白芷别名香白芷，味辛、温，含有香豆素类、挥发油、多糖类、黄酮类等多种有效成分，有抗炎、镇痛、抗氧化、美白等作用[1-3]。黄酮类化合物是植物界普遍存在的一大类天然产物，是目前备受关注的天然活性物质之一[4]。黄酮有多种生物活性和药理作用，对多种疾病有预防和治疗作用[5]，被广泛应用于食品、医药及化妆品等领域。
黄酮的提取方法主要包括有机溶剂提取[6]、微波辅助提取[7]或超声波辅助提取[8-10]等。采用表面活性剂与超声波结合可能成为提取黄酮新方向，该法用少量表面活性剂的水替代高浓度的醇或其他有机溶剂来提取黄酮，能降低提取成本，并提高提取率[11]。潘芳芳等[12]用表面活性剂提取山楂总黄酮，提取率与传统的乙醇回流提取法相比提高了16.97% 。张云云等[13]研究表明，用表面活性剂协同超声提取合欢花总黄酮高于乙醇超声提取，有效地提高了黄酮得率。许婉晴等[14]采用超声提取白芷根黄酮的得率为0.75% 。李蜀眉等[15]采用醇提白芷黄酮的得率为1.56% 。表面活性剂与超声波结合提取白芷黄酮鲜有研究。因此，本研究用表面活性剂结合超声辅助提取白芷黄酮类化合物，并探究其最佳的工艺条件，为进一步研究其抗氧化能力及白芷的产业开发与利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白芷粉末：市售；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、芦丁标品：北京索莱宝科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl），DPPH]：北京中生瑞泰科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 芦丁标准曲线的绘制
称取约2 mg芦丁，用70% 乙醇配制成0.2 mg/mL的芦丁标准液。分别吸取芦丁标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加70% 乙醇至 2.0 mL，加入 5% 亚硝酸钠0.15 mL，静置 6 min；10% 硝酸铝 0.15 mL，静置 6 min；10% 氢氧化钠2.0 mL，静置15 min。用分光光度计测定510 nm波长下的吸光度，并绘制标准曲线。
1.2.2 黄酮提取与得率计算
称取约0.2 g白芷粉末，按一定料液比加入SDS水溶液，在试验温度下超声辅助提取一段时间后，放置冷却至25℃，以3 000×g离心10 min，取上清液1 mL，按1.2.1的步骤测定其吸光度，计算得率，公式如下。
式中：c为根据回归方程计算出的质量浓度，mg/mL；v为提取液的总体积，mL；n为稀释倍数；M为白芷粉末的质量，g。
1.2.3 单因素试验
固定超声功率为200 W，选择SDS浓度（0、0.5% 、1.0% 、1.5% 、2.0% ）、料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]、提取温度（30、40、50、60、70 ℃）和提取时间（15、30、45、60、75 min）作为研究对象，以黄酮得率为指标，确定各因素的最佳水平。
1.2.4 正交试验设计
依据单因素结果，取料液比（A）、SDS浓度（B）、提取时间（C）和提取温度（D）4个因素，进行L9（34）正交试验，以黄酮得率为指标确定最佳工艺条件。正交试验因素水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 A料液比/（g/mL）B SDS浓度/% C提取时间/min D提取温度/℃1 1∶30 0.5 30 50 2 1∶40 1.0 45 60 3 1∶50 1.5 60 70
1.2.5 黄酮抗氧化活性研究
1.2.5.1 对DPPH自由基清除能力的测定
测定方法参考文献[16]，进行部分修改。优化工艺提取得到的白芷黄酮用乙醇制备成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL样品。以VC作为对照，取2.0 mL样品与20 mL 0.2 mmol/L DPPH充分混合。避光反应30 min后测定在517 nm处的吸光度，按下列公式计算清除率。
式中：A1为2.0 mL乙醇+2.0 mL DPPH溶液吸光度；A2为2.0 mL样品+2.0 mL DPPH溶液吸光度；A0为2.0 mL样品+2.0 mL乙醇溶液吸光度。
1.2.5.2 对羟自由基清除能力的测定
测定方法参考文献[17]，进行部分修改。样品溶液制备同1.2.5.1。取1.5mL样品，依次加入1.0mL2.5mmol/L的水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液、2.0 mL蒸馏水和1.0 mL 5 mmol/L的H2O2溶液，于37℃恒温水浴30 min，510 nm波长处测定吸光度。清除率公式如下。
式中：A1为1.5 mL蒸馏水+1.0 mL H2O2溶液吸光度；A2为 1.5 mL样品+1.0 mL H2O2溶液吸光度；A0为1.5 mL样品+1.0 mL蒸馏水吸光度。
1.2.5.3 对ABTS+自由基清除能力的测定
测定方法参考文献[17]，进行部分修改。取7 mmol/L ABTS溶液与2.5 mmol/L K2S2O8溶液各5.0 mL混合均匀后，避光反应12 h，然后用乙醇稀释到在734 nm处吸光度约为0.7，配制成ABTS溶液。同1.2.5.1制备样品溶液。0.4 mL样品加入3.0 mL ABTS溶液中，在黑暗环境中反应30 min，然后检测734 nm处的吸光度，按下列公式计算清除率。
式中：A1为0.4 mL乙醇+3.0 mL ABTS溶液吸光度；A2为0.4 mL样品+3.0 mL ABTS溶液吸光度；A0为0.4 mL样品+3.0 mL乙醇吸光度。
1.3 数据处理
数据采用DPS统计软件（Version.8.5）进行邓肯法比较分析，各项指标以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线绘制
根据结果绘制出芦丁标准曲线，纵坐标为吸光度，横坐标为芦丁浓度。回归方程为y=0.006 3x+0.034 9，相关系数R2=0.999 4。标准曲线如图1所示，在0～40 μg/mL范围内标准曲线的线性关系良好。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard curve of rutin
2.2 单因素试验结果
2.2.1 SDS浓度对黄酮得率的影响
SDS浓度对白芷黄酮得率的影响见图2。
图2 SDS浓度对黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of SDS concentration on the yield of flavonoids
由图2可知，当SDS浓度为1.0% 时，白芷黄酮得率最高，但是随着浓度升高得率降低。有研究表明高浓度的SDS会形成紧密的胶束，从而抑制黄酮类化合物的析出[18]。因此，选择SDS浓度为1.0% 进行后续的单因素试验。
2.2.2 提取时间对黄酮得率的影响
提取时间对白芷黄酮得率的影响如图3所示。
图3 提取时间对黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of flavonoids
由图3可知，在45 min的提取时间内，黄酮得率随着时间延长而增加，但45 min后得率反而下降。由于超声持续时间太长会影响SDS的稳定性，进而影响其形成胶束增溶效果[19]。因此，选择提取时间为45 min进行后续单因素试验。
2.2.3 料液比对黄酮得率的影响
料液比对白芷黄酮得率的影响如图4所示。
图4 料液比对黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of flavonoids
由图4可知，随溶剂体积的增大，黄酮得率增加。当料液比为1∶40（g/mL）时，得率达到最大，所以选择料液比1∶40（g/mL）进行后续单因素试验。
2.2.4 提取温度对黄酮得率的影响
提取温度对白芷黄酮得率的影响见图5。
图5 提取温度对黄酮得率的影响
Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of flavonoids
由图5可知，当提取温度低于60℃，白芷黄酮得率与提取温度呈正相关，可能是提高提取温度会加快黄酮的溶解和扩散速度，从而提高黄酮得率。但提取温度过高会降低溶剂增溶能力，且部分黄酮的分子结构在高温超声的相互作用下遭到破坏，而影响黄酮得率[20]。
2.3 正交试验
在单因素试验的基础上，用L9（34）正交试验，考察料液比（A）、SDS浓度（B）、提取时间（C）、提取温度（D）4个因素对白芷黄酮得率的影响，正交试验结果和方差分析见表2和表3。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal test results
试验号 因素 黄酮得率/% A B C D 1 1 1 1 1 1.070 2 1 2 2 2 1.541 3 1 3 3 3 1.636 4 2 1 2 3 1.749 5 2 2 3 1 1.407 6 2 3 1 2 1.394 7 3 1 3 2 1.928 8 3 2 1 3 1.475 9 3 3 2 1 1.237 k1 1.416 1.582 1.313 1.238 k2 1.517 1.474 1.509 1.621 k3 1.547 1.422 1.657 1.620 R 0.131 0.160 0.344 0.383影响顺序 D＞C＞B＞A最佳因素水平组合 A3B1C3D2
表3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance
注：* 表示差异显著，P＜0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 显著性A料液比 0.028 2 1.000 B SDS浓度 0.04 2 1.429 C提取时间 0.179 2 6.392 D提取温度 0.293 2 10.464 *误差 0.028 2
由表2可知，影响白芷黄酮得率的因素顺序为提取温度＞提取时间＞SDS浓度＞料液比。最佳工艺条件为提取温度60℃、提取时间60 min、SDS浓度0.5% 、料液比1∶50（g/mL）。在最佳条件下进行6次重复试验，得到白芷黄酮得率平均为1.982% ，证明用正交法优化白芷黄酮的提取工艺可行。由表3可知，提取温度对白芷黄酮得率的影响达到显著水平（P＜0.05）。
2.4 黄酮抗氧化试验结果
2.4.1 白芷黄酮对DPPH自由基清除效果
自由基清除剂与孤对电子结合后，吸光度降低，通过吸光度即可评价提取液的抗氧化能力。白芷黄酮对DPPH自由基清除效果如图6所示。
图6 白芷黄酮对DPPH自由基清除效果
Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Angelica dahurica flavonoids
由图6可知，白芷黄酮和VC对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增加。在白芷黄酮浓度为0.10 mg/mL时，DPPH清除率达到90% 以上，超过0.10 mg/mL时趋于稳定。但是白芷黄酮对DPPH自由基清除率均低于VC的清除率。
2.4.2 白芷黄酮对羟自由基清除效果
Fenton试剂产生的羟自由基会将Fe2+氧化为Fe3+，而抗氧化剂可以抑制羟自由基而产生紫色化合物，其最大吸收峰在510 nm处[21]。白芷黄酮对羟自由基清除效果如图7所示。
图7 白芷黄酮对羟自由基清除效果
Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of Angelica dahurica flavonoids
由图7可知，随着浓度增加，白芷黄酮对羟自由基的清除率增加。当浓度达到0.20 mg/mL时，白芷黄酮的羟自由基清除能力明显增强，且对羟自由基清除能力与VC相当。
2.4.3 白芷黄酮对ABTS+自由基清除效果
在活性氧的作用下，ABTS可生成稳定的蓝绿色ABTS+。ABTS+与抗氧化成分的物质反应会褪色。白芷黄酮对ABTS+自由基清除效果如图8所示。
图8 白芷黄酮对ABTS+自由基清除效果
Fig.8 ABTS+radical scavenging activity of Angelica dahurica flavonoids
由图8可知，当白芷黄酮浓度较低时，清除ABTS+自由基的能力明显低于VC；在白芷黄酮浓度为0.25mg/mL时，与VC的清除效果相当。
3 结论
本试验研究了表面活性剂辅助超声提取白芷中的黄酮类物质，通过单因素和正交试验优选出最佳提取条件：提取温度为60℃，提取时间为60 min，SDS浓度为0.5% ，料液比为1∶50（g/mL）。此条件下黄酮得率为1.982% 。结果表明采用表面活性剂与超声联合的方法优于单一技术提取。此方法不仅降低提取成本，而且提高黄酮得率，是一种理想的提取工艺。在此工艺的基础上，提取白芷黄酮，白芷黄酮浓度为0.25 mg/mL时，对DPPH自由基、羟自由基及ABTS+自由基的清除率分别为94.52% 、63.12% 、99.50% ，有较好的体外抗氧化能力。
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