏内酯B 含量影响的正交试验方差分析
Table 3 Orthogonal experiment analysis of variance on influence of enzymatic hydrolysis conditions on ginkgolide B content
注：**表示影响极显著，P＜0.01。
?
表4 酶解条件对总酚含量影响的正交试验方差分析
Table 4 Orthogonal experiment analysis of variance on influence of enzymatic hydrolysis conditions on total phenols content
注：**表示影响极显著，P＜0.01。
来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性A 3 655.221 267 2 1 827.611 35.575 0.000 **B 1 123.468 067 2 561.734 10.934 0.001 **C 7 227.775 267 2 3 613.888 70.346 0.000 **D 1 825.382 467 2 912.691 17.766 0.000 **误差 924.714 18 51.373总计 14 756.561 26
结合表3 和表4 的结果可知，P 值均小于0.01，表明4 个因素α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量、酶解温度、酶解时间对银杏内酯B 和总酚含量的影响均极显著。
2.3 验证试验
根据2.2.1 正交试验结果，选用酶解组合A3B1C3D2、A3B3C3D1、A3B3C2D1 分别处理银杏汁，酶解后银杏汁中银杏内酯B 含量和总酚含量如表5 所示。
表5 酶解组合验证结果
Table 5 Result of combination verification of enzymatic hydrolysis
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
组合银杏内酯B 含量/（μg/mL） 总酚含量/（μg/mL）A3B1C3D2 42.86±0.38b 403.79±6.73b A3B3C2D1 31.45±1.05c 438.22±8.46c A3B3C3D1 49.29±0.87a 455.18±4.05a
组合A3B3C3D1 酶解处理的银杏汁中银杏内酯B和总酚含量均在0.05 水平下明显高于另外两组，由此确定最优酶解组合为A3B3C3D1，即α-淀粉酶添加量为6 U/mL，糖化酶添加量为9 U/mL，酶解温度60 ℃，酶解时间为2 h，该条件下银杏内酯B 含量和总酚含量最高，分别为（49.29±0.87）μg/mL 和（455.18±4.05）μg/mL。
3 结论
本文采用复合酶处理银杏汁，通过单因素试验确立酶解条件范围，进一步采用正交试验优化酶解条件，综合考虑银杏内酯B 和总酚释放量、经济成本和能源消耗等因素，得到最佳酶解条件：α-淀粉酶添加量6 U/mL、糖化酶添加量9 U/mL、酶解温度60 ℃、酶解时间2 h。在此酶解条件下，银杏汁中的银杏内酯B 含量和总酚含量分别为（49.29±0.87）μg/mL 和（455.18±4.05）μg/mL，分别是酶解前的（1.82±0.02）倍和（1.32±0.02）倍。因此，本研究通过此复合酶解的方法可有效提高银杏内酯B 和总酚的含量，该方法具有省时、节能、高效、环保等特点，为银杏的开发和利用提供一种新的途径和参考。
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