桑树在我国种植非常广泛，其中广西、云南、四川3 省桑园面积最大，共占全国的50%以上，有着巨大的市场潜力。桑叶通常用于养蚕，研究发现桑叶也可以作为一种高营养价值的原料添加在各种畜禽饲料里[1-4]，缓解饲料短缺问题。目前，桑叶粉已被我国国家卫健委批准为新食品资源，可用于食品生产加工，但相关产品较少，市场上常见的主要有桑叶饮料、桑叶茶等[5-6]。桑叶蛋白质含量较高，约占干重的25%[7]，是一种非常优质的植物蛋白质资源[8]。国内外对桑叶蛋白的研究利用尚处于起步阶段，目前的研究大多集中在桑叶蛋白提取工艺优化、功能特性研究以及营养价值评价等方面。一般来说，不同干燥方式（如热风干燥和冷冻干燥）对蛋白质的理化性质和消化特性都有显著的影响。胡方洋等[9]发现，经冷冻干燥处理后的苦荞蛋白含量最高、溶解性与乳化性均较好，热风干燥、微波干燥效果依次降低。杨晶[10]研究了自然晾干、烘箱烘干、微波干燥对桑叶蛋白提取率的影响，发现自然晾干和烘箱烘干的蛋白提取率显著高于微波干燥，表明自然晾干或60 ℃烘箱烘干干燥桑叶对蛋白溶出更为有利。因此，选择合适的干燥方式对保持桑叶蛋白质的结构和营养特性，提高桑叶蛋白的综合利用率至关重要。本试验旨在研究热风烘干和冷冻干燥对桑叶蛋白质结构、理化性质及其营养特性等方面的影响，以期为桑叶蛋白的高值化利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑叶：江西省蚕桑茶叶研究所；大豆油：中粮福临门食品营销有限公司；酸洗硅藻土：上海麦克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（30 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、胰凝乳蛋白酶（800 U/mg）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氢氧化钠、盐酸、甲醇、乙醇、硫酸、石油醚、氯化钠、氯化镁、碳酸铵、硫酸铵（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司。
1.2 仪器与设备
pH 计（PHS-3C）：上海仪电科学仪器股份有限公司；冷冻干燥机（FD-1）：北京德天佑科技发展有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（OHG-914385-Ⅲ）：上海新苗医疗器械制造有限公司；氨基酸分析仪（S-433D）：德国SYKAM 公司；超纯水制备机（Milli-Q50）：美国Millipore 公司；全自动凯氏定氮仪（K9860）：海能未来技术集团股份有限公司；蛋白质电泳仪（Tanon EPS 600）、凝胶成像系统（Tanon 1600R）：上海天能科技有限公司；多功能圆二色光谱仪（MOS-450）：法国Bio-Logic公司；扫描电镜（Regulus 810003040700）：日本日立公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet is50 03031300）：赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑叶干燥方法及蛋白提取
将新鲜的桑叶分为3 等份，其中一份用榨汁机打成匀浆液；另外两份分别经热风烘干（120 ℃烘干叶片表面水分后冷却至室温25 ℃，再将叶片于70 ℃烘至足干）和真空冷冻干燥，将干燥后的桑叶粉碎过40 目筛，备用。参考Ren 等[11]的方法，并适当修改，用0.3 mol/L NaOH 溶液[料液比1∶30（g/mL）]在75 ℃水浴中浸提1.5 h，浸提过程中连续搅拌，5 000 r/min 离心15 min 取上清液，添加（NH4）2 SO4 至30%沉淀蛋白，离心后透析除盐，用0.1 mol/L HCl 调pH 值为3.8，4 ℃静置0.5 h，5 000 r/min 离心15 min 取沉淀，经真空冷冻干燥后分别得到新鲜桑叶蛋白提取物（FMLP）、热风烘干桑叶蛋白提取物（HDMLP）、冷冻干燥桑叶蛋白提取物（FDMLP），以新鲜桑叶蛋白提取物作为对照进行分析比较。
1.3.2 桑叶蛋白基本化学成分的测定
蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；粗脂肪含量测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏抽提法；灰分含量测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的方法；水分含量测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中直接干燥法；粗纤维的测定参照GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》中的方法；氨基酸组成测定参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法。
1.3.3 体外消化实验
体外消化实验参考周荣荣等[12]的方法，消化液的配制如表1 所示。
表1 消化液配方
Table 1 Formula of digestive juice mL
消化液 0.5 mol/L KCl 溶液模拟唾液 15.10模拟胃液 6.90模拟肠道液 6.80 0.80 42.509.60 1.10 0.70
口腔消化阶段：称取0.5 g 蛋白提取物，加入5 mL蒸馏水，溶解后得到样品溶液，等体积加入4.0 mL 模拟唾液（simulated salivary fluid，SSF）、25 μL 0.3 mol/L CaCl2·2H2O、975 μL 蒸馏水，混合均匀后调节pH 值为7，将样品置于37 ℃下振荡消化2 min。
胃消化阶段：在完成口腔消化后的10 mL 样品中等体积加入7.5 mL 模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）、1.6 mL 胃蛋白酶（25 000 U/mL）、5 μL 0.3 mol/L CaCl2·2H2O、0.2 mL 1 mol/L HCl、695 μL 蒸馏水，混合均匀后调节pH 值为3，将样品置于37 ℃下振荡消化2 h。消化结束后，取其中一份，加入100 μL 17.42 mg/mL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）灭酶结束胃消化，5 000 r/min 离心15 min 取上清，经冷冻干燥后冻存备用。
肠消化阶段：在完成胃部消化后的20 mL 样品中等体积加入11 mL 模拟肠道液（simulated intestinal fluid，SIF）、5 mL 胰蛋白酶（800 U/mL）、2.5 mL 胰凝乳蛋白酶（400 U/mL）、40 μL 0.3 mol/L CaCl2·2H2O、0.15 mL 1 mol/L NaOH、1.31 mL 蒸馏水，混合均匀后调节pH 值为7，将样品置于37 ℃下振荡消化2 h。消化结束后，加入100 μL 17.42 mg/mL PMSF 灭酶结束肠消化，5 000 r/min 离心15 min 取上清，经冷冻干燥后冻存备用。
氮含量分布的测定参考傅秋云等[13]的方法。
1.3.4 功能特性测定
1.3.4.1 溶解性
参考孟妍[14]的方法并稍作修改，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH 调节不同pH 值的溶液，各取10 mL，加入0.1 g 样品，搅拌30 min，10 000 r/min 离心5 min后备用，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质量浓度，用牛血清白蛋白绘制标准曲线，根据标准曲线计算样液中蛋白质含量。
1.3.4.2 吸水性
称取适量样品，记为m（g），将样品置于离心管中，称离心管质量，记为m1（g），加入10 mL 蒸馏水，混匀后静置30 min，10 000 r/min 离心5 min 弃上清液，称离心管质量，记为m2（g），吸水性（y）计算公式如下。
1.3.4.3 吸油性
称取适量样品，记为m（g），将样品置于离心管中，称离心管质量，记为m1（g），加入10 mL 大豆油，混匀后静置30 min，10 000 r/min 离心5 min 弃上清，称离心管质量，记为m2（g），吸油性（x）计算公式如下。
1.3.4.4 起泡性
称取0.2 g 样品于250 mL 的烧杯中，加入100 mL蒸馏水，10 000 r/min 均质2 min，迅速倒入250 mL 的量筒中，记录泡沫体积v，起泡性（a）计算公式如下。
1.3.4.5 乳化性及乳化稳定性
乳化活性测定参考孟妍[14]的方法，取10 mL 1%的样品溶液加入20 mL 大豆油，10 000 r/min 均质3 min后静置，分别在静置0 min 和10 min 时，从乳化液底部吸取100 μL，加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），在500 nm 条件下测定吸光值。乳化性用乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）表示[15]。乳化稳定性数（emulsifying stability，ES）用乳化稳定指数（emulsifying stability index，ESI）表示。EAI 和ESI 公式如下。
式中：A0 为0 min 时样品的吸光值；N 为稀释倍数；c 为蛋白浓度，g/mL；Φ 为油相体积分数，2/3；L 为光程长，1 cm。
式中：A0 为0 min 时样品的吸光值；Δt 为时间差，min；ΔA 为Δt 内的吸光值差。
1.3.5 蛋白结构表征
1.3.5.1 桑叶蛋白分子量表征
桑叶蛋白提取：将新鲜桑叶用液氮研磨成粉，取3 个离心管，分别加入1 g 新鲜桑叶粉、烘干桑叶粉、冻干桑叶粉，再各自加入3.5 mL 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）叶蛋白提取液，混匀后置于冰上静置4 h，10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，分别得到FMLP-P、HDMLP-P、FDMLP-P，-80 ℃保存备用，用于提取少量桑叶叶蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 垂 直 板 电泳。样品处理：将样品溶于磷酸盐缓冲液中，取0.5 mL样液加入0.1 mL 6×上样缓冲液，沸水浴5 min，冷却至室温25 ℃。
PVP 蛋白提取液配制：加入15 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8）、25 mL 甘油、2 g PVP，用超纯水定容至100 mL。
Tris-SDS-PAGE：配制10%的分离胶和5%的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，接通电源调节电压80 V，电泳30 min使蛋白样品浓缩均一，当样品进入分离胶后将电压调高至120 V，继续电泳60 min，当溴酚蓝跑到分离胶底部后停止电泳。蛋白质条带用考马斯亮蓝R-250 染色30 min，再用甲醇、乙酸脱色液脱色[15]，脱色5 h～6 h 至背景脱色完全，并使用Tanon 1600R 图像处理系统进一步扫描。
Tricine-SDS-PAGE：配制10%的分离胶和4%的积层胶进行小分子蛋白电泳，在电泳槽底部加入Tris-Tricine-SDS 阳极电泳缓冲液，两块胶间加入Tris-Tricine-SDS 阴极电泳缓冲液，接通电源调节电压60 V，电泳30 min 使蛋白样品浓缩均一，当样品进入分离胶后将电压调高至120 V，继续电泳120 min，当溴酚蓝跑到分离胶底部后停止电泳。蛋白质条带染色、脱色Tris-SDS-PAGE。
蛋白质条带鉴定：用胰蛋白酶对样品进行酶解，在37 ℃条件下酶解20 h，酶解产物脱盐后冻干，复溶于0.1%甲酸溶液中，-20 ℃保存待用。采用质谱对样液进行分析：A 液为0.1%甲酸水溶液，B 液为0.1%甲酸的乙腈（84%）水溶液，色谱柱以95%的A 液平衡后，样品由自动进样器上样。多肽和多肽碎片的质量电荷比采集为每次全扫描后采集20 个碎片图谱，数据分析用Proteome Discoverer 1.4 软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。
1.3.5.2 傅里叶变换红外光谱
样品研磨成粉末，用KBr 压片法制样后，采用傅里叶变换红外显微光谱仪测定蛋白含有基团的种类，波数测试范围4 000 cm-1～400 cm-1。
1.3.5.3 圆二色谱
采用磷酸盐缓冲液溶解蛋白，蛋白浓度为0.1 mg/mL，持续氮气流下，扫描速度设定为120 nm/min，扫描190 nm～250 nm 范围内桑叶蛋白的圆二色谱。桑叶蛋白二级结构的含量通过在线SELCON3 程序计算[16]。
1.3.5.4 扫描电镜
取少量样品粉末撒在粘有导电胶带的样品台上，并去除多余的粉末，离子溅射仪镀金1 min 后，用扫描电子显微镜观察粉末的表面形态，加速电压10 kV，选择放大倍数5 000×、10 000×、20 000×对样品进行表面形貌的观察。
1.4 数据分析
采用Origin 2018、Excel 2020、GraphPad Prism8 和SPSS Statistics 26 软件对试验数据进行分析和处理，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 干燥方式对桑叶蛋白提取物基本化学组成的影响
获得的3 种桑叶蛋白提取物基本化学组成如表2所示。
表2 3 种桑叶蛋白提取物的基本化学组成
Table 2 Basic chemical composition of three mulberry leaf protein extracts
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
?
相比于王芳等[8]（42.5%）、杨晶[10]（49.58%）、孙崇臻等[17]（47.20%～62.40%）试验研究提取的桑叶蛋白得率，本试验中桑叶蛋白提取物中蛋白质含量较高，均达到60%以上，表明本试验中采用的提取方法能够得到纯度较高的蛋白。3 种桑叶蛋白提取物中蛋白质、脂肪、灰分、水分、纤维含量分别出现显著差异（P＜0.05），说明不同的干燥方法对桑叶蛋白提取物的基本化学成分影响较大。FDMLP 中脂肪和水分含量均显著高于HDMLP（P＜0.05），而HDMLP 的灰分含量显著高于FDMLP（P＜0.05）。FDMLP 中蛋白质含量最高，达到68.89%，FMLP（66.22%）次之，HDMLP（63.90%）最低。原因可能是在真空冷冻干燥过程中水分的干燥使得叶片组织变得更加疏松多孔，在提取时有利于蛋白质的溶出，而热风烘干中的高温会导致水分快速流失，叶片迅速收缩，不利于蛋白质的溶出，导致蛋白质含量降低。
2.2 干燥方式对桑叶蛋白提取物氨基酸组成的影响
氨基酸组成是影响蛋白质营养价值的关键因素，3 种桑叶蛋白提取物中蛋白质氨基酸的组成如表3所示。
表3 3 种桑叶蛋白提取物的氨基酸组成及含量
Table 3 Amino acid composition and content of three mulberry leaf protein extracts
注：EAA 为必需氨基酸；NEAA 为非必需氨基酸；TAA 为总氨基酸。
EAA/（mg/g pro）NEAA/（mg/g pro）提取物 异亮氨酸FMLP 35.28 HDMLP 32.66 FDMLP 34.75亮氨酸79.10 71.89 79.54赖氨酸蛋氨酸44.44 13.13 44.44 12.09 47.95 12.85苯丙氨酸46.91 42.29 44.81苏氨酸25.85 25.73 24.06缬氨酸43.46 42.41 45.28天冬氨酸62.69 63.09 63.30丝氨酸甘氨酸丙氨酸谷氨酸 半胱氨酸23.65 37.01 40.89 70.47 0.72 22.80 35.28 39.82 72.68 0.73 23.75 36.47 37.06 73.22 0.85酪氨酸29.35 29.71 34.25 TAA（EAA/TAA）/%（EAA/NEAA）/%组氨酸精氨酸脯氨酸12.87 9.58 30.85 606.25 48 91 11.16 9.06 30.39 586.23 46 86 12.25 6.97 30.05 609.11 47 90
由表3 可知，3 种桑叶蛋白提取物中共检测到17 种氨基酸，氨基酸种类丰富且含量较高，必需氨基酸（essential amino acids，EAA）占总氨基酸（total amino acid，TAA）含量的46%～48%，与非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）的比值在86%～91%，联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO） 氨基酸模式中提出当EAA/TAA 约为40%，EAA/NEAA 在60%以上时为较理想的蛋白质，可见桑叶蛋白是一种比较理想的植物蛋白质资源。在检测到的氨基酸中，亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量较高。不同的桑叶干燥方法得到蛋白的氨基酸组成类似，无较大差异，EAA/TAA 的占比接近，但其中FDMLP 的TAA 含量最高，这应该与蛋白质含量有关。3 种桑叶蛋白中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量丰富，它们在蛋白质合成中起重要作用，是人体肌肉生长所必需的氨基酸。此外，桑叶蛋白还富含多种功能性非必需氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸，它们在维持正常生理功能、调节代谢和预防包括糖尿病在内的多种慢性病方面发挥着十分重要的作用。
将桑叶蛋白中的必需氨基酸的含量与FAO/WHO人体必需氨基酸模式进行比较，计算出必需氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA），RAA=待评蛋白质中的EAA 值/模式中相应EAA 值；氨基酸比值系数（ratio coefficient of amino acid，RC），RC=RAA/RAA 均数，RC=1说明待评蛋白质的氨基酸组成比例与模式氨基酸一致，RC＞1 说明该EAA 相对过剩，RC＜1 说明该EAA 相对不足，RC 最小值对应的氨基酸为第一限制性氨基酸；比值系数分（score of ratio coefficient of amino acid，SRC），SRC=100-CV×100（CV 为RC 的变异系数，CV=标准差/均值），SRC=100 时，说明待评蛋白质的EAA 组成比例与模式一致，SRC 越接近100，其营养价值相对越高，SRC 越小，说明其营养价值越低。对桑叶蛋白的营养评价采用氨基酸比值系数法，如表4 所示。
表4 3 种桑叶蛋白提取物氨基酸比值系数法的评价
Table 4 Evaluation of amino acid ratio coefficient method for three kinds of mulberry leaf protein extracts
FAO/WHO 推荐必需氨基酸组成蛋白质来源蛋白质特征值异亮氨酸 亮氨酸赖氨酸蛋氨酸+半胱氨酸苯丙氨酸+酪氨酸苏氨酸缬氨酸比值系数分FMLP RAA 0.88 1.13 0.81 0.40 1.27 0.65 0.87 66.56 RCAA 1.02 1.31 0.94 0.47 1.48 0.76 1.01 HDMLP RAA 0.82 1.03 0.81 0.37 1.20 0.64 0.85 67.46 RCAA 1.00 1.26 0.99 0.45 1.46 0.78 1.04 FDMLP RAA 0.87 1.14 0.87 0.39 1.32 0.60 0.91 64.34 RCAA 1.00 1.31 1.00 0.45 1.52 0.69 1.05
表4 结果显示，不同蛋白质的氨基酸评价结果非常接近，在3 种蛋白质中，蛋氨酸+半胱氨酸的RCAA值均为最低，分别为0.47、0.45、0.45，说明桑叶蛋白的第一限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸。其他必需氨基酸中，异亮氨酸、赖氨酸和缬氨酸组成比例与标准模式基本一致，苏氨酸略低于标准模式，其含量相对不足，亮氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸均高于标准模式，其含量相对过剩。因此，可采用蛋白质互补理论将桑叶蛋白质与其他蛋白质互补，可以提高各种蛋白质的营养价值。桑叶蛋白质的SRC 在67 左右，是一种较为优质的植物蛋白质资源。
2.3 干燥方式对桑叶蛋白提取物体外模拟消化产物的影响
3 种桑叶蛋白提取物的消化情况见图1。
图1 3 种桑叶蛋白提取物胃消化产物及胃肠消化产物
Fig.1 Gastric digested products and gastrointestinal digested products of three mulberry leaf protein extracts
通过氮含量的分布情况可以更加直观地观察到桑叶蛋白在每一消化阶段的消化情况。由图1A 可知，FMLP、HDMLP、FDMLP 经胃阶段消化后，不可溶性部分的氮含量占比分别为68.95%、78.83%、76.01%；可溶性部分的氮以肽形式和游离氨基酸形式存在，其中肽占比分别为23.19%、17.22%、18.19%，游离氨基酸占比分别为7.86%、3.95%、5.80%，以上结果表明经胃阶段消化后游离氨基酸在可溶性部分中的含量很少，肽构成可溶性部分的主要成分。
从图1B 能够看出，在经胃肠阶段消化后，FMLP、HDMLP、FDMLP 中不可溶性部分的氮含量占比下降，分别降至40.83%、33.59%、35.56%，可溶性部分中的氮含量占比升高，其中肽的比例分别为42.51%、47.57%、47.61%，游离氨基酸的比例分别为16.66%、18.84%、16.84%，表明桑叶蛋白的消化主要在肠道进行，在胃阶段消化很少。经胃肠消化后，HDMLP 的消化率最高（66.41%），FDMLP 次之（64.44%），高于FMLP（59.17%），表明桑叶经热风烘干后提取出的蛋白质更容易消化，原因可能是烘干过程中的热处理导致蛋白质部分变性或降解，同时蛋白分子结构打开、质量降低，更易于蛋白酶的酶解，从而提高其消化率[18]。
2.4 桑叶蛋白的分子量及主要蛋白质种类鉴定
利用SDS-PAGE 对3 种蛋白提取液进行蛋白质结构表征，如图2 所示。
图2 3 种桑叶蛋白的SDS-PAGE 结果
Fig.2 SDS-PAGE of three mulberry leaf proteins
由图2A 可知，从新鲜桑叶和冻干桑叶中提取的蛋白电泳条带表达情况一致，主要由一条约52 kDa 分子量的蛋白条带组成，而从烘干桑叶提取得到的蛋白电泳条带表达明显变淡，隐约可见微弱的电泳条带，而其他条带几近消失，原因可能是桑叶在长时间烘干加热过程导致大部分蛋白质被降解成小分子蛋白或肽段，因而在进行电泳时相关蛋白条带的表达减弱。从图2B小分子蛋白电泳结果能够看到，FMLP-P、FDMLP-P 泳道顶端有较多无法分离的大分子蛋白聚集，而HDMLP-P 泳道顶端可见少量无法分离的大分子蛋白，这与图2A 的结果一致；HDMLP-P 在约15 kDa 处有明显的小分子蛋白条带表达，而FMLP-P、FDMLP-P中在该处的蛋白条带十分微弱，说明桑叶经热风烘干后其主要蛋白（约52 kDa）降解为约15 kDa 分子量的小分子蛋白，试验结果表明，桑叶烘干的热处理过程对桑叶蛋白质分子有较大的影响，会导致其发生大量降解，而目前暂未有研究报道这一现象，说明选择合适的桑叶干燥方式对桑叶蛋白的提取利用至关重要。
对在52 kDa 处的桑叶蛋白条带进行分析鉴定，进一步确定其蛋白的组成，结果如表5 所示。
表5 52 kDa 蛋白条带中主要蛋白质的鉴定
Table 5 Identification of major proteins in 52 kDa protein bands
鉴定蛋白 序列数据编号 特征肽序列覆盖率/%分子量/kDa 丰度二磷酸核酮糖羧化酶大链 A0A7U0IU28 3 50 52.6 4.32×1010叶绿体ATP 合成酶β 亚基 A0A7U0ITQ2 24 65 53.7 9.09×108叶绿体ATP 合成酶α 亚基 A0A172R2T8 17 37 55.4 2.86×108过氧化氢酶 A0A6G8IRL7 14 34 56.8 2.48×108谷胱甘肽还原酶 A0A6G8IUB2 22 35 60 2.41×108谷胱甘肽还原酶 A0A6G8IU05 19 38 53.5 2.05×108蛋白Ycf2 A0A7U0FLU7 9 4 269.7 1.45×108二磷酸核酮糖羧化酶大链（碎片）P28431 2 38 50.9 1.39×108几丁质酶 E2J9M1 4 11 38.5 1.09×108肌动蛋白 E5FR85 3 28 41.6 5.61×107查尔酮合成酶3 A0A0M3STX2 4 19 43.4 4.56×107叶绿体景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶A8DUA7 8 19 42.5 3.41×107钠/氢交换器7（碎片） A0A0U2K9U2 3 3 127.5 2.76×107叶绿体核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶激活酶（碎片）A8QIH7 5 20 27.2 2.54×107糖基转移酶 A0A1D8KVV1 7 16 50.6 2.30×107过氧化氢酶（碎片） Q8GUS0 2 29 22.2 1.52×107热休克70 kDa 蛋白（碎片） A0A0K1P7S8 6 15 34.9 1.41×107杀虫蛋白LA-a（碎片） P86799 2 100 1.3 9.41×106 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶A0A1D8KVV4 3 5 51.2 8.67×106氧化甾醇结合蛋白相关蛋白A0A075M309 4 8 51.9 6.08×106 4-（胞苷-5＇-二磷酸）-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶A0A1D8KVV9 3 5 44 5.03×106二磷酸核酮糖羧化酶大链（碎片）R4I779 1 40 21.1 4.69×106 4-香豆素-CoA 连接酶7-2 A0A0M4KDV5 3 6 58.7 4.23×106肌动蛋白3（碎片） E7D7Z4 1 23 35.5 3.95×106 ATP 合酶α 亚基（碎片） E5DKD5 1 10 37.4 3.27×106二磷酸核酮糖羧化酶大链（碎片）O20258 1 44 47.6 3.19×106二磷酸核酮糖羧化酶大链（碎片）H9XVD6 1 50 26.7 2.46×106
由表5 可知，共鉴定出27 种蛋白质，鉴定到的蛋白质通过其特征肽、序列覆盖率、分子量、丰度来表征。特征肽是指一个特定蛋白质组特有的、能够将其与其他蛋白质组区分开来的肽序列，特征肽的数量越多，定量越准确。序列表明所鉴定的氨基酸占蛋白质总氨基酸的比例。序列覆盖率大于零表示在样品中已检测到蛋白质，等于零则表示在样品中未检测到。丰度是指蛋白质信号强度，并且是蛋白质的相对量化的结果。根据蛋白质丰度情况分析该条带主要含二磷酸核酮糖羧化酶大链（52.6 kDa，属于RuBisCO 大型连锁家族）和叶绿体ATP 合成酶β 亚基（53.7 kDa，属于ATP酶α/β 链家族），这与李桑[19]在对桑叶蛋白进行组学分析的研究中发现在桑叶蛋白的电泳图中，在43 kDa 附近有一条高丰度的蛋白条带属于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO），分子量约为53 kDa 的研究结果一致。
2.5 桑叶蛋白二级结构分析
2.5.1 傅里叶变换红外光谱分析
傅里叶变换红外光谱对氢键的检测十分灵敏，因此也常被应用到分析蛋白质的二级结构。3 种桑叶蛋白提取物的傅里叶变换红外光谱如图3 所示。
图3 3 种桑叶蛋白提取物的傅里叶变换红外光谱
Fig.3 Fourier transform infrared spectra of protein extracts from three mulberry leaves
从图3 上能看到蛋白质分子表现出许多吸收频带，酰胺A 带、酰胺B 带、酰胺Ⅰ带（1 700 cm-1～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ带（1 600 cm-1～1 500 cm-1）、酰胺Ⅲ带（1 340 cm-1～1 220 cm-1）等几个吸收峰区域均是蛋白质在红外区产生的特征吸收频带。分析蛋白质二级结构研究较多的为酰氨Ⅰ带，但水分子在该吸收带有吸收峰，容易对定量结果造成较大干扰；酰胺Ⅲ带无水分子吸收峰，可以排除水分子的干扰，但由于其吸收带信号较弱，较少用于二级结构的分析[20]，故在后续采用圆二色光谱法分析桑叶蛋白二级结构各组分含量，在此对傅里叶变换红外光谱仅作吸收峰分析。从图3 能够看出，FDMLP、FMLP 和HDMLP 的吸收峰强度依次减弱，很可能是与蛋白含量有关，这与2.1 的蛋白含量分析结果一致。与HDMLP 相比，FMLP 酰氨Ⅰ带峰位从1 635.65 cm-1 移至1 629.52 cm-1，FDMLP 酰氨Ⅰ带峰位移至1 633.74 cm-1，峰位往低波数方向移动，可能是由于其蛋白分子结构内氢键的改变，在游离氨基酸残基间形成分子间氢键导致的[21]，同时酰氨Ⅰ带峰位右偏移的变化，表明其α-螺旋结构转变为无规卷曲结构[22]，这与蛋白二级结构含量分析的结果一致。
2.5.2 圆二色光谱法分析
蛋白质的二级结构的含量由SELCON3 程序测定，如图4 所示。
图4 3 种桑叶蛋白提取物的二级结构含量
Fig.4 Secondary structure contents of protein extracts from three mulberry leaves
不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4 可知，FMLP、HDMLP 和FDMLP 中β-转角的含量非常接近，FMLP 中α-螺旋和β-折叠的含量略低于HDMLP 和FDMLP，但无明显差异（P＞0.05），而FMLP 中无规卷曲的含量是最高的，为33.08%，显著高于HDMLP（22.96%）和FDMLP（23.98%）（P＜0.05）。这表明桑叶在未经过烘干或冻干时，其蛋白的二级结构在提取过程中更易发生改变，氢键断裂导致蛋白中的有序结构部分向无序结构部分转化，其蛋白中α-螺旋和β-折叠的含量降低，无规卷曲的含量增加[23-24]，但对β-转角的含量无明显影响，而经过高温干燥处理的桑叶，其蛋白在提取前已发生部分变性。FMLP 中α-螺旋含量较低，可能导致蛋白质表面疏水性的增加[25]，无规卷曲含量较高，使其比HDMLP 和FDMLP 具有更无序和松散的蛋白质分子结构，更有利于水解[11]，且由于蛋白质分子之间的聚集，同时会使得蛋白质的溶解度降低[26]。
2.6 扫描电镜表征桑叶蛋白超微结构
将3 种桑叶蛋白提取物经冷冻干燥后获得桑叶蛋白粉，通过扫描电镜对其微观形貌进行表征，如图5 所示。
图5 3 种桑叶蛋白提取物的微观形貌
Fig.5 Microscopic morphology of three kinds of mulberry leaf protein extracts
由图5 可以看出3 种蛋白的微观形貌有着较大的差异，FMLP 的表面最为平整光滑，结构致密，而HDMLP和FDMLP 的表面较为粗糙，结构疏松多孔。蛋白质的微观结构对其功能特性会产生一定的影响[27]，通过对其功能特性的研究我们可以知道HDMLP 和FDMLP的溶解性、吸水性、吸油性均高于FMLP，这可能与微观形貌有关，HDMLP 和FDMLP 的表面粗糙多孔，导致其接触面积增大，更有利于蛋白与油、水的接触，从而增加蛋白的吸水性和吸油性以及在水中的溶解性。
2.7 干燥方式对桑叶蛋白提取物功能特性的影响
2.7.1 pH 值对桑叶蛋白提取物溶解性的影响
pH 值对桑叶蛋白提取物溶解性的影响如图6 所示。
图6 3 种桑叶蛋白提取物的溶解性
Fig.6 The solubility of three mulberry leaf protein extracts
由图6 可知，随着pH 值的变化，蛋白的溶解性也不断变化，桑叶蛋白在pH4 时溶解性最低，因此可以判断桑叶蛋白的等电点在pH4 左右。当蛋白处于等电点时，其净电荷为零，蛋白质分子间的相互作用力减弱，导致蛋白颗粒极易碰撞、聚集而产生沉淀，所以蛋白处于等电点时，其溶解性最低，而远离等电点后，蛋白溶解性升高。pH2～pH3 时溶解性高于pH4，随着pH值从5 升高到10，桑叶蛋白的溶解性逐渐升高，到达pH11 时溶解性迅速增加，说明碱性环境更有利于桑叶蛋白的溶解。从图6 中可以看出，pH12 时，HDMLP 的溶解性最高（35.37 mg/mL），FDMLP 次之（33.74 mg/mL），FMLP 溶解性最差（17.91 mg/mL），说明桑叶在经过烘干或冻干处理后均可以提高其提取蛋白的溶解性，通过前面的扫描电镜分析可以推测主要原因可能是与蛋白表面形貌结构有关。
2.7.2 3 种桑叶蛋白提取物的部分功能特性
蛋白质的起泡能力是指蛋白质在一定条件下与水分、空气形成泡沫的量，对蛋白在食品加工体系中的实际应用有较大影响，3 种桑叶蛋白提取物的部分功能特性如表6 所示。
表6 3 种桑叶蛋白提取物的部分功能特性
Table 6 Partial functional characteristics of three mulberry leaf protein extracts
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
吸油性/（g/g）FMLP 119.81±3.61a 59.30±0.52b 37.32±0.33a 2.22±0.03b 1.68±0.20a HDMLP 57.67±2.52c 62.53±1.25a 37.71±0.75a 3.46±0.14a 2.04±0.20a FDMLP 93.67±3.21b 53.08±0.87c 33.87±0.29b 3.28±0.24a 2.05±0.37a样品 起泡性/% 乳化性/（m2/g）乳化稳定性/%吸水性/（g/g）
由表6 可知，FMLP 的起泡性较好，HDMLP 的起泡性最差，显著低于FMLP 和FDMLP（P＜0.05），通常蛋白分子质量降低有利于提高起泡性，而HDMLP 起泡性较低可能是因为桑叶干燥过程中蛋白质过度降解，产生较多的小分子多肽难以维持液膜强度[28]，在乳化体系中，添加蛋白质能够降低油水两相的界面张力，阻止油滴聚集，提高乳化稳定性。与起泡性相反，HDMLP具有较好的乳化性[（62.53±1.25）m2/g] 和乳化稳定性[（37.71±0.75）%]，FDMLP 较差，分别为（53.08±0.87）m2/g、（33.87±0.29）%，显著低于FMLP 和HDMLP（P＜0.05），可能是桑叶经热风烘干时蛋白质分子结构被破坏，更多疏水基团暴露，增加了其在油水界面的吸附，其乳化性和乳化稳定性得到改善，提高乳液稳定性。
蛋白质的吸水性和吸油性是指其吸收水分和油的能力，这对蛋白质在相关的实际应用中有着重要的影响。HDMLP 的吸水性、吸油性分别为（3.46±0.14）g/g、（2.04±0.20）g/g，FDMLP 分别为（3.28±0.24）g/g、（2.05±0.37）g/g，均高于FMLP，表明不同干燥方式，会对桑叶蛋白的功能特性有较大影响，增加蛋白质吸水性和吸油性的能力，新鲜桑叶提取得到的蛋白吸水性和吸油性相对较差，可能与其蛋白质颗粒表面平整致密的形貌有关，减少了与油、水的接触面积，导致吸水性和吸油性降低。
3 结论
采用热风烘干和冷冻干燥两种方式处理桑叶，并提取其中的桑叶蛋白，结果表明热风烘干和冷冻干燥两种干燥方式对桑叶蛋白质的氨基酸组成无明显影响，第一限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸，其EAA/TAA、EAA/NEAA 和SRC 结果表明桑叶蛋白是一种优质的植物蛋白质资源。经电泳试验发现热风烘干处理过程可能会导致蛋白质被降解；圆二色谱法分析二级结构发现FMLP 中无规卷曲含量最高，可达33.08%；模拟体外消化试验表明桑叶经烘干后提取的蛋白更容易消化，消化率达到66.41%，而且桑叶经烘干或冻干后，会对其蛋白的功能特性有较大影响，如增加蛋白的溶解性、吸水性和吸油性，这可能均与其微观表面更加疏松多孔有关。综上，桑叶经热风烘干后会提高其蛋白的消化率、溶解性等，但同时也会造成蛋白质的降解或变性，而真空冷冻干燥的方式干燥桑叶对其蛋白结构的影响更小，能够更好保存蛋白的特性，本研究可为进一步提高桑叶蛋白的综合利用率提供参考。
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