蛹虫草（Cordyceps militaris）又称北冬虫夏草[1]，属麦角菌科虫草属真菌，原产于我国，2009年被国家卫生部批准为新资源食品，是一种具有较高价值的药食两用真菌[2-4]。蛹虫草富含多糖、虫草素、核苷类、麦角甾醇、虫草酸、虫草多肽和生物碱等多种生物活性物质[5-7]。其中，蛹虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides，CMP）是其含有的重要活性成分之一[8]，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、调节血糖、调节血脂等[9-14]多种功效，在食品等领域有较高的使用价值[15]。
CMP含量少、提取率不高、提取难度大，因此，研究高效、提取率高的CMP提取工艺是当前学者的研究重点。目前，CMP提取方法主要有热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法、亚临界水提法、高压提取法等[16-19]，这些方法存在提取率低、时间长、能耗高等缺点。超声波辅助提取是一种新型提取技术，但目前超声波辅助提取多为单频超声波提取，陈静雯等[20]利用频率不可调节的单频超声波，优化了超声辅助酶法提取CMP的工艺。单频超声波的超声场分布不均匀，空化效应不完全，会不同程度地影响提取率。双频逆流聚能式超声波辅助技术，根据双频超声场更加均匀、能量效率高的原理，采用逆流工作模式和聚能声场，有利于提高提取液与超声波的接触频次，集中固定声场，缩短提取时间，提高场强能量，节省能耗。利用双频聚能式超声场的强化作用使细胞破壁效应更强，更好地促使CMP溶出，提高其提取效率。本文拟采用双频逆流聚能式超声波辅助提取CMP并通过响应面优化其提取工艺，同时对蛹虫草多糖的抗菌和抗氧化活性进行研究，以期为CMP的提取及其抗菌、抗氧化活性的研究和产品进一步开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蛹虫草：市售；苯酚、无水乙醇、浓硫酸、亚硝酸钠、葡萄糖、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、三氯甲烷、联苯双酯、过氧化氢、四氯化碳、正丁醇、水杨酸（均为分析纯）：天津沅素化学试剂有限责任公司；维生素C（食品级）：华北制药股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH]试剂：合肥博美生物科技有限责任公司；牛肉膏、蛋白胨：北京陆桥股份有限公司。
1.2 仪器与设备
特制双频逆流聚能式超声设备（TSNJCS-20）：江苏江大五棵松生物科技有限公司；台式高速离心机（TD6M）：绍兴市苏波仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE550）：青岛明博环保科技有限公司；紫外可见分光光度计（N6000S）：青岛精诚仪器仪表有限公司；手提式高速万能粉碎机（DFT-50）：上海化科实验器材有限公司；台式真空干燥箱（DZF-6020）：中新医疗仪器有限公司；智能恒温振荡器（HNY-200B）：天津欧诺仪器股份有限公司；电热鼓风干燥箱（GF101-4）：南京宇盼机械科技有限公司；生化培养箱（SPX-250B）：上海力辰科技仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蛹虫草预处理
将蛹虫草置于60℃烘箱中干燥，经粉碎机粉碎，过0.18 mm筛，得到蛹虫草粉，备用。
1.3.2 CMP的提取
蛹虫草粉→按料液比1∶20（g/mL）加入纯化水→放入双频逆流聚能式超声设备中，按照双频逆流聚能式超声波辅助法的条件提取→提取液脱蛋白（Sevage法[21]）→离心（4 000 r/min，20 min）→上清液减压浓缩→4倍体积的无水乙醇沉淀→静置4℃冰箱24 h→离心（4000 r/min，20 min）→真空冷冻干燥→蛹虫草粗多糖。
1.3.3 CMP的测定
采用岳峥嵘等[22]的苯酚-硫酸法进行测定。
1.3.4 CMP提取率的计算
CMP提取率按式（1）计算。
式中：m1为提取的CMP的质量，g；m2为蛹虫草粉样品质量，g。
1.3.5 CMP提取单因素试验
以CMP提取率为指标，采用1.3.2的方法，将预处理后的蛹虫草粉分别按照以下3个单因素试验进行蛹虫草多糖的提取：超声波功率100、200、300、400 W和500 W，超声温度60℃，提取时间50 min；超声温度50、55、60、65℃和 70℃，超声波功率 400 W，提取时间50 min；提取时间 30、40、50、60 min 和 70 min，超声波功率400 W，超声温度60℃。以上试验均固定双频超声提取的频率为20/40 kHz，每组试验重复3次。
1.3.6 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，选用Design-Expert 12软件中的Box-Behnken模型进行三因素三水平响应面试验设计。试验因素与水平见表1。
表1 试验因素与水平
Table 1 Test factors and levels
水平 A超声波功率/W B超声温度/℃ C提取时间/min-1 300 55 40 0 400 60 50 1 500 65 60
1.3.7 体外抗氧化活性的测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定
根据吴杨洋等[8]的方法并稍作修改，于波长517 nm处测吸光度，其中用CMP溶液测吸光度，记为A1；用等体积超纯水代替DPPH溶液，测吸光度，记为A2；用等体积超纯水代替CMP溶液，测吸光度，记为A0。DPPH自由基清除率按式（2）计算。
式中：A0为空白组的吸光度；A1为样品组的吸光度；A2为对照组的吸光度。
1.3.7.2 羟基自由基清除能力测定
根据王迦琦等[23]的方法并稍作修改，于波长510 nm处测吸光度。羟基自由基清除率按式（3）计算。
式中：A3为空白组的吸光度；A4为样品组的吸光度；A5为对照组的吸光度。
1.3.8 体外抗菌活性测定
根据李晓娇等[24]的方法，利用2倍稀释法，将CMP用无菌水配成系列梯度浓度（0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL和6.4 mg/mL）的样品液，备用。采用龚祥等[25]的滤纸片法，将圆形滤纸片灭菌后，放在含供试菌的培养皿上，用移液管移取5 μL的CMP样品液滴在滤纸片上，置于生化培养箱中，于35℃恒温培养24 h，测其抑菌圈直径，加无菌水的滤纸片作空白对照，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为开始出现抑菌圈时的浓度。
1.3.9 数据处理
各试验均重复3次取平均值。采用SPSS 16.0软件和Design-Expert 12软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声波功率的影响
超声波功率对CMP提取率的影响如图1所示。
图1 超声波功率对CMP提取率的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic power on CMP extraction yield
由图1可知，随着超声波功率的提高，CMP提取率先升高再略有降低，在400 W时达到最大值，为7.15% 。这是由于超声功率的提高，增大了超声波的空化和机械作用，细胞壁破裂程度和数量增加，提取率升高；当超声波功率为400 W时，细胞壁破裂基本完全，多糖溶出基本彻底，再继续提高超声波功率，多糖不再溶出，反而过高的超声波功率会对多糖结构造成部分破坏[26]，使提取率下降，这与孙颖等[27]的研究结果一致。所以，超声波功率400 W为宜。
2.1.2 超声温度的影响
超声温度对CMP提取率的影响如图2所示。
图2 超声温度对CMP提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on CMP extraction yield
由图2可知，随着超声温度的升高，CMP提取率先升高后下降，在60℃时达到最大值7.16% 。这是由于提高超声温度，料液黏度下降，导致蛹虫草细胞壁疏松，超声波空化效应使细胞壁易于破碎，多糖易于溶出，提取率升高；当超声温度超过60℃后，多糖会部分水解，致使提取率下降[28]，这与吴杨洋等[8]的研究结果一致。所以，超声温度60℃为宜。
2.1.3 提取时间的影响
提取时间对CMP提取率的影响如图3所示。
图3 提取时间对CMP提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on CMP extraction yield
由图3可知，随着提取时间的延长，CMP提取率呈先升高后下降的趋势，并在50 min时达到最大值，为7.18% 。这是由于延长提取时间，增强了超声波的空化和机械作用，蛹虫草细胞壁破裂程度和数量增加，多糖溶出增多，提取率提高；当提取时间超过50 min后，过长的提取时间会使多糖部分破坏[29]，导致提取率下降，这与李顺峰等[30]的研究结果一致。所以，提取时间50 min为宜。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 回归方程的建立
在单因素试验的基础上，以超声波功率（A）、超声温度（B）和提取时间（C）为3个影响因素，CMP提取率（Y）为响应值，进行响应面试验。试验方案与结果见表2。
表2 响应面试验结果
Table 2 Result of response surface test
试验号 A B C CMP提取率/% 1-1 -1 0 5.13 2 1-1 0 5.82 3-1 1 0 5.26 4 1 1 0 5.87 5-1 0 -1 5.17 6 1 0-1 5.92-1 0 1 5.43 8 1 0 1 6.08 7 9 0-1 -1 5.38 10 0 1 -1 5.49 11 0 -1 1 5.61 12 0 1 1 5.65 13 0 0 0 7.13 14 0 0 0 7.14 15 0 0 0 7.15 16 0 0 0 7.16 17 0 0 0 7.17
采用Design-Expert 12软件，对表2的试验数据进行回归拟合，得到回归方程：Y=7.15+0.34A+0.041B+0.10C-0.020AB-0.025AC-0.018BC-0.76A2-0.87B2-0.74C2（R2=0.999 7）。
2.2.2 回归模型的方差分析
对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance in regression model
注：*表示影响显著，P＜0.05；** 表示影响极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 9.89 9 1.10 3 108.62 ＜0.000 1 **A 0.91 1 0.91 2 577.27＜0.000 1 **B 0.014 1 0.014 38.50 0.000 4 **C 0.082 1 0.082 231.95 ＜0.000 1 **AB 1.600×10-3 1 1.600×10-3 4.53 0.071 0 AC 2.500×10-3 1 2.500×10-3 7.07 0.032 5 *BC 1.225×10-3 1 1.225×10-3 3.46 0.105 0 A2 2.41 1 2.41 6 810.67＜0.000 1 **B2 3.21 1 3.21 9 091.46＜0.000 1 **C2 2.33 1 2.33 6 587.39＜0.000 1 **残差 2.475×10-3 7 3.536×10-4失拟项 1.475×10-3 3 4.917×10-4 1.97 0.261 1 不显著纯误差 1.000×10-3 4 2.500×10-4总和 9.89 16 R2 0.999 7 R2Adj 0.999 4
由表3结果分析可知，该回归模型的P＜0.01，表明该模型极显著；失拟项P=0.261 1＞0.05，差异不显著，说明模型拟合度较好、可信度高；另外，模型的决定系数R2=0.999 7，说明模型拟合程度良好。R2Adj=0.999 4，说明模型能解释99.94% 响应值的变化，自变量和响应值间线性关系显著。综上所述，此模型可用于CMP提取工艺的优化。从显著性结果可知，A、B、C、A2、B2和 C2项极显著（P＜0.01），AC 项显著（P＜0.05），其它不显著（P＞0.05）。根据F值大小，各因素影响顺序为A＞C＞B。
2.2.3 响应面分析
经Desgin-Expert 12软件处理，得到各因素交互作用的响应面及等高线如图4所示。
图4 各因素交互作用的响应面与等高线
Fig.4 Response surface and contour maps of interaction of various factors
由图4可知，AB、BC响应面较不陡峭，弯曲程度不大，等高线椭圆度不大，说明AB、BC的交互作用不显著（P＞0.05）；而AC的曲面弯曲程度较大、较陡，等高线呈椭圆形，说明AC之间的交互作用显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。
2.2.4 最佳条件的预测及验证试验
通过模型的建立，预测CMP提取最佳工艺条件为超声波功率422.17 W、超声温度60.10℃、提取时间50.65 min，CMP提取率理论值为7.19% 。考虑到实际操作，将最佳工艺条件修正为超声波功率420 W、超声温度60℃、提取时间50 min，对此条件下建立的模型进行验证试验，重复3次，得到实际CMP提取率平均值为7.17% ，与预测值的相对误差为0.28% ，表明此模型可靠。
2.3 体外抗氧化活性测定结果
2.3.1 DPPH自由基清除能力
不同浓度CMP对DPPH自由基的清除能力如图5所示。
图5 不同浓度的CMP对DPPH自由基的清除能力
Fig.5 Scavenging ability of different concentrations of CMP to DPPH radical
由图5可知，CMP和VC的DPPH自由基清除率随质量浓度的增加而增强，并呈良好的量效关系，由此计算出，CMP对DPPH自由基的半数抑制浓度（IC50）为36.05 μg/mL。当CMP浓度为 100 μg/mL 时，DPPH自由基清除率为77.81% ，弱于同浓度的VC，说明其在适宜的质量浓度下，对DPPH自由基有较强的清除能力。
2.3.2 羟基自由基清除能力
不同浓度的CMP对羟基自由基的清除能力如图6所示。
图6 不同浓度的CMP对羟基自由基的清除能力
Fig.6 Scavenging ability of different concentrations of CMP to hydroxyl radical
由图6可知，CMP和VC的羟基自由基清除率随着质量浓度的增加而逐渐增强，并呈明显的量效关系[31]，由此计算出，CMP对羟基自由基的半数抑制浓度（IC50）为0.33 mg/mL。当CMP浓度为1.0 mg/mL时，羟基自由基清除率为81.28% ，比同浓度的VC略低，表明其在适宜的质量浓度下，具有较强的羟基自由基清除能力。
2.4 体外抗菌活性测定结果
不同质量浓度CMP抗菌活性结果如表4所示。
表4 不同质量浓度CMP抗菌活性结果
Table 4 Results of antibacterial activity of CMP in different mass concentrations
注：-表示无法测定抑菌圈直径（即无抑菌效果）。
质量浓度/（mg/mL） 抑菌圈直径/mm大肠杆菌 金黄色葡萄球菌6.4 19.84±0.18 18.63±0.26 3.2 17.63±0.11 16.12±0.18 1.6 15.12±0.23 13.89±0.27 0.8 12.37±0.17 9.86±0.31 0.4 9.49±0.12 -0.2 - -空白对照组 - -
由表4可知，CMP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，而空白对照组无抑菌圈出现。CMP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为0.4 mg/mL和0.8 mg/mL，且抑菌效果随着CMP质量浓度的增加不断增强。
3 结论
本文采用双频逆流聚能式超声波辅助提取CMP，通过单因素及响应面试验确定最佳提取工艺：超声波功率420 W、超声温度60℃、提取时间50 min，在此条件下CMP提取率为7.17% 。体外抗氧化试验表明，CMP对DPPH自由基和羟基自由基均具有较强的清除能力，并且对DPPH自由基、羟基自由基的半数抑制浓度（IC50）分别为 36.05 μg/mL 和 0.33 mg/mL。体外抗菌试验表明，CMP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌作用，且最低抑菌浓度分别为0.4 mg/mL和0.8 mg/mL。本试验可为CMP的提取及抗菌、抗氧化活性研究和产品进一步开发应用提供参考。
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