现代社会人们的生活节奏越来越快，工作压力越来越大，使机体常处于应激状态，导致免疫力降低，而免疫力低下是引发疾病的根本原因[1]。近年来，随着健康产业的蓬勃发展，人们越来越认识到提高机体免疫力、增强机体免疫功能的重要性。研究表明，免疫活性肽能够通过抑制氧化应激来增强机体免疫力、保护机体免受病原体入侵等生物功能[2]，因此，免疫活性肽成为目前人们关注的热点话题之一。
免疫活性肽是指一类能够提高机体免疫力与抗感染能力的肽类物质，通常由精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、酪氨酸（Tyr）和丝氨酸（Ser）等氨基酸组成[3]。免疫活性肽的免疫调节作用是由自身结构中的特定氨基酸序列和其生物利用度决定的。Parker等[4]在人酪蛋白中首次发现的1种六肽（VEPIPY）的免疫活性肽，该肽能够刺激小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力，提高小鼠免疫力。研究发现鲑鱼胶原蛋白水解物可使脾脏分泌抗炎因子，通过增加CD4+T免疫细胞来保护脾细胞[5]。研究表明，具有免疫功能的肽多为短肽，因此易被机体吸收而发挥其生理活性。其中，分子量小于10 kDa的多肽基本不会引发机体的免疫排斥[6]。与大分子蛋白（免疫球蛋白等）相比，免疫活性肽可主动作用于机体，不会对其产生依赖性；而大分子蛋白能被动地被机体吸收，停止摄入后免疫能力通常会出现急剧下降[1，6]。海洋蛋白源生物活性肽具有种类多、来源广、高特异性和低副作用等优点，目前被广泛研究和应用[7]。
刺参（Stichopus japonicus），隶属于海参纲，刺参科，是我国食用海参中品质最好的品种之一，在“海味八珍”中居首位。现代研究证明，刺参含有50余种对机体有益的营养成分，富含蛋白质、必需氨基酸、各种微量元素和维生素，同时还含有很多生物活性物质，如海参黏多糖、海参皂苷、海参肽等[8]，具有抗氧化性、抗肿瘤、抗疲劳、降血压、降血脂和免疫调节等功效[9]。近年来，生物活性肽受到越来越多国内外研究者的重视[10]。经过蛋白酶水解得到的海参活性肽具有溶解性好、生物活性高、毒性低、易吸收等特点，具有很大的开发和应用潜力。但目前对于海参活性肽的研究大多集中在降血压、降血脂、抗血栓[11]和抗炎活性[12]等方面，对其免疫功能的研究相对较少。
本研究使用常用商业蛋白酶（中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）对刺参体壁进行酶解制备酶解液，测定酶解液的水解度、分子量分布，以及分子量小于3 kDa超滤组分的氨基酸组成和结构特性，并利用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型评价不同蛋白酶海参酶解液的免疫调节活性，以期为海参中免疫活性多肽的进一步开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜刺参：达莲食品（锦州）有限公司；中性蛋白酶（20万U/g）、碱性蛋白酶（20万U/g）：合肥博美生物科技有限责任公司；胰蛋白酶（25万U/g）、木瓜蛋白酶（80万 U/g）、胃蛋白酶（60万 U/g）、磷酸缓冲液（phosphate buffer，PBS）、NO 测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；RAW264.7小鼠单核巨噬细胞：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心；Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基：赛默飞世尔科技（中国）公司；胎牛血清：上海双螺旋生物科技有限公司；胰酶（50万U/g）、CCK-8检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：德国默克生物科技（中国）有限公司；琼脂糖G-10、中性红染色液：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）：北京百奥莱博科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TH2-82A双功能数显恒温振荡器：上海梅香仪器有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计、LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司；SORVALL Stratos冷冻高速离心机：美国Thermo公司；FD-IC真空离心浓缩器：上海妙生科贸有限公司；MSl05DU分析天平、FE-20FiveEasy Plus pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FreeZone2.5真空冷冻干燥机：美国Labconco公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：德国Sykam公司；Cary Eclipse荧光分光光度计：美国帕洛阿尔托瓦里安公司；3 kDa超滤离心管：上海科百特过滤技术有限公司；ELX-800酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；HF-90 CO2培养箱：上海力申科学仪器有限公司；AE31倒置相差显微镜：德国麦克奥迪集团。
1.3 方法
1.3.1 海参酶解液及超滤组分的制备
将鲜海参剖腹弃肠，清洗后放入95℃去离子水中，煮制10 min，室温20℃静置，切成1 cm～3 cm的小块后放入-80℃冰箱预冷过夜。冷冻干燥48 h后超微粉碎，过80目筛，得到海参干粉。用0.1 mol/L氢氧化钠和0.1 mol/L柠檬酸分别加入PBS缓冲液中，调节碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶至最适pH值以及温度，按料液比1∶12（体积比）加入PBS缓冲液进行酶解。加酶量为海参干粉质量的0.6% ，酶解300 min后在95℃沸水中加热10 min灭酶。将酶解液用离心机8 000×g离心2次，取上清液冷却干燥得到酶解液干粉备用。分别将得到的海参粗多肽酶解液命名为 SCH-A、SCH-N、SCH-P、SCH-T、SCH-P'，并测定其水解度、分子量分布。
使用分子截留量为3kDa的超滤离心管在5000×g，10℃条件下对5种海参酶解液进行超滤分离，得到小于3 kDa的组分，冷冻干燥，保存于-80℃冰箱。分别将该 5 种组分命名：SCH-A-I、SCH-N-I、SCH-P-I、SCH-T-I、SCH-P'-I，并测定其氨基酸组成、结构特性以及对巨噬细胞的免疫活性。
5种蛋白酶的酶解条件见表1。
表1 5种蛋白酶的酶解条件
Table 1 Hydrolysis conditions for the five proteases
名称 蛋白酶特性 温度/℃ pH值碱性蛋白酶 地衣芽孢杆菌，内切酶 50 9.0中性蛋白酶 枯草芽孢杆菌，内切酶 50 7.0木瓜蛋白酶 番木瓜水解酶，内切酶 50 6.5胰蛋白酶 胰蛋白酶，内切酶 50 8.0胃蛋白酶 酸性蛋白酶，内切酶 37 3.0
1.3.2 水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定
海参酶解过程中氨基酸态氮含量的测定参考GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》，总氮含量的测定法参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，DH计算公式如下。
1.3.3 分子量分布的测定
采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定海参酶解液的分子量分布。将海参酶解液溶解至超纯水中，使最终浓度为1 mg/mL，过0.22 μm滤膜入液相瓶中备用。标准品：甘氨酸（75 Da）、L-谷胱甘肽（6 513 Da）、杆菌肽（1 450 Da）、抑肽酶（6 513 Da）、细胞色素 C（12 383 Da）。检测条件：波长220 nm，流动（乙腈∶超纯水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1，体积比），色谱柱Shodex Asahi pak GS-320 HQ（编号R2870036）。在此条件下绘制标准曲线、测定5种样品的分子量。
1.3.4 氨基酸组成分析
将酶解液超滤组分样品（0.02 g）添加到10 mL HCl（6 mol/L）溶液中，混匀。在烘箱中110℃反应24 h。收集上清液。取1 mL上清液添加到离心管中，用真空离心浓缩器在10 000×g，45℃下浓缩12 h，备用，进行后续分析。使用全自动氨基酸分析仪对5种酶解液进行定量分析。
1.3.5 结构特性分析
1.3.5.1 表面疏水性分析
参考何荣[13]的方法并稍加修改，使用荧光分光光度计测定5种酶解液超滤组分的固有荧光光谱。将样品溶解于磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH7.2），取各组分的样品 4 mL，加入 20 μL ANS（8 mmol/L），得到母液，备用。测定不同浓度下样品的吸光强度，绘制标准曲线。荧光条件：激发波长为250 nm，光谱范围为400 nm～600 nm。
1.3.5.2 紫外可见光谱分析
用0.01 mol/L PBS缓冲溶液稀释样品至质量浓度为1 mg/mL，紫外扫描光谱范围为200 nm～360 nm，狭缝2.5 nm，高速扫描，扫描间隔1 nm。
1.3.5.3 内源荧光光谱分析
用0.01mol/LPBS缓冲溶液稀释样品至质量浓度为1mg/mL。荧光光谱激发波长280nm，扫描发射光谱范围为300nm～480nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5nm。
1.3.6 巨噬细胞的免疫活性分析
1.3.6.1 细胞培养
将RAW264.7培养在DMEM完全培养基，至密度为90% 左右，PBS清洗2次。弃去上清，加入适当体积的0.25% 胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后，轻轻拍打瓶壁侧面，并加入DMEM完全培养基终止反应。收集混合液至15 mL试管，800×g离心3 min。去上清液，进行细胞计数并接种。巨噬细胞培养条件：相对湿度92% ，培养温度37℃，5% CO2。收集成长到对数期RAW264.7细胞进行免疫活性研究。
1.3.6.2 测试样品的制备
称取 SCH-P-I、SCH-N-I、SCH-T-I、SCH-A-I、SCH-P'-I各20 mg于离心管中，加入1 mL PBS，过0.22 μm 滤膜，得到母液（20 mg/mL），并用 PBS溶液稀释至各测试浓度。
1.3.6.3 巨噬细胞存活率的测定
采用CCK-8法评估酶解液超滤组分对巨噬细胞的细胞增殖作用[14]。将不同浓度的5种海参酶解液（50 μg/mL～800 μg/mL）分别添加到 RAW264.7（1×104细胞/mL）中，每组设置3个复孔，置于37℃、5% CO2培养箱培养24 h。去除反应溶液并用PBS洗涤3次后，添加10 μL CCK-8溶液（1 mg/mL）并在37℃下培养1 h。使用微孔板读取器在450 nm处测量吸光度。细胞存活率的计算公式如下。
1.3.6.4 巨噬细胞吞噬力的测定
用中性红（0.09% ）检测巨噬细胞的吞噬活性，其中细胞裂解液采用无水乙醇∶己酸=1∶1（体积比）。将生长在对数期的RAW264.7细胞加入到96孔板中，每孔细胞数为2×104个，设置5个生物学重复。培养24 h后，对不同浓度（25、50、100、200、400、800 μg/mL）的5种酶解液超滤组分样品进行干预处理。培养24 h后，加入100 μL中性红溶液。放入细胞培养箱37℃培养30 min后，用PBS洗涤3次，每孔加入100 μL的细胞裂解液，室温20℃下放置6 h。空白对照组给予100 μL完全培养基。最后用酶标仪在发射波长为540 nm处检测吸光度[15]。
1.3.6.5 巨噬细胞NO含量的测定
基于Griess法检测巨噬细胞RAW264.7释放的NO含量[16]。设置3个生物学重复。将100 μL脂多糖（LPS）添加到完全培养基中，使其终质量浓度为100 ng/mL。培养基中分别加入50 μL不同浓度的酶解液超滤组分样品，其终浓度为（0、50、100、200、400、800 μg/mL，培养24 h。随后，将100 μL上清液与100 μL Griess试剂混合均匀，并在室温20℃下反应10 min。540 nm处测定吸光度，带入标准曲线即得释放的NO含量。
1.4 数据处理
每组试验数据重复测定3次，得出平均值以及标准差，结果表示为平均值±标准差。采用软件SPSS 19.0对实验数据进行显著性分析，P＜0.05差异显著；使用Origin绘制图像。
2 结果与分析
2.1 不同蛋白酶对海参水解度的影响
不同蛋白酶有不同的切割位点，并且不同蛋白酶在不同时间内对蛋白质的水解程度也不同，因此会形成不同链长的小分子肽，DH是衡量酶解效果的重要指标之一[17]。海参酶解液的DH随酶解时间的变化关系如图1所示。
图1 5种蛋白酶的水解度曲线
Fig.1 Degrees of hydrolysis by the five proteases
由图1可知，DH随酶解时间的延长呈先升高后稳定的趋势。在前100 min内，酶解反应迅速，DH快速升高；100 min～200 min上升速度变得缓慢，200 min后DH趋于平缓。其原因可能是随着酶解时间的延长，酶对其特异切割位点肽键的水解达到相对平衡状态，水解度保持不变，或是由于底物浓度降低，水解产物相应增加，从而抑制酶的活性，使水解趋于平稳[18]。5种蛋白酶作用相同时间后，对海参酶解液DH的影响程度由高到低依次为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，这种差异主要跟蛋白酶的作用位点及酶解特性有关。
2.2 不同蛋白酶海参酶解液的分子量分布
由于不同蛋白酶的切割位点具有特异性，会形成不同长度的小分子肽，而肽链长度决定肽的生物活性[18]，所以研究酶解液中肽分子量分布是进一步筛选制备活性肽的基础。5种蛋白酶制得的海参酶解液的分子量分布如图2所示。
图2 5种酶解液的分子量组成
Fig.2 Molecular weight of fractions in the five hydrolysates
由图2可知，各酶解液中分子量小于3 kDa的组分占比均高达70% 以上。低分子量多肽比高分子量多肽具有更强的活性[19]，并且分子量低的多肽可以在肠道环境中被完全地吸收并保持其原有的生理活性[20]，因此，本试验选用小于3 kDa的超滤离心管对各酶解液进行超滤离心，得到小于3 kDa的组分进行后续活性研究。
2.3 海参酶解液超滤组分的氨基酸组成
氨基酸是免疫系统中的重要组成物质，在体内参与免疫应答。据研究，一些特殊氨基酸及其组成也会决定着生物肽的免疫活性[14]。研究表明，脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）、天冬氨酸（Asp）具有提高肽免疫活性的作用。疏水性氨基酸，如甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）等能够增强小分子肽与脂类之间的相互作用，并在靶细胞中发挥免疫活性[21]。还有一些氨基酸，如组氨酸催化降解生成组胺，参与炎症过敏反应；精氨酸作用于肝脏，激活精氨酸酶在免疫机制中发挥不可替代的作用等[22]。5种海参酶解液小于3 kDa超滤组分的氨基酸组成分析结果如表2所示。
表2 5种酶解液超滤组分的氨基酸组成（＜3 kDa）
Table 2 Amino acid composition of fractions（＜ 3 kDa）in ultrafiltrates of the five hydrolysates
注：Asp为天冬氨酸；Thr为苏氨酸；Ser为丝氨酸；Glu为谷氨酸；Pro为脯氨酸；Gly为甘氨酸；Ala为丙氨酸；Cys为半胱氨酸；Val为缬氨酸；Met为甲硫氨酸；Ile为异亮氨酸；Leu为亮氨酸；Tyr为酪氨酸；Phe为苯丙氨酸；Lys为赖氨酸；His为组氨酸；Arg为精氨酸；Trp为色氨酸。HAA 为疏水性氨基酸（hydrophobic amino acids）；（+）AA为带正电荷的氨基酸；（-）AA为带负电荷的氨基酸；AAA为芳香族氨基酸（aromatic amino acids）；EAA为必需氨基酸（essential amino acid）；TAA 为总氨基酸（total amino acids）。
SCH-A-I/（mg/g）Asp 21.99 3.92 29.22 19.29 20.41 Thr 17.00 3.75 18.35 15.87 14.31 Ser 16.66 4.10 18.33 14.90 13.82 Glu 34.68 7.58 48.70 29.46 35.41 Pro 33.27 6.17 37.25 31.05 27.78 Gly 66.33 15.51 56.48 58.90 57.05 Ala 22.47 5.79 20.55 23.26 23.72 Cys 5.12 1.06 2.66 4.12 2.51 Val 10.39 2.64 11.61 10.45 9.57 Met 3.92 0.60 4.64 2.41 3.79 Ile 7.62 1.70 5.97 7.70 7.37 Leu 8.01 2.62 12.29 8.43 7.70 Tyr 11.64 7.49 13.35 17.01 12.71 Phe 13.88 13.55 11.81 29.51 29.77 Lys 11.57 3.21 10.39 10.77 9.16 His 1.80 0.87 1.69 1.88 2.61 Arg 33.72 9.18 35.14 30.16 28.03 Trp 2.40 0.30 1.70 2.50 2.70 HAA 161.97 47.98 155.96 169.30 162.96（+）AA 47.09 13.26 47.22 42.81 39.80（-）AA 56.67 11.50 77.92 48.75 55.82 AAA 25.52 21.04 25.16 46.52 42.48 EAA 76.59 29.24 78.45 89.52 86.98 TAA 322.47 90.04 340.13 317.67 308.42氨基酸种类SCH-T-I/（mg/g）SCH-P'-I/（mg/g）SCH-P-I/（mg/g）SCH-N-I/（mg/g）
由表2可知，5种样品中均检测出18种氨基酸，其中Asp、Gly、Glu和Arg的含量较高。SCH-N-I和SCH-A-I的必需氨基酸含量最高，分别为89.52 mg/g和86.98 mg/g，各占其组分的总氨基酸含量的28.18% 和28.20% 。同时，SCH-N-I和SCH-A-I的疏水性氨基酸含量分别为169.30 mg/g和162.96 mg/g，也高于其余3组样品。上述结果表明SCH-N-I和SCH-A-I可能具有较高的营养价值以及免疫活性。
2.4 海参酶解液超滤组分的表面疏水性
研究发现，多肽的活性可能与表面疏水性指数或疏水性氨基酸有关。由于天然蛋白物质具有分子大结构卷曲复杂的特点，疏水性基团被包埋在分子内部，而酶解可使蛋白质结构去折叠、疏水性基团暴露，提高表面疏水性，从而提高其活性[23]。5种海参酶解液超滤组分的表面疏水性见图3。
图3 5种海参酶解液超滤组分的表面疏水性
Fig.3 Surface hydrophobicity of fractions in ultrafiltrates of the five hydrolysates
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
由图3可知，SCH-N-I的表面疏水性最大为（4 084.00±17.00），其次为 SCH-A-I（3 008.50±4.90），SCH-T-I、SCH-P'-I、SCH-P-I依次为（2 352.00±15.60）、（2 447.00±8.50）、（1 958.50±6.40）。酶解过程中随着反应时间延长，5种酶解液的水解度逐步增加，从而使疏水性基团暴露。疏水性的大小一般与疏水残基（如Ala和Tyr等）的含量有关[24]。然而也有小的疏水性基团会随之被水解为小肽，使表面疏水能力丧失[25]。因此，SCH-N-I和SCH-A-I可能含较高的疏水性基团及免疫调节活性肽，这与氨基酸组成分析结论相一致。
2.5 海参酶解液超滤组分的紫外可见光谱特征
紫外可见光谱可以反映酶解液中多肽的结构特性差异[26]。5种海参酶解液超滤组分的紫外可见光谱特征如图4所示。
图4 5种海参酶解液超滤组分的紫外可见光谱
Fig.4 UV-Vis spectra of fractions in ultrafiltrates of the five hydrolysatesenzymatic
由图4可知，海参酶解液在210 nm附近的近紫外区存在峰值，相比于其他组分，SCH-N-I的吸收峰发生了明显的红移；且其吸光度为几个样品中最高，达到了为4.05和0.376。研究表明，多肽在紫外210 nm附近有最强特征吸收峰[27]；而羰基的最大吸收波长一般为200 nm左右。本试验中该吸收峰出现在210 nm，推测主要原因是在酶解过程中，发色团和助色团如C=O、COOH、NH2的偏光性发生了变化，肽键中羰基π电子与相邻氨基的孤对电子发生p-π共轭使电子π-π*跃迁产生的吸收峰发生红移[28-29]。
2.6 海参酶解液超滤组分的内源荧光光谱分析
研究表明，芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在适当的激发波长下均能产生内源性荧光，因为其含有对环境变化敏感的芳香族氨基酸残基，如Tyr、Trp等[30]。其中，荧光光谱最大吸光度波长取决于待测组分中Trp残基含量及所处的微环境[31]。内源荧光强度可以反映酶解液中Trp残基的情况，进而表征酶解物结构变化特征及分子间疏水相互作用[23]，间接反映免疫活性的差异。不同蛋白酶酶解液超滤组分的内源荧光图谱如图5所示。
图5 5种海参酶解液的内源荧光光谱
Fig.5 Intrinsic fluorescence spectra of fractions in ultrafiltrates of the five hydrolysates
由图5可知，不同酶解液超滤组分的最大荧光峰位出现在345 nm～350 nm，SCH-N-I较其它超滤组分相比荧光强度最大，且最大荧光峰向高波长方向偏移（红移）。这说明海参蛋白质经蛋白酶酶解后结构发生去折叠反应，分子内部的Trp、Tyr残基在周围极性环境中；而中性蛋白酶酶解时去折叠效应相比其他蛋白酶更强，酶解物中Trp、Tyr残基暴露更多，因而具有较高的荧光强度和表面疏水性，表明其免疫活性也可能更高。
2.7 海参酶解液超滤组分对巨噬细胞免疫活性的影响
免疫调节是免疫系统对自身免疫应答控制和调节的过程，其目的是保持机体的稳定和内平衡[32]。巨噬细胞是激活先天免疫应答和诱导适应性免疫应答的重要桥梁，因此常作为免疫调节模型来评价活性物质的免疫调节活性，因此本试验以常用的RAW264.7巨噬细胞为模型[33]，研究海参酶解物的体外免疫调节活性。
2.7.1 海参酶解液超滤组分对巨噬细胞存活率的影响
在免疫实验中测定细胞活力及数量的常用的方法为CCK-8法[34]，根据细胞的增殖分裂情况表征细胞的生长存活状况。不同浓度酶解液超滤组分对巨噬细胞存活率的影响见图6。
图6 不同浓度酶解液超滤组分对巨噬细胞存活率的影响
Fig.6 Effect of different concentration of enzymatic hydrolysates ultrafiltration fractions on cell viability of macrophages
（A）SCH-T-I；（B）SCH-P'-I；（C）SCH-P-I；（D）SCH-N-I；（E）SCH-A-I。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图6 可知，50 μg/mL～800 μg/mL 的不同蛋白酶海参酶解液超滤组分对巨噬细胞作用24 h后，巨噬细胞的存活率均随着酶解液超滤组分浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，但细胞存活率均在100%～125% ，表明酶解液超滤组分对巨噬细胞的生长均没有明显抑制性，所以可以使用 50 μg/mL～800 μg/mL 的范围进行后续细胞试验。与其他4种酶解液相比，SCH-N-I在浓度 50 μg/mL～800 μg/mL 时，可显著促进巨噬细胞的代谢增殖（P＜0.05），当浓度为 200 μg/mL 时存活率最高为（121.79±4.98）% 。周勰等[35]通过正交试验优化鳕鱼皮免疫活性肽的制备工艺，在最优工艺条件下，RAW264.7细胞存活率为116.4% ，本试验结果与其相似。
2.7.2 海参酶解液超滤组分对巨噬细胞吞噬力的影响
吞噬细胞吞噬能力的强弱是反映机体非特异性免疫能力高低的重要指标之一。使用中性红法测定不同蛋白酶酶解液超滤组分的细胞吞噬力，结果如图7所示。
图7 不同浓度酶解液超滤组分对巨噬细胞吞噬能力的影响
Fig.7 Effect of different concentration on phagocytosis ability of macrophages
（A）SCH-T-I；（B）SCH-P'-I；（C）SCH-P-I；（D）SCH-N-I；（E）SCH-A-I。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图7可知，与对照组相比，酶解液超滤组分处理组巨噬细胞的吞噬活性显著提高（P＜0.05）。在相同浓度范围内，SCH-N-I相比于其他4种酶解液超滤组分对巨噬细胞吞噬能力的增强效果更为显著。当SCHN-I浓度为200 μg/mL时，最大吸光度为（0.107 7±0.001 0）。因此，中性蛋白酶酶解液可能具有更高的免疫活性。赵杰等[36]研究蜂蛹多肽对RAW264.7免疫活性的影响，发现蜂蛹多肽可以显著提高巨噬细胞的吞噬力，Chalamaiah等[37]研究发现南亚野鲮鱼卵蛋白的胃蛋白酶水解物可以增强巨噬细胞的吞噬力，与本试验结果一致。
2.7.3 海参酶解液对巨噬细胞NO释放量的影响
在免疫反应中，NO是激活巨噬细胞产生的关键炎症因子，NO释放量可作为评价酶解物是否具有激活巨噬细胞从而增强机体免疫力的依据[38-39]。选用Griess法绘制NO回归标准曲线，从而测定上清液中的NO释放量，结果如图8所示。
图8 不同浓度酶解液超滤组分对巨噬细胞NO释放量的影响
Fig.8 Effect of different concentration of enzymatic hydrolysates ultrafiltration fractions on the release of NO in macrophages
（A）SCH-T-I；（B）SCH-P'-I；（C）SCH-P-I；（D）SCH-N-I；（E）SCH-A-I。不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图8 可知，在浓度范围 50 μg/mL～800 μg/mL下，5种不同蛋白酶酶解液超滤组分作用巨噬细胞后NO释放量相比于对照组均显著增加，且随着浓度的升高呈先增加后降低的趋势。SCH-N-I作用后的巨噬细胞NO释放量均高于其他酶解液超滤组分，且在浓度为200 μg/mL时NO释放量最高，达（15.39±0.33）μmol/L，说明SCH-N-I更易激活免疫反应的发生，与其增强吞噬能力的研究结果相吻合。于志成等[40]以NO释放量为响应值，通过响应面法优化酱油渣免疫活性肽的制备工艺，发现酱油渣免疫活性肽可以显著降低巨噬细胞NO的释放量。Kim等[41]发现贻贝免疫活性肽通过抑制MAPK和核因子кB通路来显著降低细胞RAW264.7内NO的表达，与本试验结果其一致。
3 结论
采用5种蛋白酶（中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶）对海参体壁进行酶解，中性蛋白酶的水解度最高，达17.18% ，酶解液中分子量小于3 kDa的组分占96.33% ，并且富含多种必需氨基酸。5种蛋白酶酶解液小于3 kDa超滤组分的结构特性和体外免疫活性测试结果显示，中性蛋白酶解液超滤组分SCH-N-I较其它酶解液超滤组分具有较高的表面疏水性、紫外吸光度和内源荧光强度，且最大紫外吸收波长和最大荧光峰向高波长方向偏移，表明其可能具有更高的免疫生物活性。SCH-N-I作用后巨噬细胞的细胞存活率、细胞吞噬力以及NO释放量均显著高于其它组分。综上所述，不同蛋白酶酶解物均具有激活巨噬细胞、增强机体免疫力的潜在作用，其中SCH-N-I具有较强的免疫活性。
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