树莓（Rraspberry）是蔷薇科（Rasaceae）悬钩子属（Rubus）植物，在欧美国家广泛栽培，国内部分地区均有野生树莓存在。树莓是一种营养价值极高的灌木水果，富含多种维生素和矿物质元素，尤其富含鞣花酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多糖等活性物质，具有一定的保健功效[1]。
研究发现，多糖是一种典型的多羟基醛酮类高分子物质，具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、防辐射、调节机体免疫力、降糖降脂等多种生理活性[2-4]。多糖的常见提取方法有超声波辅助提取、溶剂提取、酶法提取等[5]，其中，酶法提取因条件温和、用时短、干扰少等，广泛用于各种植物多糖的提取[6]。纤维素酶为糖苷水解酶，是常见用于降解植物细胞壁中的纤维素用酶之一[7]。目前，对树莓多糖（raspberry pulp polysaccharides，RPP）的研究主要集中在工艺提取以及抗衰老、降血糖、抗氧化和降血脂的功效研究，如分别运用热水法、复合酶法提取树莓多糖[8-9]。此外，有研究分别对树莓多糖进行了降血脂、抗衰老、降血糖与抗氧化活性的研究[2，10-11]，杨永晶等[12]利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）研究了树莓多糖的单糖组成。而利用纤维素酶提取树莓多糖，并进行抗疲劳效果研究鲜见报道。
本研究以树莓果肉为原料，选择纤维素酶为实验用酶，多糖得率为评价指标，通过Plackett-Burman设计进行显著因子筛选，再结合响应面法优化树莓果肉多糖的提取工艺，并进行抗运动疲劳研究，为进一步研究树莓多糖的生物活性功效提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
树莓：市售；SPF级雄性KM小鼠[40只，体重（18±2）g，批号 SCXK（豫）2020-0002]：洛阳普万泰生物技术有限公司。
血尿素氮、血乳酸、肝糖原、肌糖原试剂盒：南京建成生物工程研究所；纤维素酶（酶活力2万U/g）：广西南宁庞博生物科技有限公司；葡萄糖标准品（分析纯）：上海柏楚仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
DI-05高速组织捣碎匀浆机：常州市环宇科学仪器厂；U-S1050分光光度计：上海赫耳普有限公司；SHZA水浴振荡器：江苏新春兰科学仪器有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机：济南千司生物技术有限公司；FD-101S真空冷冻干燥机：深圳明华仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 树莓果肉多糖的提取
参考孔璐等[13]的方法进行树莓果肉多糖的提取。
1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制
采用硫酸-苯酚法测定树莓果肉多糖[14]。配制浓度为0.1 mg/mL葡萄糖溶液，分别吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL葡萄糖标准溶液，并加蒸馏水至1 mL，各加入5% 苯酚溶液1.6 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸7 mL，摇匀，置于40℃水浴18 min，取出后迅速冷却至室温（25℃），在490 nm波长下测定吸光度A，以蒸馏水为空白，重复上述操作。
1.3.3 树莓果肉多糖得率计算
按照于泽源等[9]苯酚-浓硫酸法进行树莓果肉多糖得率计算。
1.3.4 树莓果肉多糖提取单因素试验
以纤维素酶作为酶解树莓果肉用酶，研究pH值（3、4、5、6、7）、酶解温度（30、35、40、45、50、55 ℃）、加酶量（0.2% 、0.4% 、0.6% 、0.8% 、1.0% ）、料液比[1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]、酶解时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对树莓果肉多糖得率的影响。
1.3.5 主因素筛选实验设计
在单因素试验基础上，以多糖得率为纤维素酶酶解制备树莓果肉多糖的响应值，对影响树莓果肉多糖得率的因素进行Plackett-Burman主因素试验筛选。因素与水平见表1。
表1 Plackett-Burman试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments
水平因素A料液比/（g/mL）时间/h D pH值 E加酶量/% -1 1∶15 40 1.0 4 0.6 B酶解温度/℃C酶解1 1∶25 50 2.0 6 1.0
1.3.6 响应面试验设计
根据1.3.5主因素筛选试验结果，选取酶解温度（A）、酶解时间（B）、加酶量（C）为自变量，以多糖得率为响应值，运用响应面法，进行三因素三水平响应面试验。因素与水平见表2。
表2 响应面因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface methoddogy
水平 A酶解温度/℃ B酶解时间/h C加酶量/% -1 40 1.0 0.6 0 45 1.5 0.8 1 50 2.0 1.0
1.3.7 实验动物分组
参照刘雅娜等[15]的方法略作修改。将树莓果肉多糖质量浓度按低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（300 mg/kg）剂量进行分组，选取40只雄性小鼠，其他操作步骤同文献。
1.3.8 小鼠血清尿素氮含量、血乳酸含量的测定
参照试剂盒说明方法进行测定。
1.3.9 肝糖原与肌糖原的测定
参照试剂盒说明方法进行测定。
1.3.10 数据处理
利用Origin9.0软件、SPSS 22.0.0软件、Design-Expert V 12.0软件分别进行作图、统计分析和响应面分析。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线测定
以质量浓度为横坐标，A490为纵坐标，制作标准曲线，如图1所示。
图1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 Glucose standard curve
由图1可知，葡萄糖标准溶液浓度与A490之间的线性回归方程为y=5.126 5x+0.110 5（R2=0.999 1）。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对树莓果肉多糖得率的影响
料液比对树莓果肉多糖得率的影响如图2所示。
图2 料液比对树莓果肉多糖得率的影响
Fig.2 Effect of material liquid ratio on the yield of raspberry pulp polysaccharide
由图2可知，随着溶剂用量的增加，树莓果肉多糖的得率逐渐增大，在料液比为1∶20（g/mL）时，多糖得率较大，为2.35% ，此后随着溶剂用量的增加，多糖得率逐渐趋于平缓。从时间和能耗成本考虑，选择料液比为1∶15和1∶25（g/mL）进行后续试验。
2.2.2 酶解温度对树莓果肉多糖得率的影响
酶解温度对树莓果肉多糖得率的影响如图3所示。
图3 酶解温度对树莓果肉多糖得率的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of raspberry pulp polysaccharide
由图3可知，酶解温度在30℃～45℃，树莓果肉多糖得率与温度的升高表现为正相关关系，在酶解温度为45℃时，树莓果肉多糖得率最大，为2.47% ，之后随着温度的升高，多糖得率不升反降，这可能是升高的温度超过了纤维素酶的最适温度，导致酶失活所致[13]。因此酶解温度选择40℃～50℃进行后续试验。
2.2.3 酶解时间对树莓果肉多糖得率的影响
酶解时间对树莓果肉多糖得率的影响如图4所示。
图4 酶解时间对树莓果肉多糖得率的影响
Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of raspberry pulp polysaccharide
由图4可知，随着酶解时间的延长，树莓果肉多糖得率呈现先增后逐渐下降趋势，在酶解时间达到1.5 h时，树莓果肉多糖得率较高，为2.22% ，在酶解时间为2.0 h时，多糖得率为2.21% ，与酶解1.5 h相差较小，从时间效率看，酶解时间短，有利于节约时间成本，因此选择酶解时间1.0 h～2.0 h进行后续试验。
2.2.4 pH值对树莓果肉多糖得率的影响
pH值对树莓果肉多糖得率的影响如图5所示。
图5 pH值对树莓果肉多糖得率的影响
Fig.5 Effect of pH on on the yield of raspberry pulp polysaccharide
由图5可知，在pH3～5之间，随着pH值的增大，树莓果肉多糖得率逐渐增大，在pH5时，多糖得率最大，为2.38% 。此后在pH5～7之间，树莓果肉多糖得率逐渐降低。pH5为纤维素酶的最适宜pH值，在此条件下，纤维素酶的酶活力较高，酶解树莓细胞壁的能力强，使多糖得率较高，当超过酶最适pH值，酶活性降低，多糖得率下降。选择pH值范围4～6进行后续试验。
2.2.5 加酶量对树莓果肉多糖得率的影响
纤维素酶不同加酶量对树莓果肉多糖得率的影响，结果如图6所示。
图6 加酶量对树莓果肉多糖得率的影响
Fig.6 Effect of enzyme amount on polysaccharide yield of raspberry pulp
由图6可以看出，加酶量从0.2% 提高到0.8% ，树莓果肉多糖得率也逐渐增加，在加酶量达到0.8% 时，多糖得率达到最大，为2.47% 。此后继续增大加酶量，树莓果肉多糖得率增加不明显，并趋于平缓，这可能是由于树莓底物经过酶完全酶解作用后，没有多余底物可供纤维素酶酶解，继续增大加酶量，树莓果肉多糖得率增加不明显，加酶量的增加也会增大成本。因此，选择加酶量为0.6%～1.0% 进行后续试验。
2.3 主因素筛选分析
基于单因素试验结果，以多糖得率为筛选试验评价指标，选择酶解温度、pH值、酶解时间、料液比和加酶量5个因素的高水平和低水平进行Plackett-Burman试验主效应分析，试验结果见表3、表4。
表3 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 3 Plackett-Burman experimental design and results
序号 A料液比/（g/mL）B酶解温度/℃C酶解时间/h D pH值 E加酶量/% 多糖得率/% 1 1∶25 40 2.0 6 1.0 1.95 2 1∶25 50 1.0 6 1.0 1.88 3 1∶25 40 1.0 4 1.0 1.56 4 1∶25 40 2.0 6 0.6 2.55 5 1∶15 50 1.0 6 1.0 1.78 6 1∶25 50 2.0 4 0.6 2.55 7 1∶15 40 1.0 4 0.6 2.05 8 1∶15 50 2.0 4 1.0 2.15 9 1∶15 50 2.0 6 0.6 2.56 10 1∶25 50 1.0 4 0.6 2.55 11 1∶15 40 2.0 4 1.0 1.89 12 1∶15 40 1.0 6 0.6 2.05
表4 试验设计回归分析
Table 4 Experimental design regression analysis
注：**表示差异极显著，P＜0.01。
来源 系数估计误差 R2 R2Adj F值 P值 显著性A料液比 0.046 7 0.106 5 0.948 8 0.906 1 2.31 0.179 7 B酶解温度标准0.118 3 14.83 0.008 5 **C酶解时间0.148 3 23.3 0.002 9 **D pH值 0.001 7 0.002 9 0.958 5 E加酶量 -0.258 3 70.66 0.000 2 **
由表4可知，R2Adj=0.906 1，表明在树莓果肉多糖提取工艺主因素筛选试验上，90.61% 的变异分布在5个因子中，其总变异中仅有9.39% 不能用该模型来解释。由F值可知，5个因素对树莓果肉多糖得率的影响大小分别为 E＞C＞B＞A＞D，其中加酶量、酶解时间、酶解温度对树莓果肉多糖得率的影响极显著（P＜0.01），料液比和pH值影响不显著（P＞0.05）。因此，选择酶解温度、酶解时间、加酶量进行后续响应面分析。对于料液比和pH值等非显著性因素，选择固定pH5、料液比1∶20（g/mL）进行后续试验。
2.4 响应面分析
2.4.1 响应面结果分析
以酶解时间、酶解温度和加酶量为自变量，以多糖得率为响应值，进行三因素三水平响应面试验设计，结果见表5，方差显著性分析见表6。
表5 响应面试验结果
Table 5 Results of response surface test
试验号 A酶解温度 B酶解时间 C加酶量 多糖得率/% 实测值 预测值1 -1 0 -1 1.56 1.64 2 -1 -1 0 2.25 2.22 3 0 0 0 2.65 2.70 4 0 0 0 2.66 2.70 5 0 0 0 2.58 2.70 6 0 -1 1 2.23 2.26 7 1 1 0 1.68 1.71 8 0 1 -1 1.77 1.74 9 0 0 0 2.85 2.70 10 1 -1 0 1.88 1.93 11 1 0 1 1.72 1.64 12 1 0 -1 1.66 1.66 13 -1 1 0 2.15 2.10 14 -1 0 1 2.35 2.35 15 0 -1 -1 1.89 1.84 16 0 0 0 2.75 2.70 17 0 1 1 1.95 2.0
表6 回归分析结果
Table 6 Results of regression analysis
注：** 表示影响极显著，P＜0.01；* 表示影响显著，P＜0.05。
方差来源 均方差 自由度 平方和 F值 P值 显著性回归模型 2.85 9 0.316 7 31.51 ＜0.000 1 **A酶解温度 0.234 6 1 0.234 6 23.34 0.001 9 **B酶解时间 0.061 2 1 0.061 2 6.09 0.042 9 *C加酶量 0.2415 1 0.2415 24.75 0.001 6 **AB 0.002 5 1 0.002 5 0.248 7 0.033 *AC 0.133 2 1 0.133 2 13.26 0.008 3 **BC 0.006 4 1 0.006 4 0.636 8 0.451 1 A2 0.752 5 1 0.752 5 74.87 ＜0.000 1 **B2 0.342 6 1 0.342 6 34.09 0.000 6 **C2 0.863 1 1 0.863 1 85.87 ＜0.000 1 **残差 0.070 4 7 0.010 1失拟项 0.026 9 3 0.009 0.824 1 0.545 0纯误差 0.043 5 4 0.010 9总和 2.92 16
利用Design-Expert V 12.0软件对表5数据进行方差和显著性分析，得到纤维素酶提取树莓果肉多糖得率的二次多项式回归方程为Y=2.7-0.17A-0.087B+0.17C-0.025AB-0.18AC-0.04BC-0.42A2-0.29B2-0.45C2。
由表6可知，树莓果肉多糖响应面模型的复相关系数R2=0.975 9，校正系数RAdj2=0.944 9，模型的失拟项P值=0.545 0＞0.05不显著，说明实测值与拟合值拟合程度较好。模型P＜0.000 1，说明该回归方程模型达极显著水平。因此，用此模型可以较好预测和分析纤维素酶酶解树莓果肉提取多糖得率的工艺。
由表6中F值可知，3个因素对树莓果肉多糖得率影响强弱顺序为加酶量＞酶解温度＞酶解时间。模型的一次项A和C，交互项AC以及二次项A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），一次项B和交互项AB差异显著（P＜0.05）。
2.4.2 各因素交互作用的响应面分析
响应面三维图在等高线图上的形状，反映两因素的交互作用强弱影响，椭圆形表示两者交互作用显著，圆形表示两交互作用不显著[16-17]。利用Design-Expert V 12.0软件对酶解时间、酶解温度和加酶量进行交互作用响应面分析，结果如图7～图9所示。
图7 酶解温度与酶解时间交互作用的响应面和等高线
Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction between temperature and enzymolysis time
图8 酶解温度与加酶量交互作用的响应面和等高线
Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction between temperature and enzyme dosage
图9 酶解时间与加酶量交互作用的响应面和等高线
Fig.9 Response surface and contour plots of the interaction between enzymolysis time and enzyme dosage
由图7～图9可知，3个因素之间的交互作用响应面三维图呈凸形状，说明在酶解温度、酶解时间、加酶量最适条件下，利用纤维素酶酶解树莓果肉多糖的得率存在极大值点。
根据图7～图9可知，A（酶解温度）与C（加酶量），A（酶解温度）与B（酶解时间）的交互作用的等高线图为椭圆形，表明A与C，A与B之间交互作用显著。而B（酶解时间）与C（加酶量）交互作用的等高线图近似圆形，即B与C的交互作用不显著。根据回归分析结果，各因素交互项对树莓多糖得率的影响强弱顺序为A（酶解温度）与 C（加酶量）＞A（酶解温度）与 B（酶解时间）＞B（酶解时间）与C（加酶量）。
利用Design-Expert V 12.0软件对树莓果肉多糖的工艺进行优化预测，得到最佳工艺条件为加酶量0.849 3% 、酶解温度43.75℃、酶解时间1.42 h、料液比 1 ∶20（g/mL）、pH5，在此酶解工艺条件下，树莓果肉多糖得率的预测值为2.75% 。
2.4.3 树莓果肉多糖最佳工艺优化的验证
为验证预测工艺条件，结合实际操作，将预测优化工艺条件修正为加酶量0.85% 、酶解温度44℃、酶解时间 1.4 h、料液比 1 ∶20（g/mL）、pH5，并进行3 次验证实验，树莓果肉多糖的得率分别为2.73% 、2.65% 、2.82% ，平均多糖得率为2.73% ，与预测值2.75% 的相对误差为0.73% ，接近模型理论值，表明该模型可用于树莓果肉多糖工艺的预测。
2.5 树莓果肉多糖抗疲劳结果分析
2.5.1 RPP对小鼠负重游泳力竭时间的影响
RPP对小鼠力竭游泳时间的影响见图10。
图10 RPP对小鼠力竭游泳时间的影响
Fig.10 Effect of raspberry pulp polysaccharide on exhaustive swimming time of mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
疲劳即机体在高强度运动后出现的疲劳乏力的表现，有时会伴随其他不适症状[17]。小鼠强迫游泳实验是用来评价药物或食物抗疲劳作用的常用实验方法，游泳持续时间的长短能够反映受试物的抗疲劳程度[15，18-19]。
由图10可知，在100 mg/kg～300 mg/kg内，低、中、高剂量组的小鼠负重游泳力竭时间比对照组明显提高（P＜0.05）。表明树莓果肉多糖在 100mg/kg～300mg/kg范围内可以增加小鼠负重游泳时间，其中高剂量组对于对小鼠负重游泳时间增加最大，平均为（15.41±0.02）min。
2.5.2 RPP对小鼠血清尿素氮的影响
RPP对小鼠血清尿素氮的影响见图11。
图11 RPP对小鼠血清尿素氮的影响
Fig.11 Effect of raspberry pulp polysaccharide on blood urea nitrogen in mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
机体运动过程中，来自糖代谢和脂肪代谢的能量供应不足时，将分解肌肉中蛋白质以提供能量，这种反应影响正常生物功能和肌肉收缩，身体会出现疲劳和其他症状。血清尿素氮是蛋白质分解和肌肉细胞损伤恢复的指标，也是评价疲劳有关重要血液的生化指标之一[20-21]。如图11所示，树莓果肉多糖的低、中、高剂量组血清尿素氮含量均低于对照组（P＜0.05），低、中、高剂量组分别显著降低17.68% 、26.07% 、35.35% 。表明树莓果肉多糖可减少尿素氮在疲劳小鼠体内的积累，增强运动负荷和耐力。吴云等[22]利用超声辅助提取的多糖对小鼠灌胃不同剂量，研究多糖对血清尿素氮的影响，发现与空白组相比，树莓多糖浓度在100 mg/kg～200 mg/kg范围能明显降低小鼠运动后的血清尿素氮的含量，提高机体适应性缓解疲劳，这与本文研究结果一致。
2.5.3 RPP对小鼠血乳酸含量的影响
RPP对小鼠血乳酸含量的影响见图12。
图12 RPP对小鼠血乳酸含量的影响
Fig.12 Effect of raspberry pulp polysaccharide on blood lactic acid in mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
血乳酸（blood lactic acid，BLA）是机体在短时间剧烈运动产热过程中酸性代谢产物之一。运动后机体积累的乳酸越多，机体会越疲劳。因此，血乳酸水平常用来评价机体的疲劳程度[23-24]。由图12可知，各给药组中小鼠血乳酸含量均显著低于对照组（P＜0.05），其中低剂量组降低9.82% ，中剂量组降低16.04% ，高剂量组降低了25.35% ，表明低、中、高剂量组的树莓果肉多糖能通过减少运动疲劳导致的血乳酸积累，从而增强小鼠的运动适应性，达到抗疲劳效果。
2.5.4 RPP对小鼠肝糖原、肌糖原的影响
通常情况下，剧烈运动会消耗大量血糖，机体会出现疲劳现象，尤其是长时间运动后，机体为维持正常血糖水平，肝糖原分解速度增加，因此肝糖原、肝糖原含量是反映抗疲劳作用的重要指标之一[25]。机体内糖主要分为血糖、肝糖原（hepatic glycogen，HG）和肌糖原（muscle glycogen，MG），长时间、高强度的运动会促使肌糖原迅速转化为血糖，肝糖原只有在肌糖原被消耗后才能代谢以维持血糖水平[26]。高肝糖原、肌糖原储备有助于防止运动能力和耐力下降[27]。因此，HG和MG含量的增加可缓解疲劳。RPP对小鼠肝糖原、肌糖原的影响如图13和图14所示。
图13 RPP对小鼠肝糖原的影响
Fig.13 Effect of raspberry pulp polysaccharide on liver glycogen in mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
图14 RPP对小鼠肌糖原的影响
Fig.14 Effect of raspberry pulp polysaccharide on muscle glycogen in mice
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图13可知，树莓果肉多糖在不同剂量组中，小鼠的肝糖原含量均比对照组有明显提升，并表现出剂量-量效关系。说明在质量浓度为100 mg/kg～300 mg/kg范围内，能明显增加运动小鼠的肝糖原水平，为小鼠运动提供充足的能量，从而有效提高小鼠的运动耐力。
由图14可知，与对照组相比，在质量浓度100 mg/kg～300 mg/kg范围内，低、中、高剂量组小鼠体内的肌糖原含量分别为1.62、1.89、2.43 mg/g，均比对照组含量（0.92 mg/g）有显著提高（P＜0.05），说明树莓果肉多糖能明显增加运动小鼠的肌糖原水平，为小鼠运动提供充足的能量。
3 结论
通过Plackett-Burman设计试验，得到影响树莓果肉多糖得率的3个明显因子，即酶解温度、酶解时间和加酶量。利用响应面Box-Behnken试验得到树莓果肉多糖的最优酶解参数为pH5、料液比1∶20（g/mL）、加酶量0.85% 、酶解温度44℃、酶解时间1.4 h。在上述最佳工艺条件下，得到纤维素酶酶解树莓果肉多糖得率为2.73% 。抗疲劳研究结果表明，通过建立小鼠负重游泳实验模型，纤维素酶酶解得到的树莓果肉多糖（RPP）能够延长小鼠负重游泳时间，提高机体的运动耐力，并使小鼠机体内的肝糖原及肌糖原水平显著提升，同时降低血清尿素氮、血乳酸含量，显示出较好的抗疲劳效果。本研究结果为树莓果肉多糖进行功能食品开发应用提供了参考。
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