苦瓜（Momordica charantia L.）别名凉瓜、锦荔枝、癞瓜，为葫芦科一年生攀缘草本植物[1]，是一种具有苦味的蔬菜，在我国已有500年的栽培历史。现代药理研究表明，苦瓜中含有多种功能性成分，如皂苷、多糖、黄酮、酚类等物质，其中皂苷作为主要功能性物质和苦味主要来源成分，具有调节血糖、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药用价值[2-4]。优化苦瓜皂苷提取工艺，有利于指导苦瓜精深加工，开发以苦瓜皂苷为主要原料的健康食品。边会喜等[5]的研究发现苦瓜总皂苷最佳提取工艺条件为乙醇质量分数60% 、料液比1∶7（g/mL）、提取时间3 h，此时苦瓜皂苷粗制品的得率为2.37% 。董加宝等[6]的研究发现溶剂法结合大孔吸附树脂对纯化苦瓜皂苷有较好的效果。刘慧娟等[7]采用甲醇回流法提取13个苦瓜品种的苦瓜皂苷，发现不同品种苦瓜果肉中的皂苷总含量有明显差异。胡艺涵[8]将超声波辅助结合酶法应用于苦瓜汁粉的制备中，可以有效避免传统提取工艺中高温、氧化等对苦瓜功能性物质的破坏。α-葡萄糖苷酶（α-D-glucoside glucohydrolase）是控制血糖的一个关键酶，它可以切割多糖非还原端的α-葡萄糖苷键和低聚糖中的α-1，4-糖苷键，转化成α-D-葡萄糖和α-1，6-糖苷键，从而生成异麦芽糖、异麦芽三糖等功能性糖[9-10]。α-葡萄糖苷酶还可有效控制餐后血糖水平，对糖尿病的预防和治疗具有重要意义[11]。虽然已有苦瓜皂苷提取工艺的相关研究，但极少关于苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究，苦瓜皂苷提取工艺优化结合α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究鲜有报道。
本研究拟通过响应面法优化苦瓜中皂苷类化合物的提取工艺条件，选用对环境无残留的乙醇为溶剂，利用超声波辅助法提取苦瓜皂苷，同时研究苦瓜皂苷类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以期为皂苷工业化生产及苦瓜精深加工提供参考，对苦瓜保健食品的开发具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以江西省农业科学院蔬菜花卉研究所瓜类蔬菜研究室选育赣苦瓜4号果实为试验材料。人参皂苷Rg1（纯度98% ）：中国药品生物制品鉴定研究所；α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）：美国Sigma公司；对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，PNPG）：上海麦克林生化科技有限公司；阿卡波糖：上海源叶生物科技有限公司；磷酸缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）：北京索莱宝试剂有限公司；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、无水碳酸钠、正丁醇（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司。
1.2 仪器与设备
KQ5200E型超声波清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司；AUW120D电子天平：岛津仪器有限公司；TECAN infinite 200酶标仪：瑞士TECAN公司；6202型高速粉碎机：北京燕山正德机械设备有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器有限公司；LGJ-10N真空冷冻干燥机：北京亚星仪科科技发展有限公司；BCD-470WGHTD7ES9U1型冰箱：青岛海尔集团公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苦瓜皂苷的提取
苦瓜洗净后切片取籽，在真空冷冻干燥机中干燥42 h，粉碎机粉碎后过60目筛，备用。称取50.00 g苦瓜干粉，放入乙醇溶液，在一定温度下超声提取1.5 h，25℃、4 000 r/min离心10 min，过滤后收集滤液和滤渣，共提取3次，合并提取液过滤浓缩至原来体积的1/10，浓缩液用石油醚萃取3次，乙酸乙酯萃取3次，水饱和的正丁醇萃取3次。将得到的正丁醇相经减压浓缩至浸膏，用甲醇溶解后定容至100 mL烧瓶内，4℃保存备用[12]。
1.3.2 苦瓜皂苷提取率的测定
采用高氯酸-香草醛-冰醋酸法[13]测定皂苷含量，以人参皂苷Rg1为标准品。皂苷含量以每100 g苦瓜干重计算，表示为g/100 g DW，苦瓜皂苷提取率Y（% ）的计算公式如下。
式中：W1为苦瓜皂苷的质量，g；W0为苦瓜干重质量，g。
1.3.3 单因素试验
设置各因素变量分别为固液比[1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）]、乙醇浓度（50% 、60% 、70% 、80% 、90% ）、超声时间（30、60、90、120、150 min）和提取温度（40、50、60、70、80 ℃），考察固液比、乙醇浓度、超声时间、提取温度对苦瓜皂苷提取率的影响。每个处理重复3次。
1.3.4 响应面优化试验
根据单因素试验结果，以固液比（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）、提取温度（D）为试验因子，以苦瓜皂苷提取率（Y）为评价指标，利用响应面试验方法（response surface methodology，RSM）确定苦瓜皂苷提取的最优工艺组合。响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Variables and levels of RSM
水平因素A固液比/（g/mL）D提取温度/℃-1 1∶5 60 60 40 B乙醇浓度/% C超声时间/min 0 1∶15 80 90 60 1 1∶25 100 120 80
1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性
参照刘慧娟等[7]、Wu 等[14]的方法，取 20 μL 苦瓜皂苷甲醇溶液和阿卡波糖溶液用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）稀释至 200 μL，然后取 50 μL 和 25 μL 的0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶于96孔板中，37℃预孵育10 min。加入20 μL 10 mmol/L的 PNPG，37℃下孵育30 min，孵育结束后加入 20 μL、100 μL 的 0.2 mol/L Na2CO3溶液终止反应，405 nm下测吸光度。同时设置背景对照组、空白对照组，α-葡萄糖苷酶活性抑制率W（% ）的计算公式如下。
式中：A1为空白对照组的吸光度；A2为背景对照组的吸光度；A3为样品的吸光度。
1.4 数据分析
用 Microsoft Excel 2016、SPSS 16.0 和 Design-Expert 11.0软件进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
不同处理条件对苦瓜皂苷提取率的影响如图1所示。
图1 不同处理条件对苦瓜皂苷提取率的影响
Fig.1 Effects of different treatments on the extraction of saponin
A.固液比；B.乙醇浓度；C.超声时间；D.提取温度。不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
由图1A可知，在固液比为1 ∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）时，随着体积的增加，从细胞内到溶剂之间扩散的浓度梯度增大，苦瓜皂苷提取率也随之增大。当固液比为1∶15（g/mL）时，苦瓜皂苷提取率最高，为2.83% ；当固液比大于1∶15（g/mL）时，苦瓜皂苷提取率开始下降。这可能因为固液比过大时，溶剂的传质阻力增大，出现了提取不完全的情况。综合考虑溶剂用量、能源消耗等方面，选取最优固液比为1∶15（g/mL）。由图1B可知，在乙醇浓度为50%～70% 时，随着乙醇浓度的升高，苦瓜皂苷提取率逐渐升高，乙醇浓度为70% 时达到最大值，为2.78% ，而后随着乙醇浓度的增加，苦瓜皂苷提取率逐渐降低。由图1C可知，苦瓜皂苷提取率随超声时间的延长整体呈上升趋势。由图1D可知，苦瓜皂苷提取率随提取温度的升高呈先升高而后下降的趋势，当提取温度达到50℃时，苦瓜皂苷提取率最高，达到1.82% ，当继续提高提取温度时苦瓜皂苷提取率变化不明显。可能与提取温度过高，导致皂苷类成分的分解有关。
2.2 响应面优化试验结果
响应面试验设计与结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface experimental design and results
序号A/（g/mL）B/% C/minD/℃ 苦瓜皂苷提取率Y/% 1 1∶5 60 90 60 1.91 2 1∶25 60 90 60 2.09 3 1∶5 100 90 60 1.77 4 1∶25 100 90 60 1.79 5 1∶15 80 60 40 2.15 6 1∶15 80 120 40 2.13 7 1∶15 80 60 80 1.75 8 1∶15 80 120 80 1.68 9 1∶5 80 90 40 1.82 10 1∶25 80 90 40 2.02 11 1∶5 80 90 80 1.58 12 1∶25 80 90 80 1.65 13 1∶15 60 60 60 1.61 14 1∶15 100 60 60 1.62 15 1∶15 60 120 60 1.83 16 1∶15 100 120 60 1.69 17 1∶5 80 60 60 1.71 18 1∶25 80 60 60 1.69 19 1∶5 80 120 60 1.84 20 1∶25 80 120 60 1.87 21 1∶15 60 90 40 1.90 22 1∶15 100 90 40 1.86 23 1∶15 60 90 80 1.78 24 1∶15 100 90 80 1.67 25 1∶15 80 90 60 2.21 26 1∶15 80 90 60 2.12 27 1∶15 80 90 60 2.12 28 1∶15 80 90 60 2.11 29 1∶15 80 90 60 2.20
为考察各因素对苦瓜皂苷提取率的影响，以提取率为考核指标，通过Design-Expert 11.0软件进行二次响应面回归分析，得到多元二次响应回归模型：Y/% =4.66+0.052 5A-0.187 5B+0.107 5C-0.475 8D-0.095 2AB+0.04AC+0.0825AD-0.0275BC+0.001BD-0.08CD-0.534 9A2-0.069 49B2-0.617 4C2-0.447 4D2。
回归方程系数显著性检验表如表3所示。
表3 回归方程系数显著性检验表
Table 3 Test of significance for regression equation coefficients
注：**表示影响极显著，P＜0.01。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 9.13 14 0.652 1 4.60 0.003 6**A 0.033 1 1 0.033 1 0.233 3 0.636 6 B 0.421 9 1 0.421 9 2.98 0.106 5 C 0.138 7 1 0.138 7 0.978 1 0.339 5 D 2.72 1 2.72 19.16 0.000 6**AB 0.036 1 1 0.036 1 0.254 6 0.621 7 AC 0.0064 1 0.006 4 0.045 1 0.834 8 AD 0.027 2 1 0.027 2 0.192 0 0.667 9 BC 0.003 0 1 0.003 0 0.021 3 0.886 0 BD 0.000 4 1 0.000 4 0.002 8 0.958 4 CD 0.025 6 1 0.025 6 0.180 6 0.677 4 A2 1.86 1 1.86 13.09 0.002 8**B2 3.13 1 3.13 22.09 0.000 3**C2 2.47 1 2.47 17.44 0.000 9**D2 1.30 1 1.30 9.16 0.009 1**残差 1.99 14 0.141 8失拟项 1.77 10 0.117 2 0.577 0 0.781 1纯误差 0.812 7 4 0.203 2总离差 11.11 28
由表3可知，回归方程差异极显著（P＜0.01），失拟项具有不显著性（P=0.781 1＞0.05），说明方程对试验拟合较好。提取温度（D）对苦瓜皂苷提取率的影响极显著（P＜0.01）。根据F值的大小可以得出各因素对苦瓜皂苷提取率影响的顺序为提取温度（D）＞乙醇浓度（B）＞超声时间（C）＞固液比（A）。
各因素之间的交互作用对苦瓜皂苷提取率的影响效果如图2所示。
图2 因素之间的交互作用对皂苷提取率影响的响应曲面
Fig.2 Response surface plot for the effects of the interaction between factors on the extraction of saponin
影响苦瓜皂苷提取率的因素之间交互作用的关系图可以直观地反映出因素交互作用对提取率的影响。由图2可知，提取温度和乙醇浓度交互作用对皂苷提取率的影响较大，其坡面比较陡，呈上升趋势，达到峰值区间后，皂苷提取率逐渐下降。可能是由于随着提取时间的延长，苦瓜皂苷中不稳定的成分发生了降解。这与单因素试验中提取时间考察和方差分析中因素D影响最大相吻合。
根据上述回归模型，采用响应面试验得到的最优组合为固液比1∶15.25（g/mL）、乙醇浓度77.13% 、超声时间93.79 min、提取温度49.15℃。考虑到实际操作的局限性，将超声波辅助乙醇提取皂苷的提取工艺条件调整为固液比1∶15（g/mL）、乙醇浓度75% 、超声时间95 min、提取温度50℃，在此条件下苦瓜皂苷的提取率可达2.21% 。
2.3 苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
采用优化后的工艺条件对苦瓜皂苷进行提取，其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图3。
图3 苦瓜皂苷提取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用
Fig.3 Inhibitory effect of saponins extract of bitter gourd and acarbose on the activity of α-glucosidase
由图3可知，当苦瓜皂苷浓度在2mg/mL～10mg/mL时，α-葡萄糖苷酶的抑制率随皂苷浓度的增加而明显增加；当苦瓜皂苷浓度大于10 mg/mL时，抑制率无明显变化。阿卡波糖IC50值为5.15 mg/mL，苦瓜皂苷IC50值为5.48 mg/mL。综上，苦瓜皂苷具备α-葡萄糖苷酶抑制活性，阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用高于苦瓜皂苷。
3 讨论与结论
研究发现，苦瓜皂苷具有公认的类似胰岛素的降血糖特性[15-16]，其调控机制主要包括激活蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]的含量等[17]。Nagarani等[18]研究发现苦瓜皂苷能够明显降低正常小鼠和2型糖尿病小鼠餐后血糖。Hafizur等[19]发现苦瓜乙醇提取物明显改善了糖尿病大鼠的空腹血糖、血清胰岛素和β细胞功能。丁雷等[20]认为苦瓜可以通过改善胰岛β细胞功能、改善胰岛素抵抗、抑制肠道内葡萄糖的吸收及抗炎、抗氧化应激等多方面发挥降糖作用。基于上述研究，苦瓜皂苷具有较好的保健功效且提取工艺操作简单。
本文通过响应面试验优化苦瓜皂苷的最佳提取工艺，即固液比1∶15（g/mL）、乙醇浓度75% 、超声时间95 min、提取温度50℃，在此条件下苦瓜皂苷的提取率可达2.21% 。该工艺对环境无污染，工序简单，是具有应用前景的大规模提取苦瓜皂苷新方法。本文以阳性药阿卡波糖为对照，发现苦瓜皂苷具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，其IC50值为5.48 mg/mL。研究结果可为以苦瓜皂苷为主要功能性成分的健康食品的开发提供参考。
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