鸡蛋清蛋白是一类十分优质的蛋白质，因其良好的凝胶强度和持水能力而被广泛应用于食品工业，不仅能够作为输送营养和风味的介质，而且还能改善食品的质地[1-2]。通常，天然蛋白质需要先通过热处理等方法改变其结构，进而使部分性质发生改变形成热诱导聚集体，在聚集的过程中，通过平衡蛋白质分子之间的吸引力以及排斥力的相互作用，从而进一步交联形成高度有序并能保持大量水分的三维凝胶网络结构[3]。
凝胶性质受到与凝胶制备的工艺过程、操作和条件相关的因素的影响[4-5]。Kar 等[6]利用射频辅助热处理加快蛋清粉的加热速度，使其具有低热导率，并显著改善了蛋清的凝胶性能。Ma 等[7]发现随着干热预处理时间的延长，蛋清粉凝胶的α-螺旋和β-转角含量有序增加，蛋清粉凝胶的结构变化和性质之间的关系可用于设计各系列产品。可见不同的预处理方式辅助干燥蛋清粉对其凝胶特性均产生一定的影响。研究表明，超声波处理可以改变不同食物蛋白质的凝胶特性。Arzeni 等[8]研究表明超声处理对蛋清蛋白凝胶特性会产生一定的影响，超声波处理加快了蛋清蛋白聚集体的形成速度，使其疏水性增加，凝胶特性也发生变化。Liang 等[9]通过研究超声波处理对冻干大豆分离蛋白（soy protein isolates，SPI）凝胶结构和复水特性的影响，发现与未处理的SPI 溶液相比，适当的超声处理降低了SPI 溶液的平均粒径，提高了其储能模量，并使凝胶形成均匀致密的网络结构，提高了冻干SPI 凝胶的持水量和质构特性，增强了其在复水过程中的毛细渗透能力。Cui 等[10]对大豆乳清蛋白进行超声处理，结果发现其凝胶性能显著提高：在300 W 的超声功率下，蛋白的凝胶硬度达到最大值（998.9 g），其水结合能力得分达到最大值（87%）。因此，超声波处理法是一种快速、高效、可靠的，可以改善食品蛋白质质量的方法。
目前，已有研究分析了喷雾干燥对蛋清粉的起泡性、乳化性以及凝胶特性的影响，关于超声对蛋清蛋白热聚集及凝胶性质影响的研究鲜见。本试验采用超声辅助喷雾干燥对鸡蛋清进行干燥处理，探究超声预处理对蛋清蛋白的热聚集及凝胶品质的影响，以期为食品工业生产较好凝胶特性的蛋清凝胶提供理化依据，拓宽蛋清应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜鸡蛋：市售；溴化钾（分析纯）：天津光复经济化工研究所。
1.2 仪器与设备
喷雾干燥机（OM-1500 型）：上海顺义实验设备有限公司；数控超声波清洗器（KQ-500DE 型）：昆山市超声仪器有限公司；凝胶成像系统（Gel Doc XR+型）：美国伯乐BIO-RAD 公司；流变仪（DHR-2 型）：美国TA公司；食品物性分析仪（SMS TA.XT Epress Enhanced型）：英国SMS 公司；低场核磁共振成像分析仪（MINI20-015V-I 型）：上海纽迈电子科技有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（VERTEX70 型）：德国Bruker 公司；荧光正置显微镜（Leica DM2500）：徕卡显微系统贸易有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蛋清粉的制备
参照孙卓[11]鸡蛋清预处理的方法，根据是否超声预处理蛋清液以及干燥方式的不同，按照处理方式将蛋清粉分为3 组。设置超声辅助喷雾干燥（ultrasonic-spray drying，U-SD）处理组，并以喷雾干燥（spray drying，SD）以及真空冷冻干燥（vacuum freeze drying，FD）处理的蛋清粉作为对照组。超声辅助喷雾干燥工艺流程如下。
鸡蛋清→超声预处理（料液厚度3 cm，200 W，20 min）→喷雾干燥（物料温度30 ℃，进风温度170 ℃，物料流量500 mL/h）→过筛→包装。
1.3.2 超声辅助喷雾干燥对蛋清蛋白热聚集的影响
1.3.2.1 蛋清蛋白十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE）分析
将蛋白样品与2 倍体积的样品缓冲溶液（含20 mmol/L 二硫苏糖醇）混合后进行水浴加热。样品冷却至25 ℃，在1 500 r/min 的转速下离心10 min 后，在样品孔中加入8 μL 样品，进行电泳处理。电泳结束后，用考马斯亮蓝R250 染色1 h，之后凝胶用超纯水浸泡，脱色18 h。
1.3.2.2 蛋清蛋白流变性能分析
根据叶钰等[12]的方法略有修改。动态温度黏弹性分析样品以10 ℃/min 的速度从25 ℃加热到90 ℃，90 ℃恒温15 min，最后以10 ℃/min 冷却到25 ℃。动态频率黏弹性分析：在线性黏弹性响应条件下（恒应变幅值为0.01%），记录0.05 rad/s～100.00 rad/s 范围内储存模量（G＇）和损耗模量（G″）关于振荡频率的变化。
1.3.2.3 荧光显微镜观察
使用荧光正置显微镜在荧光下观察蛋清溶液的液滴形态。将0.01%的耐尔蓝染色液与溶液混合，于荧光正置显微镜荧光蓝光下观察拍照。
1.3.2.4 傅里叶变换红外光谱分析（Fourier transform infrared analysis method，FT-IR）
根据Liu 等[13]的方法对处理后的蛋清粉进行红外扫描分析。将处理后的蛋清粉分别与干燥后的溴化钾粉末按照1∶100（质量比）混匀研细后进行压片，然后进行红外光谱扫描分析。用Peak Fit v4.12 软件分析其酰胺I 带处的蛋白质二级结构相对含量变化。
1.3.3 超声辅助喷雾干燥对蛋清蛋白凝胶特性的影响
1.3.3.1 蛋清凝胶质构性能分析
配制质量浓度10%的蛋清溶液置于烧杯中，磁力搅拌均匀，水浴加热（80 ℃，45 min），冷水冷却，4 ℃冷藏。取出制备的凝胶，使其恢复至25 ℃～30 ℃。然后采用全质构分析的运行模式，以P/0.5 的探头测定凝胶强度(g)。测试速度设为测前、测中以及测后分别为5、2 mm/s 和2 mm/s，压缩应变为75%，触发力为3 g。计算凝胶的硬度。每个处理3 个重复。
1.3.3.2 蛋清凝胶持水性分析
称取一定质量的蛋清凝胶，将其切割成大小均匀的小块，用滤纸包裹，10 000 r/min 离心10 min，离心后对凝胶进行称重，凝胶失水率按照下面的公式进行计算。
式中：W0 为待测凝胶质量，g；W1 为离心后凝胶质量，g。
1.4 数据处理
采用Origin 8.5 软件对得到的数据进行作图与分析。通过SPSS 软件对数据进行分析，P＜0.05 为差异显著。每个试验均重复3 次。
2 结果与分析
2.1 蛋清蛋白SDS-PAGE 分析
3 个处理组蛋清粉的SDS-PAGE 见图1。
图1 不同干燥方式蛋清蛋白的SDS-PAGE
Fig.1 SDS-PAGE of egg white protein prepared with different drying methods
从图1 可以看出，不同干燥处理后的蛋清蛋白组分变化不大。与其他处理相比，U-SD 在25 kDa 出现了条带，而在11 kDa～17 kDa 处没有条带，由于25 kDa处对应蛋清中的卵类黏蛋白，这种蛋白的溶解性较差，因此，超声辅助喷雾干燥过程中蛋清蛋白一级结构发生轻微聚集。另一主要条带为76 kDa～80 kDa 处对应的卵转铁蛋白，对比SD 和U-SD 可以看出，经冷冻干燥处理的蛋白组泳道在大于75 kDa 时的条带明显多于其他未超声的泳道，且条带颜色更深，可能是因为蛋清蛋白对温度敏感，热处理可能导致其亚基在溶液中发生聚集。而将U-SD 与SD 的条带进行对比，发现经过超声处理的蛋白组泳道明显比未经超声处理的蛋白质泳道多，表明当前的超声处理条件使蛋白质发生了大分子聚集。
2.2 蛋清蛋白流变性能分析
2.2.1 蛋清蛋白动态温度黏弹性分析
不同干燥方式下蛋清蛋白动态温度黏弹性流变学分析见图2。
图2 不同干燥方式下蛋清蛋白动态温度黏弹性流变学分析
Fig.2 Dynamic temperature and viscoelastic rheological properties of egg white protein dried with different methods
通过动态温度扫描测试，分析对比FD、SD 和USD 在加热和冷却过程中储能模量（G＇）和损耗模量（G″）的变化以探究加热过程对凝胶结构的影响。因为3 个处理组中蛋白的G＇和G″行为相似，而蛋清蛋白主要表现为黏弹性流体性质[14]，因此主要讨论G＇值随温度的变化。由图2 可知，G＇值在90 ℃保温过程中均呈缓慢增加趋势，在冷却过程中进一步增加，表明凝胶网络结构在这两个过程中结构逐渐坚固，这是由蛋白质氢键和离子间的相互作用导致的。在整个加温和冷却过程中，3 个处理组蛋清蛋白均表现出逐步凝胶化，即60 ℃～70 ℃时G＇明显大幅增加，对应着蛋清蛋白的变性，该过程影响着凝胶结构的形成，这表明蛋清蛋白由于形成了共价二硫键而使其凝胶硬度增强[14]。在升温过程中，U-SD 蛋清蛋白表现出比SD 蛋清蛋白更高的弹性，且在变性温度时变化幅度更大，这可能是因为超声处理后的疏水作用促使蛋白发生更强的聚集。
2.2.2 蛋清蛋白动态频率黏弹性分析
不同干燥方式下蛋清蛋白动态频率流变学分析见图3。
图3 不同干燥方式下蛋清蛋白动态频率流变学分析
Fig.3 Dynamic rheological property-frequency curves of egg white protein dried with different methods
A.不同干燥方式下蛋清蛋白储能模量；B.不同干燥方式下蛋清蛋白损耗模量。
如图3 所示，在整个频率范围内，3 种不同干燥处理的蛋清粉的G＇和G″均随角频率的增加而逐渐增加。3 个处理组的蛋清蛋白G＇均高于G″，这表明所有的样品中弹性成分表现得更加明显[15]。G＇随着频率增加出现突然增长的趋势，这表明样品结构在高频区可能产生了切流变行为[16]。图3A 中所有组的G＇值均表现出低频依赖性，这表明蛋清蛋白的流变学相应地受应力影响较小。低频区时SD 蛋清蛋白G＇值最大，而高频区时FD 的G＇值最大，这可能与2 种干燥方式对热诱导凝胶的影响不同有关。而U-SD 蛋清蛋白的G＇、G″值在0.1 rad/s～100.0 rad/s 的角频率增大过程中高于FD和SD，这表明凝胶结构的强韧性受超声作用影响，这可能与蛋白质分子在超声处理后的过程中发生交联及聚集，从而使黏性胶体发生变化，转变为有弹性的凝胶网络结构有关[17]。Zisu 等[18]发现在20 Hz 频率下超声处理可用于降低黏度，并改善含有乳制品成分的乳清和酪蛋白的胶凝作用，这与本试验研究结果一致。
2.3 荧光显微镜分析
采用荧光正置显微镜对蛋清粉溶液显微组织进行成像，结果如图4 所示。
图4 不同干燥方式下蛋清粉溶液液滴荧光显微照片
Fig.4 Fluorescence micrographs of droplets of egg white powder dried with different methods
a.FD 干燥处理（×5）；b.SD 干燥处理（×5）；c.U-SD 干燥处理（×5）；d.FD 干燥处理（×10）；e.SD 干燥处理（×10）；f.U-SD 干燥处理（×10）。
由图4 可知，FD、SD、U-SD 处理后的蛋清粉溶液的微观结构由均匀分布逐渐变为聚集分布，且聚集程度逐渐剧烈。这证实了U-SD 促进蛋清粉溶液发生了强烈的聚集。说明虽然喷雾干燥作用后蛋清蛋白发生了聚集，但超声处理的空化作用致使蛋清蛋白的疏水性增加，加速了热聚集行为，导致形成更大的聚集体[19]。
2.4 FT-IR 分析
超声预处理联合喷雾干燥引发的蛋清蛋白聚集行为改变了其蛋白质的二级结构。其蛋清蛋白的红外图谱如图5 所示。
图5 不同干燥方式下蛋清蛋白的红外光谱图
Fig.5 Infrared spectra of egg white protein dried with different methods
如图5 所示，游离态O—H 的特征吸收峰波数为3 500 cm-1～3 200 cm-1，当它与分子内或分子间氢键缔合时，羟基的吸收峰将向低波数发生移动[20]。而相较于FD，SD 和U-SD 都使蛋清蛋白在酰胺I 带（C O 伸缩振动）出现了特征吸收现象，因此将3 种干燥方式下的蛋清蛋白的酰胺Ⅰ带红外谱图做二阶导数，采用Gauss 面积法拟合[21]，结果见表1。
表1 不同干燥方式下蛋清蛋白酰胺I 带二级结构含量
Table 1 Content of secondary structural elements in the amide I
of egg white protein dried with different methods
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
干燥方式 α-螺旋/% β-折叠/% β-转角/% 无规则卷曲/%FD 17.92±0.06c 17.94±0.04a 28.42±0.04c 17.94±0.01b SD 23.34±0.02b 16.18±0.05c 38.36±0.03a 16.18±0.03c U-SD 23.45±0.04a 16.80±0.01b 37.46±0.07b 22.29±0.06a
如表1 所示，SD 蛋清粉与对照组的FD 蛋清粉相比，α-螺旋含量增加了30.25%（P＜0.05），这可能是因为干燥温度的增加使α-螺旋结构的氢键作用增强，促
进蛋清蛋白内部疏水作用，使暴露的疏水基团被包于蛋白内部，蛋白发生热聚集，进而造成蛋白凝胶硬度增大。而U-SD 蛋清蛋白较SD 组，α-螺旋与β-折叠含量均有增加，分别增加了0.47%、3.83%。这可能是因为α-螺旋和β-折叠结构中氢键较多，超声作用和喷雾干燥的高温高压会导致蛋白质氢键发生不同程度的重排，这与蛋清蛋白的变性和形成聚集体有关[22]。
2.5 蛋清凝胶质构特性及失水率分析
不同干燥方式下蛋清粉凝胶特性及失水率的分析结果如表2 所示。
表2 不同干燥方式下蛋清粉凝胶特性及失水率的分析
Table 2 Gel properties and water loss rate of egg white powder dried with different methods
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
?
蛋清蛋白的变性程度以及多孔结构影响其凝胶的质构特性及其失水率[23]。表2 说明了3 种处理方式对蛋清凝胶的质构特性及失水率的影响。蛋清凝胶的硬度、弹性、咀嚼性和回弹性的大小均为U-SD＞SD＞FD（P＜0.05），其中U-SD 与SD 凝胶硬度相较于FD 分别增加了106.67%、99.48%。这说明喷雾干燥可使蛋白质凝胶功能特性得到改善，而超声处理促进了其改善作用。Cheng 等[24]通过干热预处理辅助喷雾干燥蛋清粉，发现蛋清凝胶硬度和持水量随着干燥加热时间的延长而显著增加，在加热15 d 时凝胶具有较好的凝胶性质、最高的透明度和持水性，以及致密有序的网络结构。凝胶性能的改善可能归因于在超声和喷雾加热过程中，变性程度增大，聚集体相互连接，形成规则的蛋白质多孔凝胶，从而有助于蛋清粉凝胶性能的增强[25-26]。
蛋清凝胶失水率表示蛋白质失去自由水的能力，通常，凝胶硬度越大，失水率越小[27]。如表2 所示，3 个处理组的失水率大小为U-SD＜SD＜FD（P＜0.05），U-SD与SD 分别比对照组FD 失水率降低了55.17%、49.39%。这个结果与蛋清凝胶硬度吻合。Kao 等[28]研究发现具有均匀和精细结构的蛋白凝胶由于其微孔结构可以更牢固地保留水分子，从而具有更高的持水性。研究结果表明，超声处理可以促进蛋白质形成规则的凝胶网络结构，更有利于水的物理截留。
3 结论
不同的干燥方式会使蛋清蛋白的结构发生变化，从而导致其理化性质和功能特性的不同。通过SDSPAGE 和FT-IR 分析研究了不同干燥方式对蛋清粉凝胶的热聚集行为的影响。通过对比分析得出：超声辅助喷雾干燥使蛋清蛋白的一级结构发生轻微聚集，且干燥温度的增加使α-螺旋结构的氢键作用增强，使暴露的疏水基团被包裹于蛋白内部，蛋白发生热聚集。相较SD 处理，超声处理使得U-SD 蛋清蛋白的二级结构含量中α-螺旋与β-折叠含量均稍有增加。荧光显微镜的结果表明超声处理能够加速喷雾干燥作用后蛋清蛋白发生的聚集。通过对不同干燥方式下蛋清蛋白凝胶特性的研究，发现相较FD，SD 蛋清粉凝胶特性在其硬度、弹性、咀嚼性和回弹性得到了改善，失水率明显降低（P＜0.05）。在流变动态升温过程中，表现出更高的弹性（P＜0.05）；U-SD 蛋清凝胶的凝胶硬度更大，失水率降低（P＜0.05）；并且荧光显微镜从视觉上直接证实了U-SD 促进蛋清蛋白发生了强烈的聚集。随着干燥技术与装备的日益成熟，本研究为超声辅助喷雾干燥蛋清蛋白在食品加工业中的应用提供理论依据。
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