近年来，随着科技和经济的发展，人们对多糖功效的研究逐渐深入，铁皮石斛多糖的研究也越来越多。铁皮石斛不仅是名贵中药，也是有着很多生理活性的可食用植物，因其表皮呈铁绿色而得名，又名铁皮兰[1-2]，喜欢生长在半阳半阴、湿润温暖的环境，主要分布于云南、广西、四川等地[3-4]，具有明目滋阴、生津养胃等功效[5]；且常用于治疗“消渴”[6]。
据文献报道多糖是自然界中广泛存在的一类生物大分子，是在蛋白质和核酸之外的又一类生物信息大分子[7-8]。糖类作为生命物质的重要组成成分之一，不仅广泛参与各种生命活动[9]，而且还具有抗病毒、提高机体免疫力、降血糖及降血脂、抗衰老等作用。此外，多糖是益生元成员之一，可以增强肠内吸收、能使体内共存的生物活性小分子组分暴露、还能恢复体内免疫的平衡[10]。
多糖在铁皮石斛现知活性成分中的含量最高，在铁皮石斛发挥药理作用中占主要地位[11]，并且可以用于慢性咽炎、胃炎、糖尿病、肿瘤等的辅助治疗[12-17]，因此铁皮石斛有很高的研究与开发价值。据相关报道，铁皮石斛多糖的提取方法有许多种，其中水浸提法、水提醇沉法、加热回流提取法和酶解法都是采用较早且较多的提取方法。随着经济的发展和技术的革新，许多具有提取周期短、操作简易、提取率高于传统方法等优点的多糖提取方法被发掘应用。基于此，本试验采用超声辅助提取法、超声辅酶提取法、微波辅酶提取法、超声-微波辅助提取法4种方法提取多糖，并测定DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、综合提取率及抗氧化能力筛选出一种较好的提取方式，通过单因素试验和响应面试验优化石斛多糖提取工艺，同时进行体外抗氧化活性和降血糖功效评价，以期为铁皮石斛的综合开发及充分利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
粉状铁皮石斛：郑州市营养与健康食品重点实验室；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、维生素C、30% 双氧水、硫酸亚铁、水杨酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、可溶性淀粉、纤维素酶（≥30 U/mg）、木瓜蛋白酶（≥200 U/mg）（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；α-葡萄糖苷酶（≥33 U/mg）、α-淀粉酶（≥50 U/mg）、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖（生物试剂）：上海源叶生物科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic，DNS，分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（FA1204）：宁波市鄞州华丰电子仪器厂；紫外分光光度计（UV2000）：尤尼柯仪器公司；超声波微波萃取仪（Scientz）：宁波新芝生物有限公司；电热恒温水浴锅（HWS-26）：上海一恒科学仪器有限公司；超声波清洗器（KQ-250E）：昆山市超声仪器有限公司；台式低速离心机（TD5A）：长沙英泰仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 葡萄糖标准曲线的制作
采用苯酚-硫酸法测定[18]，以吸光度对葡萄糖浓度做标准曲线。
1.3.2 不同提取方法对铁皮石斛多糖提取率的影响
1.3.2.1 超声辅助提取法
参照文献[19]的铁皮石斛多糖提取方法，并稍作修改。将粉状铁皮石斛试验原料准确称取2.0 g，去离子水为提取剂，在液料比为50∶1（mL/g）、超声作用功率为250 W、作用时间为30 min的处理方法下提取多糖，然后采用1.3.1中的多糖测定方法，测定多糖样液的吸光度，并根据标准曲线计算出多糖提取率。
1.3.2.2 超声辅酶提取法
结合文献[19]和文献[20]的铁皮石斛多糖提取方法，并稍作修改。将粉状铁皮石斛试验原料准确称取2.0 g，去离子水为提取剂，在液料比为 50 ∶1（mL/g）、酶料比0.02 g/g（木瓜蛋白酶与纤维素酶比例为1∶1）、超声作用功率为250 W、处理时间30 min的试验条件下提取多糖，然后采用1.3.1中的多糖测定方法，测定多糖样液的吸光度，并根据标准曲线计算出多糖提取率。
1.3.2.3 微波辅酶提取法
结合文献[20]和文献[21]文中的铁皮石斛多糖提取方法，并稍作修改。将粉状铁皮石斛试验原料准确称取2.0 g，去离子水为提取剂，在液料比27∶1（mL/g）、酶料比0.02g/g（木瓜蛋白酶与纤维素酶的比例为1∶1）、微波炉中火处理2 min的试验条件下提取多糖，然后采用1.3.1中的多糖测定方法，测定多糖样液的吸光度，并根据标准曲线计算出多糖提取率。
1.3.2.4 超声-微波辅助提取法
结合文献[19]和文献[21]文中的铁皮石斛多糖提取方法，并稍作修改。将粉状铁皮石斛试验原料准确称取2.0 g，去离子水为提取剂，在液料比50∶1（mL/g）、微波作用功率为400 W、作用时间为120 s、超声作用功率为250 W、处理时间30 min的试验条件下提取多糖，然后采用1.3.1中的多糖测定方法，测定多糖样液的吸光度，并根据标准曲线计算出多糖提取率。
1.3.3 单因素试验设计
准确称量1.0 g铁皮石斛粉，提取工艺同1.3.2.4，研究液料比、超声时间、微波时间、微波功率4个因素对铁皮石斛多糖提取率的影响。单因素梯度如表1所示。
表1 单因素试验设计
Table 1 Single-factor experimental design
水平 液料比/（mL/g）超声时间/min微波时间/s微波功率/W 1 40∶1 10 60 250 2 45∶1 20 90 300 3 50∶1 30 120 350 4 55∶1 40 150 400 5 60∶1 50 180 450
1.3.4 响应面试验设计
根据皮尔逊相关系数对单因素试验结果进行筛选，选择对铁皮石斛多糖提取率影响显著性的因素，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面分析试验，对铁皮石斛多糖的超声-微波协同提取工艺进行优化，以获得最佳提取工艺。试验因素和水平设计见表2。
表2 试验设计因素和水平
Table 2 Factors and levels in the experimental design
水平 因素A液料比/（mL/g）B超声时间/minC微波功率/W-1 45 20 300 0 50 30 350 1 55 40 400
1.3.5 铁皮石斛多糖抗氧化活性测定
1.3.5.1 铁皮石斛多糖对羟自由基清除能力的影响
参照秦子芳等[22]的方法并略作修改测定羟自由基清除率。
式中：C1为样品、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢混合液吸光度；C2为样品、硫酸亚铁、无水乙醇、过氧化氢混合液吸光度；C0为蒸馏水、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢混合液吸光度。
1.3.5.2 铁皮石斛多糖对α-葡萄糖苷酶活力的影响
参照武鹏程[23]的方法测定多糖对α-葡萄糖苷酶活力的抑制率。
式中：A1为样品、α-葡萄糖苷酶、PNPG混合液吸光度；A0为磷酸盐缓冲液、α-葡萄糖苷酶、PNPG混合液吸光度。
1.3.5.3 铁皮石斛多糖对α-淀粉酶活力的影响
参照赵姝婷等[24]的方法并略作改动测定多糖对α-淀粉酶活力的抑制率。
式中：A1为样品、α-淀粉酶、淀粉溶液、DNS混合液吸光度；A2为样品、磷酸缓冲液、淀粉溶液、DNS混合液吸光度；A3为蒸馏水、α-淀粉酶、淀粉溶液、DNS混合液吸光度；A4为蒸馏水、磷酸缓冲液、淀粉溶液、DNS混合液吸光度。
1.4 数据处理
采用Excel 2019对单因素试验数据进行处理，使用SPSS 26.0软件对单因素进行显著性分析。运用Design-Expert 10.0中的Box-Behnken中心试验设计进行试验结果进行分析并作图。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的制作
葡萄糖浓度与吸光度之间的标准曲线如图1所示，线性回归方程为 Y=0.017 4X－0.023 4，R2＝0.999 3。
图1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 Standard curve of glucose
2.2 不同提取方法对铁皮石斛多糖提取率的影响
不同提取方法对铁皮石斛多糖的提取效率、抗氧化性会产生不同的影响，我们对不同提取方法铁皮石斛多糖的提取率及相同浓度下的抗氧化性进行分析，结果如表3所示。
表3 不同提取方法对应的提取率及抗氧化性
Table 3 Extraction rate and antioxidant activity corresponding to different extraction methods
注：-表示未检出。
羟自由基清除率/% 超声-微波辅助提取法 30.76 60.75 56.62超声辅助提取法 26.70 57.04 67.94超声辅酶提取法 28.31 58.69 70.07微波辅酶提取法 30.32 59.92 51.75 VC阳性对照 - 99.59 98.82提取方法 多糖提取率/% DPPH自由基清除率/%
由表3可知，在以上4种多糖提取方法中，综合铁皮石斛多糖提取率及抗氧化活性评价结果，确定此次试验采用超声-微波辅助提取法，对铁皮石斛多糖进行提取。
2.3 单因素试验
2.3.1 液料比和超声时间对铁皮石斛多糖提取率的影响
液料比及超声时间对石斛多糖提取率的影响如图2所示。
图2 液料比和超声时间对铁皮石斛多糖提取率的影响
Fig.2 Effects of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharide
（A）液料比；（B）超声时间。不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图2（A）可知，铁皮石斛多糖提取率随液料比增大呈先增大后减少的趋势，在50∶1（mL/g）时提取率最高为29.84% ，并显著高于采用其它液料比时的提取率，故最佳液料比为 50∶1（mL/g）。由图2（B）可知，随着超声时间延长，铁皮石斛多糖提取率显著增加，在超声时间30 min时提取率达29.06% ，继续延长超声时间，铁皮石斛多糖提取率呈显著下降趋势，因为随超声时间的继续延长，可能会使多糖结构发生改变，并有其他物质溶出，导致提取率降低，故最佳超声时间为30 min。
2.3.2 微波时间和微波功率对铁皮石斛多糖提取率的影响
微波时间及微波功率对石斛多糖提取率的影响如图3所示。
图3 微波时间和微波功率对铁皮石斛多糖提取率的影响
Fig.3 Effects of microwave time and microwave power on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharide
（A）微波时间；（B）微波功率。不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图3（A）可知，随着微波时间的增加，铁皮石斛多糖提取率整体呈上升趋势，当微波时间为120 s时，铁皮石斛多糖提取率达到最大值29.40% ，继续延长微波时间，提取率明显呈下降趋势，这是由于一定体积溶液中石斛多糖的溶解度是一定的，当石斛多糖的溶解量已经达到饱和后，继续延长时间，反而会引起溶液局部温度升高，破坏了石斛多糖的结构，使提取率下降，因此，微波时间最佳选择是120 s。由图3（B）可知，铁皮石斛多糖提取率在微波功率为250 W～350 W呈显著上升趋势，随后逐渐下降，即铁皮石斛多糖最佳微波功率为350 W，此时提取率为28.41% 。
2.4 根据皮尔逊相关系数确定关键影响因素
将微波功率、超声时间、液料比、微波时间这4种提取单因素进行相关性分析，结果如表4所示。
表4 各因素对应的皮尔逊相关系数
Table 4 Pearson's correlation coefficients for each factor
注：p＜0.05表示差异显著；皮尔逊相关系数**表示高度显著线性相关；*表示显著线性相关。
因素 显著性p 皮尔逊相关系数微波功率 0.000 0.909**超声时间 0.000 0.894**液料比 0.011 0.636*微波时间 0.066 0.487
由表4可知，根据显著性p以及皮尔逊相关系数，我们在4个单因素中选出微波功率、超声时间、液料比3个关键因素进行响应面设计分析。
2.5 响应面试验设计结果及分析
响应面试验设计分析结果见表5，对表5中的数据进行回归分析处理，结果见表6。
表5 响应面试验设计及结果
Table 5 Response surface test design and results
试验号 A液料比 B超声时间 C微波功率 铁皮石斛多糖提取率/% 1 0 0 0 30.15 2-1 1 0 30.15 3-1 0 -1 27.81 4-1 0 1 28.14 5 0 0 0 29.59 6-1 27.49 7 0 0 0 30.09 1 0 8 0 29.63 9 0 1 1 29.80 0 0 10 0 -1 1 27.45 11 -1 -1 0 24.63 12 1 -1 0 28.83 13 1 1 0 27.74 14 0 0 0 29.23 15 0 1 -1 28.16 16 1 0 1 29.52 17 0 -1 -1 26.53
表6 回归模型方差分析
Table 6 Variance analysis for regression model
注：**表示具有极显著性影响，p＜0.01；*表示具有显著性影响，p＜0.05。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 显著性p模型 35.4 9 3.93 40.35 <0.000 1**A液料比 1.02 1 1.02 10.42 0.014 5*B超声时间 8.84 1 8.84 90.72 <0.000 1**C微波功率 3.03 1 3.03 31.05 0.000 8**AB 10.92 1 10.92 112.08 <0.000 1**AC 0.72 1 0.72 7.41 0.029 6*BC 0.13 1 0.13 1.33 0.286 7 A2 2.85 1 2.85 29.25 0.001 0**B2 4.89 1 4.89 50.18 0.000 2**C2 1.92 1 1.92 19.7 0.003 0**残差 0.68 7 0.097失拟方差 0.097 3 0.032 0.22 0.877 5误差 0.59 4 0.15总离差 36.08 16
由表6可看出，液料比对铁皮石斛多糖提取率有显著影响（p＜0.05），超声时间和微波功率对多糖提取率有极显著影响（p＜0.01）。液料比和超声时间之间存在极显著的交互作用（p＜0.01），液料比和微波功率之间存在显著的交互作用（p＜0.05）。
经逐步回归分析，取得最佳二次回归方程（p<0.05），且回归诊断表明，取得的回归方程良好，由R2Adj=0.9568、R2Pred=0.931 7、信噪比远大于4可知，回归方程拟合度和可信度均很高，能够较好地反映3个变量之间的关系。
回归方程为多糖提取量=-122.390 25+3.758 750A+2.278275B+0.10557C-0.03305AB+1.7AC+3.6BC-0.03291A2-0.010 777 5B2-2.701C2。
2.5.1 响应面交互作用分析
液料比、超声时间、微波功率3个因素两两之间交互作用响应面图如图4所示。
图4 交互作用对铁皮石斛多糖提取率影响的响应面图
Fig.4 The response surface graphs of the effects of interaction on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharide
由图4可知，响应面3D曲面图反映两两因素之间对响应值的影响作用，其中3D曲面图越陡峭，说明两因素之间交互作用越明显[25]。从图4可以看出液料比和超声时间之间存在极显著的交互作用（p＜0.01），液料比和微波功率之间存在显著的交互作用（p＜0.05），超声时间和微波功率之间交互作用不显著（p＞0.05）。该结果与方差分析结果一致。
2.5.2 最优提取工艺参数及验证
通过Design-Expert10.0设计分析得到的超声-微波协同提取铁皮石斛多糖最佳工艺：液料比50∶1（mL/g）、超声时间30 min、微波功率372.76 W，预测铁皮石斛多糖提取率为29.88% 。结合实际操作，提取工艺修订为液料比 50∶1（mL/g）、超声时间 30 min、微波功率370 W。此时铁皮石斛多糖提取率为30.56% ，与模拟预测值接近，说明模型有效。
2.6 抗氧化活性的测定
2.6.1 铁皮石斛多糖对羟自由基清除能力的测定
石斛多糖对羟自由基清除率的测定如图5所示。
图5 铁皮石斛多糖粗提液对羟自由基的清除率
Fig.5 The scavenging rate of Dendrobium officinale polysaccharide crude extract on hydroxyl radicals
不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图5可知，在溶液质量浓度0.5mg/mL～2.5mg/mL范围的试验条件下，铁皮石斛多糖粗提液随着质量浓度的增加，对羟自由基的清除率从45.85% 增加到50.84% ；同一条件下，维生素C的清除率基本保持在97% 以上。虽然试验结果表明维生素C对羟自由基的清除能力明显比铁皮石斛多糖粗提液清除能力强，但铁皮石斛多糖也对羟自由基有一定的清除能力。
2.6.2 铁皮石斛多糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制率的测定
石斛多糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的测定如图6所示。
图6 铁皮石斛粗提多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力
Fig.6 Inhibitory effect of Dendrobium officinale polysaccharide crude extract on α-glucosidase activity
不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
由图6可知，在质量浓度0.1 mg/mL～1.0 mg/mL同浓度梯度范围内，阿卡波糖和铁皮石斛多糖对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率保持在80% 以上，而铁皮石斛多糖粗提液的抑制率从32.83% 增加到54.06% ，增加趋势明显，说明铁皮石斛多糖能使α-葡萄糖苷酶对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷的水解能力降低，从而显现出对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。
2.6.3 铁皮石斛多糖对α-淀粉酶活性抑制率的测定
石斛多糖对α-淀粉酶抑制率的测定如图7所示。
图7 铁皮石斛粗提多糖对α-淀粉酶活性的抑制能力
Fig.7 Inhibitory effect of Dendrobium officinale polysaccharide crude extract on α-amylase activity
不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
由图7可知，在质量浓度0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范围内，随着质量浓度的增加，铁皮石斛多糖粗提液对α-淀粉酶的抑制率由28.05% 增加到36.45% ，在同浓度范围及梯度下，阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率由29.25% 增至59.53% ，有明显的抑制作用。虽然铁皮石斛多糖粗提液对α-淀粉酶活性抑制率低于阿卡波糖，但其也有一定的抑制作用。
3 结论
采用超声-微波协同法提取铁皮石斛多糖，最佳工艺参数为液料比 50∶1（mL/g）、微波时间 120 s、微波功率370 W、超声时间30 min。在此条件下铁皮石斛多糖提取率为30.56% 。由抗氧化试验得知，虽然同一浓度的铁皮石斛多糖粗提液对羟自由基的清除能力，以及对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力均低于相应的阳性对照维生素C和阿卡波糖，但从试验结果可看出铁皮石斛多糖有明显的抗氧化作用和一定的抑制酶活性作用。综上所述，铁皮石斛多糖具有良好的抗氧化及降血糖效果，具有极大的应用价值和开发潜力，但其在生活中的实际应用还需进一步深入研究。
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