沙棘是一种落叶灌木，可以忍受干旱、沙质和盐碱环境等恶劣的生长条件，我国沙棘产量位于世界之首，沙棘籽粕的年产量达到1.5万t[1-2]。沙棘籽粕是沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后的副产物，含有丰富的多酚、黄酮、多糖、维生素等活性物质[3]，其加工利用率很低，大都被直接丢弃。植物多酚是植物体中相对分子质量在500～3 000范围内的具有多元酚羟基的复杂次生代谢产物[4]，具有良好的降血压、降血脂、保护心血管系统、保护肝脏等功效[5]，还具有良好的抗菌、抗肿瘤、抑制α-葡萄糖苷酶活性、抗衰老和缓解痉挛等作用[6-7]。沙棘叶、果实和籽粕中均富含多酚，其中沙棘结合酚能有效抑制偶氮二异庚腈（2，2-azobis-2，4-dimethylvaleronitrile）和抗坏血酸铁盐诱导的脂质过氧化反应的进行[8-9]。
多酚主要以游离态和结合态两种形式存在。植物中的游离酚，通常以单体形式存在，易于提取；而结合态多酚多是以糖苷键、酯键、醚苷键与纤维素、木质素、蛋白质等相结合的不可溶性多酚，无法用有机溶剂直接提取，因此常采取一定预处理方式，促进多酚的提取并提高其利用价值。目前，常利用低共熔溶剂[10]、微生物发酵[11]和超声波辅助提取[12]沙棘籽粕多酚，但存在成本高、周期长和提取率有限等问题。
蒸汽爆破（steam explosion，SE）作为新兴技术，是近年来用于食品预处理的一种物理方法[13]。爆破装置主要由高压容器、蒸汽发生器、物料罐、接收器和球阀组成。相对于化学处理或酶处理提取方法，蒸汽爆破同时以高温高压作用于原料，材料的孔隙中充满蒸汽，导致纤维素、半纤维素和木质素降解，材料的紧密结构被破坏[14-15]。蒸汽爆破的过程机理示意图如图1所示。
图1 蒸汽爆破过程机理
Fig.1 Mechanism of steam explosion
当高压瞬间释放时，孔隙中的过热蒸汽会迅速气化，饱和水蒸气和高温液态水同时作用于物料，产生多次剪切力，体积急剧膨胀，细胞壁破裂成多孔状，低分子量物质从细胞内部释放出来[16]。爆破处理的过程涉及多种机制：酸水解、热降解、类机械破坏、氢键断裂和结构重排[17]。在食品工业中，蒸汽爆破主要用于大分子的修饰。Zhang等[18]研究了蒸汽爆破处理对豆粕蛋白质结构特征和理化性质的影响。Li等[19]研究发现蒸汽爆破有效促进了酚类物质的溶解，释放苦荞麸皮的酚类物质。
本研究通过采用蒸汽爆破对沙棘籽粕进行预处理，分析不同爆破条件下沙棘籽粕活性物质变化，通过爆破预处理提高多酚生物活性，分析爆破前后多酚提取率、组成变化，采用扫描电镜分析蒸汽爆破对沙棘籽粕微观结构的影响，并对游离酚和结合酚进行抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制能力测定，为制备沙棘籽粕多酚提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘籽粕：内蒙古宇航人高技术产业有限责任公司；福林酚、α-葡萄糖苷酶（1 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸、甲醇（色谱级）、乙酸（色谱级）、石油醚（30℃～60℃）、无水碳酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：天津索罗门生物科技有限公司；没食子酸、儿茶素、芥子酸、阿魏酸、7-羟基香豆素、异鼠李素：上海源叶生物科技有限公司；阿福豆苷：阿拉丁试剂（上海）有限公司；4-羟基肉桂酸：上海笛柏生物科技有限公司。除特别说明外，所有化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
JP-031超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；XL-04B摇摆式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；FE28-CN酸度计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DF-101型系列集热式恒温加热磁力搅拌器：上海亚泰仪表有限公司；PX423ZH电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；3-18台式高速冷冻离心机：四川蜀科仪器有限公司；JSM-IT300LV扫描电子显微镜：日本电子株式会社。
1.3 方法
1.3.1 沙棘籽粕蒸汽爆破处理
沙棘籽粕过80目筛，去除尘土等微小杂质，用2% 亚硫酸铵浸泡过夜，分别在爆破条件0.9 MPa、30 s，1.4 MPa、60 s，2.0 MPa、90 s，2.0 MPa、180 s 下进行处理。爆破产物置于烘箱35℃干燥24 h后粉碎，过60目筛，以料液比1∶10（g/mL）用石油醚进行脱脂，每2 h抽滤更换石油醚，直至滤液澄清，将脱脂后的滤渣置于通风橱，待石油醚挥发完全后，置于烘箱干燥，所得脱脂粉末置于干燥处密封保存。
1.3.2 不同爆破条件处理前后沙棘籽粕营养成分测定
水分含量根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定；蛋白质含量用凯氏定氮仪测定；根据GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》测定粗纤维含量；采用AlCl3比色法[20]测定黄酮含量；采用苯酚硫酸法[21]测定多糖含量。
1.3.3 微观结构表征
利用扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）对爆破前后沙棘籽粕微观结构进行表征，将干燥好的沙棘籽粕粉末固定在样品座上，镀铂金膜后，在SEM下放大500倍和1 000倍观察样品的形态特征并拍照。
1.3.4 多酚提取
多酚提取方法参照孔宇等[22]的方法略作修改。1 g样品加入25 mL 80% 甲醇溶液，超声20 min，超声频率40 kHz，超声功率 150 W，提取温度 20℃，4 000×g离心10 min，收集上清液，装入棕色试剂瓶中，于4℃冷藏备用。
游离酚提取：1 g样品加入10 mL甲醇，磁力搅拌40 min，4 000×g 离心 10 min，收集上清液，残渣再重复提取2次，合并上清液，装入棕色试剂瓶中，于4℃冷藏备用。
结合酚提取：上述提取游离态多酚后的残渣加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，避光放置24 h后，用浓盐酸调整混合物pH值至7，4 000×g离心10 min，收集上清液，向其中加入3倍体积的95% 乙醇溶液，置于4℃静置12 h，4 000×g离心10 min除去沉淀的糖和蛋白质，装入棕色试剂瓶中，于4℃冷藏备用。
1.3.5 多酚含量测定
参照王晓艺等[23]的方法略作修改。准确吸取没食子酸标准储备液 0、0.2、0.4、0.6、1.0，1.5 mL 分别置于10 mL容量瓶中，用60% 乙醇溶液定容，得到没食子酸工作液，配制成浓度为 0、4、8、12、20、30 mg/L 的标准系列。然后分别移取没食子酸工作液1.0 mL于10 mL比色管中，加入2.5mL福林酚试剂，摇匀，加入2.5mL15% Na2CO3溶液，加水定容至刻度，摇匀，置于40℃水浴60 min后，取出静置冷却20 min。于778 nm处测定其吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=14.254x-0.008，R2=0.998 4。
样品溶液的测定：吸取1.0 mL滤液于10 mL比色管中，依次加入上述溶液，并在相同条件下测定吸光度。根据标准曲线的回归方程计算待测样品中多酚含量，计算公式如下。
式中：C为在标准曲线上多酚溶液吸光度所对应的没食子酸浓度，mg/mL；V为沙棘籽粕多酚提取总体积，mL；N为多酚溶液稀释倍数；m为样品质量，g。
1.3.6 多酚活性测定
1.3.6.1 DPPH自由基清除能力测定
参照Brand-Williams等[24]的方法并略作修改。取2 mL沙棘籽粕多酚溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，即为样品组；取2 mL沙棘籽粕多酚溶液，加入2 mL无水乙醇溶液，即为样品空白对照组；取2 mL无水乙醇溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，即为空白对照组，摇匀避光静置30 min，以无水乙醇作为空白调零，在517 nm处测吸光度。DPPH自由基清除率计算公式如下。
式中：A0为空白对照组吸光度；A1为样品组吸光度；A2为样品空白对照组吸光度。
1.3.6.2 α-葡萄糖苷酶抑制率的测定
参照Tian等[25]的方法并略作修改。采用对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，P-NPG）为底物的酶抑制剂筛选模型，以4-硝基苯酚的生成量测定α-葡萄糖苷酶的活性。分别测定爆破前后游离酚和结合酚α-葡萄糖苷酶抑制活性，及其通过10 kDa超滤膜后α-葡萄糖苷酶抑制活性的变化，具体方法如下。
空白组：缓冲液 170 μL，0.5 mmol/L 底物 30 μL。
对照组：缓冲液 140 μL，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）10μL，0.36U/mL（0.06U/mL）酶 20μL，0.5 mmol/L 底物 30 μL。
化合物空白组：缓冲液 160 μL，待测化合物 10 μL，0.5 mmol/L 底物 30 μL。
试验组：缓冲液 140 μL，待测化合物 10 μL，0.36 U/mL（0.06 U/mL）α-葡萄糖苷酶 20 μL，0.5 mmol/L底物30 μL。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下。
式中：OD4为试验组吸光度；OD3为化合物空白组吸光度；OD2为对照组吸光度；OD1为空白组的吸光度。
1.3.7 多酚定性定量分析
制作混合标准曲线（芥子酸、没食子酸、阿魏酸、芦丁、儿茶素、原儿茶素、异鼠李素、阿福豆苷、杨梅素、槲皮素、山奈酚和4-羟基肉桂酸等）。用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）对沙棘籽粕爆破前后游离酚和结合酚进行定性定量分析。色谱柱：Venusil MP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 m）；流速：0.8 mL/min；柱温：40℃；检测波长：280 nm；进样量：20 μL；流动相：0.1% 甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～4 min，15%～22% B；4 min～12 min，26%～30% B；12 min～16 min，26%～30% B；16 min～20 min，30%～60% B；20 min～23 min，60%～67% B；23 min～32 min，67%～72% B；32 min～40 min，72%～76% B；40 min～46 min，85%～70% B；46 min～50 min，85%～70% B；50 min～55 min，70%～50% B；55 min～58 min，50%～25% B；58 min～60 min，25%～5% B。
1.4 数据分析
每组试验设置3个平行试验，结果用平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel 2019进行数据统计整理，采用Origin 2019进行图像处理。
2 结果与分析
2.1 不同爆破条件处理前后沙棘籽粕化学成分变化
不同爆破条件处理前后沙棘籽粕化学成分变化见表1。
表1 沙棘籽粕的化学成分
Table 1 Chemical composition of seabuckthorn seed meal %
注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05。
组别 水分 多酚 黄酮 游离酚 结合酚 可溶性总糖 蛋白质 纤维素沙棘籽粕 5.42±0.40e 6.51±0.03d 0.54±0.01c 5.53±0.03c 2.97±0.17a 7.42±0.35c 28.65±0.95a 9.75±0.35a SE 0.9 MPa、30 s 20.58±0.26b 6.57±0.02c 0.58±0.06b 5.59±0.03c 2.89±0.26b 6.22±0.44d 28.81±0.81a 8.34±0.44b SE 1.4 MPa、60 s 22.03±0.17a 6.63±0.02b 0.59±0.06b 5.87±0.02b 2.21±0.26d 9.17±0.44b 26.83±0.61b 7.36±0.40c SE 2.0 MPa、90 s 17.50±0.26d 7.62±0.01a 0.68±0.10a 6.22±0.06a 1.81±0.10e 16.00±0.36a 25.11±0.13c 6.36±0.36e SE 2.0 MPa、180 s 19.36±0.20c 5.08±0.01e 0.41±0.04d 4.01±0.26d 2.32±0.45c 7.43±0.46c 23.89±2.01d 6.83±0.29d
由表1可知，蒸汽爆破条件对多酚和黄酮的含量有明显影响，随着爆破压力和时间的提高，多酚和黄酮含量呈现先增加后减小趋势。当爆破条件为2.0 MPa、90 s时，多酚和黄酮含量最高，分别为7.62% 和0.68% 。蒸汽爆破后结合酚含量显著降低，而游离酚含量明显提高，这是由于沙棘籽粕经蒸汽爆破后，纤维素降解，糖苷键、酯键断裂，致使其中结合酚的释放。Cheng等[26]研究发现，红豆在爆破条件0.75 MPa、90 s时游离酚含量显著提高，而结合酚含量下降，是由于高温高压条件下，结合酚转变为游离酚。相似结论在Li等[27]和Ti等[28]的研究中也被证实。当爆破压力和时间过高时，酚类物质发生降解或聚合[29-30]，并且导致原料发生美拉德褐变或碳化[31]，因此选择蒸汽爆破条件为2.0 MPa、90 s的沙棘籽粕进行后续试验。
2.2 蒸汽爆破处理前后沙棘籽粕微观结构的变化
蒸汽爆破前后沙棘籽粕500和1 000放大倍数的扫描电镜图见图2。
图2 沙棘籽粕扫描电镜图
Fig.2 SEM of seabuckthorn seed meal
A.未爆破处理沙棘籽粕500倍扫描电镜；B.2.0 MPa、90 s爆破处理沙棘籽粕500倍扫描电镜；C.未爆破处理沙棘籽粕1 000倍扫描电镜；D.2.0 MPa、90 s爆破处理沙棘籽粕1 000倍扫描电镜。
由图2可知，未爆破组（图2A、图2C）表面平坦且光滑，组织结构紧密；而经蒸汽爆破处理后沙棘籽粕结构塌陷错位，含有大量破碎细胞物质（图2B），表面出现特征性孔洞（图2D）。这是由于蒸汽瞬间释放时产生多次剪切力，使纤维素降解[32]，这也从微观结构反映了孔隙率、总孔体积和平均孔径的提高是爆破后活性物质易于提取的主要原因。
2.3 蒸汽爆破处理对沙棘籽粕多酚抗氧化活性的影响
蒸汽爆破前后沙棘籽粕多酚对DPPH自由基清除能力结果见图3。
图3 爆破前后沙棘籽粕多酚DPPH自由基清除能力
Fig.3 DPPH-scavenging ability of polyphenols from seabuckthorn seed meal before and after SE
由图3可知，蒸汽爆破处理后沙棘籽粕DPPH自由基清除率明显提高，未爆破游离酚清除DPPH自由基的IC50值为1.17 mg/mL，而爆破后游离酚的IC50值明显降低，为0.66 mg/mL，表明爆破处理后沙棘籽粕对DPPH自由基的清除能力明显提高；未爆破和爆破后的结合酚清除DPPH自由基的IC50值分别为9.68 mg/mL和4.25 mg/mL。张瑞婷[33]和Chen等[34]研究也表明，爆破后麦麸对DPPH自由基的清除能力优于未爆破组。游离酚对DPPH自由基的清除能力明显高于结合酚，这是由于抗氧化能力受多酚结合方式影响[35]，谭敏华等[36]的研究也发现相似现象。
2.4 蒸汽爆破处理对沙棘籽粕多酚α-葡萄糖苷酶抑制能力的影响
蒸汽爆破前后沙棘籽粕多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用见图4。
图4 爆破前后沙棘籽粕多酚α-葡萄糖苷酶抑制率
Fig.4 α-Glucosidase-inhibiting rate of polyphenols from seabuckthorn seed meal before and after SE
由图4可知，爆破后游离酚和结合酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值分别为0.84 mg/mL和2.51 mg/mL，明显低于未爆破组游离酚（IC50=4.33 mg/mL）和结合酚（IC50=5.37 mg/mL）。表明爆破可以明显提高沙棘籽粕多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。游离酚对α-葡萄糖苷酶的抑制能力大于结合酚，这可能是由于不同结构的多酚，其与酶的结合部位和结合的方式不同[37]。此外Yuk等[38]研究表明，羟基位置与个数影响多酚对α-葡萄糖苷酶的活性抑制，而游离酚中含有较多的羟基基团。本试验结果表明，游离酚、结合酚分别通过10 kDa的超滤离心管后，各组分对α-葡萄糖苷酶的抑制能力均明显下降，这可能是由于膜处理损失了部分活性物质。
2.5 蒸汽爆破前后沙棘籽粕多酚HPLC分析
通过HPLC对沙棘中多酚物质进行定性定量，结果如图5和表2所示。
图5 爆破前后沙棘籽粕多酚HPLC图谱
Fig.5 HPLC profile of polyphenols from seabuckthorn seed meal before and after SE
A.原料游离酚；B.爆破游离酚；C.原料结合酚；D.爆破结合酚。1.没食子酸；2.阿魏酸；3.芥子酸；4.儿茶素；5.异鼠李素；6.阿福豆苷；7.4-羟基肉桂酸。
表2 沙棘籽粕多酚组成及含量
Table 2 Composition and content of polyphenols in seabuckthorn seed meal mg/g
注：-表示未检出。
样品 没食子酸 芥子酸 儿茶素 7-羟基香豆素 阿福豆苷 异鼠李素 4-羟基肉桂酸原料游离酚 2.55±0.02 0.57±0.01 3.23±0.04 1.02±0.01 0.39±0.01 1.57±0.07 0.43±0.03爆破游离酚 1.00±0.07 0.73±0.02 0.63±0.02 0.45±0.01 0.17±0.01 0.36±0.03 0.40±0.02原料结合酚 0.28±0.01 - 0.07±0.01 0.02±0.01 0.05±0.01 - -爆破结合酚 0.09±0.01 - 0.12±0.01 0.17±0.01 0.16±0.01 - -
由图5可知，原料中游离酚种类丰富，结合酚种类较少。未经爆破的游离多酚共检出7种物质，保留时间与标准品溶液的色谱峰保留时间一致，分别为没食子酸、阿魏酸、芥子酸、儿茶素、异鼠李素、阿福豆苷和4-羟基肉桂酸。爆破后游离酚有一明显增加的物质，保留时间为5.905 min。由表2可知，蒸汽爆破后沙棘籽粕游离酚和结合酚的含量变化明显，游离酚提取物中芥子酸含量为未爆破组1.3倍，结合酚提取物中儿茶素、7-羟基香豆素和阿福豆苷含量分别为未爆破组的1.7倍、8.5倍和3.2倍。这可能是由于爆破引起酚之间相互作用，一些具有酯化、糖苷和不溶性结合形式的酚被水解成游离形式。游离酚提取物中没食子酸、儿茶素、异鼠李素含量分别减少了60.78% 、80.50% 和77.07% ，Volf等[39]研究表明，随着温度的升高多酚的稳定性逐渐降低，葡萄籽中的儿茶素在60℃时的降解率约为13% ，在100℃时为25% ，而没食子酸在60℃时的降解率约为12% ，在100℃时为20% 。此外爆破可导致羧基和酚羟基含量的增加，并促进其进一步转化为其他化合物。
3 结论
本研究探究不同爆破压力和时间对多酚含量的影响，确定多酚提取最优爆破条件为2.0 MPa、90 s，多酚含量为7.62% ；对沙棘籽粕爆破前后多酚进行定性和定量分析，爆破前后多酚种类未发生变化，主要为没食子酸、儿茶素和阿福豆苷，爆破后含量变化较大，游离酚提取物中芥子酸含量为未爆破组的1.3倍，结合酚提取物中儿茶素、7-羟基香豆素和阿福豆苷分别为未爆破组的1.7倍、8.5倍和3.2倍；抗氧化试验结果表明，爆破后游离酚和结合酚抗氧化能力明显提高，清除DPPH自由基的IC50值分别为0.66 mg/mL和4.25 mg/mL，是一种很好的天然抗氧化活性物质；α-葡萄糖苷酶抑制率试验结果表明，爆破后游离酚和结合酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显提高，IC50值分别为0.84 mg/mL和2.51 mg/mL，具有开发降血糖食品和药物的发展前景；扫描电镜结果显示，蒸汽爆破明显改变了沙棘籽粕表面结构，增大了孔隙率和平均孔径。综上所述，蒸汽爆破对沙棘籽粕多酚提取率和生物活性改善具有较好的效果，可为沙棘籽粕多酚综合利用提供一定参考。
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