1，4-二氢吡啶（1，4-dihydropyridines，1，4-DHPs）是一类广泛用于治疗高血压、心绞痛等心血管疾病的钙通道阻滞剂[1]。这类钙通道阻滞剂主要通过与Ca2+通道结合，导致脱水的Ca2+阻断通道，从而抑制细胞L型钙通道的开放，达到抗压效果[2-3]。1，4-DHPs类降压药种类繁多，已发展出四代药物，包括硝苯地平、贝尼地平[4-5]、巴尼地平[6]、乐卡地平、拉西地平[7]等。由于1，4-DHPs的出色降压效果，一些不法商家在售卖的保健食品中非法添加1，4-DHPs类降压药，导致保健食品成为非法添加化学药物的重点违法区[8]。因此，国家食品药品监督管理总局将尼莫地平、氨氯地平、尼索地平、尼群地平、硝苯地平、非洛地平6种1，4-DHPs类降压药列为保健食品非法添加化学药物[9]。
定量构效关系（quantitative structure activity relationship，QSAR），是通过模型、函数等数学方式，建立化合物理化性质、结构参数与化合物生物特性之间的联系，从而定量描述化学结构与生物活性相关性[10]。目前常用的三维定量构效关系（3-dimensional-quantitative structure-activity relationship，3D-QSAR）模型有比较分子力场分析（comparative molecular field analysis，CoMFA）和比较分子相似性指数分析（comparative molecular similarity indices analysis，CoMSIA），其中 CoMFA模型通过偏最小二乘法（partial least-square，PLS）建立3D-QSAR模型，将立体场、静电场与生物活性联系起来[11]。CoMSIA是作为代替改进CoMFA模型的方法出现，它比CoMFA模型多疏水场、氢键供体场和氢键受体场3个分子场，使CoMSIA三维等势图更容易解释化合物结构与生物活性的联系[12]。3D-QSAR模型诞生于对药物生物活性与其分子结构之间联系的研究，因此在药物设计方面广泛应用，并随着QSAR模型的更新换代，在毒理学、环境科学、材料学等领域也得到应用[13-14]。QSAR模型在食品领域也有一定的应用，主要是对食品抗氧化剂、防腐剂、风味成分、食用成分构效关系的研究[15]。
目前在保健食品领域存在非法添加降压类药物以达到加强保健品降压效果的问题，因此对保健食品非法添加降压药的研究多集中在通过液质联用法[16]、拉曼光谱法[17]等检测手段建立同时检测多种非法添加药物的方法。但是，消费者长期服食非法添加药物的保健食品会出现头疼、恶心、肝损伤等症状，影响身体健康[18]。因此，有必要对这些非法添加药物的急性毒性进行研究，以便后续进行风险评估等更深入的研究。另一方面，通过细胞实验、动物实验对急性毒性进行研究成本巨大，实验耗时较长，应借助3D-QSAR模型等方式来辅助研究。对1，4-DHPs类化合物的研究多集中在对抗结核活性[19]、保肝活性[20]、抗菌活性[21]、抗癌活性[22]等生物活性的研究，而通过3D-QSAR模型的方式研究1，4-DHPs也多集中在新型钙通道阻滞剂的设计上[23]，对运用3D-QSAR模型研究1，4-DHPs毒性的报道较少。因此，本研究利用现有的1，4-DHPs毒性试验数据，通过建立1，4-DHPs急性毒性3D-QSAR模型，研究1，4-DHPs急性毒性的构效关系，探究引起急性毒性变化的可能机制，以期为预测保健食品非法添加1，4-DHPs类药物急性毒性提供可靠的3D-QSAR预测模型，加强设计新型低毒1，4-DHPs类药物的理论基础。
1 3D-QSAR模型的构建
1.1 数据采集与预处理
从PubChem网站上采集11种1，4-DHPs的大鼠口服半数致死量（lethal dose，50% ，LD50）毒性数据（单位mg/kg）和相应三维结构信息，其中LD50毒性数据转化为pLD50（pLD50=lg LD50）形式，作为3D-QSAR模型建模的因变量。11种1，4-DHPs的结构和LD50毒性数据见表1。
表1 1，4-DHPs的结构和生物活性数据
Table 1 Structural and biological activity datas of 1，4-DHPs
注：*表示测试集所包含的1，4-二氢吡啶。
1，4-二氢吡啶CASLD50/（mg/kg）pLD50阿雷地平 86780-90-7 1 459 3.164 1阿折地平* 123524-52-7 1 267 3.102 8西尼地平 132203-70-4 4 412 3.644 6非洛地平 72509-76-3 1 050 3.021 2拉西地平* 103890-78-4 880 2.944 5硝苯地平 21829-25-4 1 022 3.009 5尼鲁地平 22609-73-0 1 469 3.167 0尼伐地平 75530-68-6 1 560 3.193 1尼莫地平* 66085-59-4 2 738 3.437 4尼索地平 63675-72-9 1 257 3.099 3普拉地平 99522-79-9 2 968 3.472 5
1.2 分子构象优化和叠合
在分子动力学程序Minimize模块中选择Tripos标准分子力场、Gasteiger-Huckel分子电荷和Powell梯度算法的优化方法进行能量优化，进一步设置最大重复次数为1 000，优化终止标准Gradient值设置为0.005 kcal/mol（1 cal=4.186 8 J），其余参数均保留SYBYL 2.1.1软件的默认设置值。以上述方法对11种1，4-DHPs的三维分子结构进行优化，得到最低能量构象，用于进行分子叠合。
将11种1，4-DHPs的最低能量构象按照4∶1的比例随机分为训练集和测试集，其中阿折地平和尼莫地平组成测试集，其他1，4-DHPs组成训练集。在训练集中，以毒性最高（即LD50值最小）的拉西地平作为模板分子，选择1，4-DHPs的公共骨架作为叠合骨架，通过Align Database模块进行分子叠合。
1.3 3D-QSAR模型的建立
向叠合好的训练集中导入相应1，4-DHPs的pLD50数据，在PLS回归（偏最小二乘回归）模块选择“Leave-One-Out”（抽一法）计算出交叉验证系数q2和最大主成分数N。再根据最大主成分数N选择非交叉验证法计算3D-QSAR模型的标准偏差SEE、决定系数R2和方差分析F值等表示模型质量高低的参数和各分子场贡献率，其中CoMFA模型分析立体场和静电场对化合物生物活性的影响，而CoMSIA模型在立体场和静电场的基础上增加疏水场、氢键受体场和氢键供体场，更细致研究化合物的构效关系。
1.4 3D-QSAR模型的验证
最好的模型外部验证方式是用具有代表性且足量的预测集来验证模型，并将预测集的预测值与试验值进行比较[24]。因此，本研究通过建立的CoMFA模型和CoMSIA模型，对训练集和预测集共11种1，4-DHPs的pLD50进行预测，再将预测值与试验值进行比较，得出残差。同时，以试验值为横坐标，预测值为纵坐标，做出3D-QSAR模型的散点图来展示试验值和预测值之间的相关性。
1.5 3D-QSAR模型的三维等势图的绘制
CoMFA模型的立体场和静电场，CoMSIA模型在CoMFA模型基础上多出的疏水场、氢键受体场、氢键供体场对化合物生物活性的影响已用贡献率进行展示，但为探究各种分子场对化合物构效关系的具体影响，有必要将各种分子场用不同颜色的三维等势图清楚标注出来。不同分子场具体颜色标识含义如下：立体场中，绿色区域表示增加基团会减少活性，黄色表示增加基团会增大活性。静电场中，红色区域表示增加带负电基团不利于活性，蓝色表示增加带正电基团不利于活性。疏水场中，黄色区域表示增加疏水基团会减少活性，白色表示增加疏水基团会增大活性。氢键受体场中，红色区域表示增加氢键受体基团会增大活性，紫色表示增加氢键受体基团会减少活性。
1.6 3D-QSAR模型应用域的确定
一个3D-QSAR模型对生物活性的预测不可能适用于所有化合物，因而需要对建好的3D-QSAR模型定义一个进行预测的化合物适用范围。本研究采用基于杠杆值的方法[25]来计算3D-QSAR模型的适用范围，并以Williams图进行直观表示。Williams图以杠杆值为横坐标，以标准化残差为纵坐标（一般取±2.5或±3）。若化合物的杠杆值＞标准值h*或标准化残差在±2.5或±3之外，则说明该化合物不在模型的适用范围，不可用该模型预测生物活性。其中h*的计算公式如下。
式中：k为分子描述符的个数；m为样本数量。
1.7 数据分析
采用Excel软件进行数据分析和作图。3D-QSAR模型的分子构象优化、叠合、建立、验证和三维等势图等操作均在SYBYL 2.1.1软件中进行。
2 结果与分析
2.1 分子叠合情况
本研究以毒性最高（LD50值最小）的拉西地平作为模板分子，以1，4-DHPs的公共骨架为基础与训练集其他8种1，4-DHPs进行分子叠合，得到的分子叠合效果见图1。
图1 训练集1，4-DHPs分子叠合效果
Fig.1 Molecular stacking effect of 1，4-DHPs in the training set
由图1可知，训练集1，4-DHPs分子叠合效果较好，公共骨架基本吻合。
2.2 3D-QSAR模型的建立
内部预测能力较好的模型应具备以下条件：交叉验证相关系数（q2）大于0.5，非交叉验证相关系数（R2）大于0.9，显著性检验值F大于100且标准误差SEE越小越好。本研究通过SYBYL 2.1.1软件建立1，4-DHPs急性毒性的CoMFA和CoMSIA模型相关参数如表2所示。
表2 3D-QSAR模型相关参数
Table 2 3D-QSAR model-related parameters
注：S表示立体场；E表示静电场；H表示疏水场；D表示氢键供体场；A表示氢键受体场。
模型 q2 R2 SEE F S E H A D CoMFA 0.509 0.988 0.031 140.06 74.6 25.4 CoMSIA 0.521 0.990 0.029 162.61 14.8 32.4 30.8 22.0 0
由表2可见，本研究所建立的CoMFA和CoMSIA模型具有较好的内部预测能力。从CoMFA到CoMSIA，模型的内部预测能力有所提高；各分子场的贡献率也由立体场占主要部分（74.6% ）转变为静电场和氢键受体场占主要部分（分别为32.4% 和30.8% ），立体场的贡献率由最高（74.6% ）降至最低（14.8% ），而氢键供体场未在模型中有所贡献。
2.3 3D-QSAR模型的验证
为了验证本研究建立的3D-QSAR模型的外部预测能力，对11种1，4-DHPs的LD50值进行预测，再与试验值进行比较，得出的残差如表3所示。以试验值为横坐标，预测值为纵坐标，做出的散点图如图2所示。
表3 3D-QSAR模型的pLD50、预测值和残差
Table 3 Predicted values，pLD50and residuals of the 3D-QSAR models
注：*表示测试集所包含的1，4-二氢吡啶。
CoMFA CoMSIA预测值 残差 预测值 残差阿雷地平 3.164 1 3.157 0.007 1 3.153 0.011 1阿折地平* 3.102 8 3.034 0.068 8 3.120 -0.017 2西尼地平 3.644 6 3.609 0.035 6 3.616 0.028 6非洛地平 3.021 2 3.024 -0.002 8 3.006 0.015 2拉西地平* 2.944 5 2.965 -0.020 5 2.932 0.012 5硝苯地平 3.009 5 3.005 0.004 5 3.043 -0.033 5尼鲁地平 3.167 0 3.174 -0.007 0 3.181 -0.014 0尼伐地平 3.193 1 3.183 0.010 1 3.172 0.021 1尼莫地平* 3.437 4 3.231 0.206 4 3.307 0.130 4尼索地平 3.099 3 3.077 0.022 3 3.107 -0.007 7普拉地平 3.472 5 3.522 -0.049 5 3.506 -0.033 5 1，4-二氢吡啶 pLD50
图2 CoMFA和CoMSIA模型预测值与试验值之间的关系图
Fig.2 Plot between predicted and experimental values of CoMFA and CoMSIA models
A.CoMFA；B.CoMSIA。
由表3和图2可见，CoMFA和CoMSIA模型的残差范围非常小，预测值与试验值非常接近；预测值与试验值的相关性极强（R2＞0.9），表明模型的外部预测能力也较好。
2.4 3D-QSAR模型的三维等势图
2.4.1 CoMFA模型的三维等势图
本研究以毒性最强的拉西地平为模板分子，建立CoMFA模型立体场和静电场的三维等势图，如图3所示。
图3 拉西地平在CoMFA模型中立体场和静电场的三维等势图
Fig.3 Three-dimensional isopotential diagram of lacidipine in the CoMFA model for steric and electrostatic fields
A.立体场；B.静电场。
由图3可知，在立体场，吡啶3，5号位取代基末端和苯环邻位取代基末端为黄色区域，代表增大基团会增强毒性；而3号位取代基末端上方有绿色区域，代表增大基团会减弱毒性。在静电场，吡啶3，5号位取代基末端下方、苯环下方和苯环取代基的羰基位置为蓝色区域，代表增加带正电基团减弱毒性；吡啶3，5号位取代基末端上方为红色区域，代表增加带负电基团减弱毒性。
2.4.2 CoMSIA模型的三维等势图
本研究以拉西地平为模板分子，建立CoMSIA模型立体场、静电场、疏水场和氢键受体场的三维等势图，如图4所示。
图4 拉西地平在CoMSIA模型中立体场、静电场、疏水场和氢键受体场的三维等势图
Fig.4 Three-dimensional isopotential diagram of lacidipine in the CoMSIA model for steric，electrostatic，hydrophobic and hydrogen bond acceptor fields
A.立体场；B.静电场；C.疏水场；D.氢键受体场。
由图4可知，立体场中，吡啶5号位取代基末端和苯环邻位取代基末端为黄色区域，代表该区域增大基团会增强毒性；而3号位取代基末端为绿色区域，代表增大基团会减弱毒性。静电场中，吡啶3号位取代基末端下方、苯环下方和苯环取代基的羰基位置为蓝色区域，代表增加带正电基团减弱毒性；吡啶3号位取代基末端上方为红色区域，代表增加带负电基团减弱毒性。疏水场中，吡啶3号位取代基末端为黄色区域，代表增加疏水基团会减弱毒性；而苯环间位为白色区域，代表增加疏水基团会增强毒性。氢键受体场，吡啶3号位取代基末端下方为红色区域，代表增加氢键受体基团增强毒性；吡啶5号位取代基末端上方为紫色区域，代表增加氢键受体基团减弱毒性。
2.5 3D-QSAR模型的应用域
本研究以纵坐标标准化残差±2.5构成的水平虚线部分和横坐标杠杆值h*=0.818构成的垂直虚线部分表示正常值的边界，若一个化合物的标准化残差或杠杆值超过该范围，则被定性为离群值。用于验证模型应用域的Williams图见图5。
图5 用于验证模型应用域的Williams图
Fig.5 Williams diagram for validating the application domain of the model
由图5可知，CoMSIA模型训练集和测试集的各点均落在由±2.5标准化残差和h*组成的正常值范围内，表明CoMSIA模型适用于1，4-DHPs类钙通道阻滞剂急性毒性的预测。
3 讨论与结论
本研究建立的1，4-DHPs急性毒性3D-QSAR模型的三维等势图表明，1，4-DHPs的急性毒性变化趋势主要受静电场、疏水场、立体场和氢键受体场影响，且影响部位集中在吡啶3，5号位取代基和苯环取代基上。Ioele等[26]建立1，4-DHPs光敏性3D-QSAR模型发现苯环取代基上减小基团或增加疏水性基团有利于光稳定性，而在吡啶2号取代基增大基团或减少疏水性基团有利于光稳定性。El-Moselhy等[27]建立1，4-DHPs体外钙通道拮抗活性3D-QSAR模型发现吡啶3，5号位取代基增加基团和苯环取代基上增加疏水性基团有利于钙通道拮抗活性，苯环取代基上增加负电荷基团不利于钙通道拮抗活性。Xia等[28]建立1，4-DHPs CYP3A4抑制活性3D-QSAR模型发现吡啶3，5号位取代基增加基团有利于抑制CYP3A4活性。综上，表明1，4-DHPs的吡啶3，5号位取代基和苯环取代基上基团的变化会影响1，4-DHPs不同活性的增强或减弱。
本研究建立了具有较高预测能力的1，4-DHPs急性毒性3D-QSAR模型，并探究出1，4-DHPs急性毒性变化的可能机制：主要受立体场、静电场、疏水场和氢键受体场影响，具体表现为吡啶3号位取代基增加大基团、正电基团、疏水基团会减弱毒性，增加氢键受体基团会增强毒性；吡啶5号位取代基增加大基团会增强毒性，增加氢键受体基团会减弱毒性；苯环取代基增加大基团和疏水基团会增强毒性，增加正电基团会减弱毒性。因此，本研究可为保健食品非法添加的地平类降压药1，4-DHPs急性毒性评价提供一个较为可靠的预测模型，同时也可为设计新型低毒1，4-DHPs类似物提供理论依据。
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