2021年世界猪肉产量为10 610万t，其中我国作为肉类消费大国占比为43.35% [1]。肉糜由于其独特的凝胶特性，可以加工成各种肉糜制品，如肉丸、肉饼等。肉糜制品由于口感好、制作方便而深受消费者的青睐。
在肉制品加工中，冷冻是保持其品质最常用的储藏方法之一[2]，可以有效延长肉制品的储藏期。然而，在冷链运输及储藏的过程中，由于温度的波动，不可避免地会出现冻结-解冻（冻融循环）现象。在冻融（freezethaw，F-T）循环中，冰晶的生成会造成严重的机械损伤[3]，致使蛋白质变性，使肉制品汁液损失增加，保水性降低，凝胶特性下降，口感变差。许多研究人员在肉糜中添加冷冻保护剂或采用新型的冷冻解冻技术以防止肉类品质的劣变，冷冻保护剂包括糖类、多元醇及蛋白水解物等[4]。栗俊广等[5]研究发现采用超声波辅助冻结技术可以减少肉制品汁液流失；彭新颜等[6]研究发现乳清多肽可以抑制蛋白质氧化从而改善产品品质。
魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是一种高分子量的非离子型多糖，具有良好的功能特性。魔芋葡甘聚糖是由摩尔比为1∶1.6的D-葡萄糖和D-甘露糖残基组成，在C-6位置有5%～10% 的乙酰基取代基[7]。有研究表明魔芋葡甘聚糖可以充当冷冻保护剂，抑制冷冻对肉糜的破坏作用，Xiong等[8]研究发现魔芋葡甘聚糖可以明显减缓冷冻储藏期间Ca2+-ATP酶活性以及总巯基和活性巯基含量的下降，抑制蛋白变性。Wang等[9]研究发现降解的魔芋葡甘聚糖可以防止疏水蛋白簇的暴露，从而稳定蛋白质的二级构象，起到冷冻保护作用。但魔芋葡甘聚糖的黏度较大，且形成的凝胶对热不稳定。有研究表明KGM通过碱脱乙酰后可以形成具有优异吸水性和增稠特性的热不可逆凝胶[10]，且有研究表明脱乙酰魔芋葡甘聚糖（deacetylated konjac glucomannan，DKGM）被加到鱼糜中，可以明显增强鱼糜的凝胶强度[11]，而DKGM对反复冻融肉糜凝胶品质的影响研究鲜有报道。
本文通过测定F-T中猪肉糜的流变特性及其凝胶的质构、水分含量、水分分布的变化，探究DKGM对反复冻融猪肉糜凝胶品质的影响，以期为肉制品的贮藏提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪后腿肉：郑州丹尼斯百货有限公司；魔芋葡甘聚糖、无水碳酸钠（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
分析天平（AB265-S）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；冷冻干燥机（Lab-1-50）：北京博医康实验仪器有限公司；绞肉机（SZ-22A）：广州旭众食品机械有限公司；恒温水浴锅（HH-42）：常州国华电器有限公司；高速匀浆机（T25）：德国IKA公司；便携式色度仪（CiX62）：美国爱色丽公司；质构分析仪（TA.XT.plus）：英国Stable Micro System公司；旋转流动仪（Discovery）：美国TA仪器有限公司；低场核磁共振仪（NMI20）：纽迈电子科技（苏州）有限公司；肉制品成分分析仪（FoodScanTM Lab）：丹麦福斯有限公司；恒速电动搅拌器（JJ-1A）：常州万丰仪器制造有限公司；高速冷冻离心机（TGL-20KR）：上海安亭科学仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 DKGM的制备
参考宋儒坤[12]的方法并稍作修改。精确称取12 g Na2CO3，完全溶解于2400mL蒸馏水中，然后加入100g魔芋葡甘聚糖，使其浓度为4% ，将混合均匀的溶液置于恒速搅拌器下以1 200 r/min搅拌2 h，然后用体积为DKGM 2倍体积的无水乙醇和蒸馏水交替洗涤（使用恒速电动搅拌器将混合物在1 000 r/min下搅拌30 min，然后用3层纱布过滤），调节其pH值为7，挥干乙醇后，将沉淀物冷冻干燥20 h，得到DKGM。
1.3.2 猪肉糜的制备
肉糜制备在4℃下进行。取新鲜猪后腿肉，剔除肉眼可见的脂肪和筋膜，切碎后置于绞肉机中，3000r/min下搅拌10s，将其混合均匀后平均分为5份，每份150g；称取 5 份冰水，每份 45 g，分别加入 0、0.75、1.50、2.25、3.00 g DKGM和3 g食盐，搅拌均匀后将冰水与DKGM混合物分3次加入到肉糜中，每次3 000 r/min搅拌30 s，将制备好的肉糜分为4份（每份约40 g）置于保鲜袋中，每组重复3个平行，于-20℃冷冻24 h，然后在4℃下自然解冻至样品中心温度达到0℃，记为1个冻融循环，分别进行0、1、3、5次冻融循环。
1.3.3 猪肉糜凝胶的制备
猪肉糜凝胶的制备参考计红芳等[13]的方法进行。称取1.3.2中的猪肉糜于50mL离心管中，4℃、1 000 r/min条件下离心5 min，去除样品中的气泡，然后于80℃的恒温水浴锅中加热30 min，冷却至25℃，于4℃下保存。
1.3.4 猪肉糜蒸煮损失率的测定
测定样品蒸煮形成凝胶前的质量及用滤纸擦干水分后的凝胶质量，蒸煮损失率按照下式计算。
式中：m1为加热前肉糜的质量，g；m2为加热后肉糜凝胶的质量，g。
1.3.5 猪肉糜凝胶质构特性的测定
肉糜凝胶质构的测定参照栗俊广等[14]的方法进行。将肉糜凝胶从4℃冰箱取出，于室温下放置30 min，将凝胶切成高度为25 mm（底面直径为25 mm）的圆柱体，放置于质构分析仪上测定，质构程序参数：探头P36R（直径36 mm），测前速度为2 mm/s，测中速度为1 mm/s，测后速度为2 mm/s，压缩程度选择应变40% ，自动触发力5 g，间隔时间5 s。每组样品测定6个平行。
1.3.6 猪肉糜流变特性的测定
肉糜的温度扫描参照Li等[15]的方法测定并加以修改，采用40 mm平板夹具，测量狭缝为1 000 μm，为防止水分蒸发，样品采用甲基硅油密封，参数设定为在20℃保温5 min，然后从20℃升温至85℃，速率为2℃/min，频率固定为 0.1 Hz。
1.3.7 猪肉糜凝胶水分含量的测定
取一定量的肉糜凝胶置于绞肉机中，3 000 r/min搅拌30 s，然后将其平铺于专用样品盘中，利用肉制品成分分析仪测定其水分含量，每组样品测定3个平行。
1.3.8 猪肉糜凝胶的水分分布测定
参照Zhang等[16]的方法对肉糜凝胶的水分分布进行测定。并采用低场核磁共振成像系统对猪肉糜凝胶中的氢质子密度进行成像扫描，结果用Osiris软件进行伪彩处理。
1.4 数据分析
所有试验至少平行3次，采用SPSS Statistics 25进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，Origin 2019作图。
2 结果与分析
2.1 DKGM对反复冻融肉糜蒸煮损失率的影响
冻融循环中DKGM的添加对猪肉糜凝胶蒸煮损失率的影响见图1。
图1 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜凝胶蒸煮损失的影响
Fig.1 Effect of the additive amount of DKGM on the cooking loss of chopped pork during freeze-thaw cycles
同一冻融次数不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
如图1所示，在反复冻融过程中DKGM添加量小于2.0% 时，均可以显著降低肉糜的蒸煮损失率（P<0.05），在DKGM添加量为1.5% 时，效果最好，当添加量达到2.0% 时，蒸煮损失率再次增大；在F-T循环过程中，冰晶生长破坏了蛋白质的结构，从而影响其凝胶网络结构的形成，导致肉糜持水性降低[17]，因此随着冻融次数的增加，蒸煮损失逐步升高。经过5次F-T后，DKGM的添加显著降低了肉糜凝胶的蒸煮损失率，DKGM添加量为1.5% 时，蒸煮损失率最小（P<0.05）。这是由于DKGM可以和水分子通过氢键分子偶极等作用形成络合物，同时DKGM的加入增强了蛋白质分子间的疏水相互作用[18]，从而改善了肉糜的凝胶网络结构，增强了其持水性，抑制了F-T后肉糜蒸煮损失的增加，当DKGM添加量为2.0% 时，肉糜凝胶原有的网络结构可能被破坏，强疏水相互作用使蛋白质过度变性，重新聚集，从而导致蒸煮损失率增大。
2.2 DKGM对反复冻融肉糜质构的影响
冻融循环中DKGM的添加对猪肉糜凝胶硬度、弹性、粘结性和咀嚼性的影响见表1。
表1 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜质构的影响
Table 1 Effect of the additive amount of DKGM on the textural properties of chopped pork during freeze-thaw cycles
冻融次数DKGM添加量/% 硬度/g 弹性 粘结性 咀嚼性/g 0 0 5 000.33±356.89Cb 3 211.82±173.78Bb 0.5 5 047.23±159.43Bb 0.89±0.01Acd 0.70±0.01Ac 3 280.44±185.35Bb 1.0 4 940.37±176.91Bb 0.91±0.01Abc 0.72±0.01Ab 3 307.24±53.94ABb 1.5 5 656.70±213.75Ca 0.93±0.01Ab 0.71±0.01Cb 3 116.63±102.49Bb 1 0 5 843.21±69.96Aab 3 716.08±232.18Aa 2.0 4 809.16±179.58Cb 0.95±0.02Aa 0.73±0.01Aa 0.88±0.03Ad 0.72±0.01Ab 3 496.19±270.10Aab 0.5 5 804.00±241.31Aab 0.87±0.01Ac 0.63±0.01Bc 3 717.75±291.42Aa 1.0 5 238.45±333.32Ac 0.91±0.01Ab 0.71±0.02Ab 3 377.05±131.69ABb 1.5 6 132.99±45.72Aa 0.92±0.01ABab 0.73±0.01Aa 3 634.97±68.91Aab 3 0 5 639.19±52.36ABb 3 546.80±84.65Bab 2.0 5 584.78±159.67Ab 0.94±0.01ABa 0.73±0.01Aa 0.89±0.01Ac 0.72±0.01ab 3 015.59±79.05Bd 0.5 5 064.74±190.33Bc 0.83±0.01Be 0.63±0.01Bc 3 153.74±95.25Cbc 1.0 5 045.00±198.04ABc 0.88±0.01Bd 0.70±0.02ABb 3 270.50±136.65Bb 1.5 5 850.59±120.41Ba 0.91±0.01ABb 0.72±0.01BCa 3 418.81±73.14Ba 2.0 5 581.62±97.28Ab 0.93±0.01Ba 0.72±0.01Aa 0.89±0.01Ac 0.72±0.00Aa 3 130.63±58.88Bcd
续表1 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜质构的影响
Continue table 1 Effect of the additive amount of DKGM on the textural properties of chopped pork during freeze-thaw cycles
注：不同小写字母表示同一冻融次数差异显著（P<0.05）；不同大写字母表示同一DKGM添加量差异显著（P<0.05）。
冻融次数DKGM添加量/% 硬度/g 弹性 粘结性 咀嚼性/g 5 0 5 364.16±154.78Bab 2 651.75±71.21Cd 0.5 5 135.48±165.25Bb 0.80±0.02Cc 0.58±0.02Cc 3 006.02±119.66Cc 1.0 5 123.84±229.43ABb 0.89±0.01Bb 0.69±0.02Bb 3 430.13±37.43Aa 1.5 5 463.12±152.64Da 0.93±0.01ABa 0.72±0.01Ba 3 123.86±64.73Bb 3 525.60±24.79Ba 2.0 5 122.20±199.59Bb 0.93±0.02Ba 0.73±0.02Aa 0.89±0.01Ab 0.72±0.01Aa
由表1可知，在未经过冻融的处理组中，肉糜凝胶的硬度、弹性、粘结性和咀嚼性在DKGM添加量为1.5% 时达到最大值；且所有样品的硬度均在冻融循环1次后达到峰值然后下降；与冻融0次相比，在冻融1次后，所有样品的弹性均无显著差异，与冻融1次相比，在冻融3次和5次后，对照组的弹性显著降低（P<0.05），而DKGM添加量为1.0% 和1.5% 以及2.0% 的弹性无显著差异。且在冻融循环后，处理组的弹性和粘结性均高于对照组，冻融循环的次数越多则差距越明显，Neito等[19]指出这是由于蛋白与多糖之间的协同作用，同时由于多糖分子充当了凝胶结构中的活性填料从而提升了其凝胶强度[20]，质构特性也随之提升。
2.3 DKGM对反复冻融肉糜流变特性的影响
储能模量（storage modulus，G′）的变化表示了蛋白质黏弹性变形过程中能量的储存，G′越大，则表示材料的弹性越大[6]。冻融循环中DKGM的添加对猪肉糜凝胶硬度、弹性、粘结性和咀嚼性的影响见图2。
图2 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜流变特性的影响
Fig.2 Effect of the additive amount of DKGM on the rheological properties of chopped pork during freeze-thaw cycles
a.鲜肉；b.冻融循环1次；c.冻融循环3次；d.冻融循环5次。
如图2a所示，随着DKGM的添加，G′逐步增大，且在添加量为1.5% 时达到最大值，且随着冻融次数的增加，猪肉糜的G′整体呈下降趋势，本研究结果与邓文辉等[21]的研究结果一致，经过反复冻融的肌原纤维蛋白的G'均低于未反复冻融的。DKGM的加入改变了蛋白质展开和交联的速率，促进了蛋白分子之间的交联，形成了更好的凝胶网络结构，Zhang等[22]研究表明DKGM的加入有利于增强蛋白质凝胶网络中的氢键，从而防止加热阶段蛋白质间的聚集，同时DKGM的添加还可以增强蛋白质间的疏水相互作用，氢键和疏水相互作用的共同调节作用使其形成了更好的凝胶网络结构。
2.4 DKGM对反复冻融猪肉糜水分含量的影响
保水性是影响肉糜品质的重要指标。冻融循环中DKGM的添加对猪肉糜凝胶水分含量的影响见图3。
图3 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜水分含量的影响
Fig.3 Effect of the additive amount of DKGM on the water content of chopped pork during freeze-thaw cycles
不同小写字母表示同一冻融次数差异显著（P<0.05）。
如图3所示，随着DKGM添加量的增加，肉糜凝胶的水分含量先增大后减小，未经过冻融的处理组中1.0% 、1.5% 、2.0% 处理组之间没有显著差异。随着冻融次数的增加，对照组的水分含量明显降低，反复冻融循环导致冰晶再结晶，破坏了肌肉纤维的完整性，毛细管的持水力减小，从而导致水分流失增加[23]，肉糜凝胶的水分含量减小。添加了DKGM样品的水分含量表现出与蒸煮损失相同的趋势，在添加量为1.5% 时，水分含量最大，表明DKGM的添加可以延缓肉糜冻融循环过程中的水分流失，从而延缓其凝胶特性的下降。
2.5 DKGM对反复冻融肉糜水分分布的影响
采用低场核磁共振技术检测F-T中猪肉糜凝胶的水分含量，结果见图4。脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜凝胶水分分布的影响见图5。
图4 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜水分含量的影响
Fig.4 Effect of the additive amount of DKGM on the water content of chopped pork during freeze-thaw cycles
0、1、3、5表示不同冻融次数。不同小写字母表示同一冻融次数差异显著（P<0.05）。P20为结合水；P21为不易流动水；P22为自由水。
图5 脱乙酰魔芋葡甘聚糖添加量对反复冻融肉糜水分分布的影响
Fig.5 Effect of the additive amount of DKGM on the water distribution of chopped pork during freeze-thaw cycles
如图4所示，所有样品中均显示出3种组分，分别为 P20、P21、P22。P20为与大分子紧密结合的结合水，P21为被困在凝胶网络中的不易流动水，P22为毛细管中的自由水，流动性最强[24]。在冻融循环过程中，所有处理组的P21比例均显著降低（P<0.05），P22的比例升高，添加DKGM后，减缓了P21比例的减小和P22比例的增大（P<0.05），在添加量为1.5% 时，P21的比例达到最大，可能由于在冻融循环过程中水分的迁移速率大于冰晶形成速率从而导致水的再分配[2]，DKGM的添加延缓了水分的迁移速率，阻碍了水分子的迁移，从而增大了不易流动水的含量，使形成的凝胶网络结构更加稳固。
为了进一步研究肉糜中不易流动水的分布状态，采用低场核磁共振技术测定肉糜凝胶中的H质子密度，结果进行伪彩处理。图5中从上到下依次代表不易流动水含量的降低以及结合强度的减弱[25]。从图5中可以看出，随着冻融次数的增加，分界颜色分布越来越不均匀，冻融循环3次后，处理组的肉糜凝胶成像颜色均匀度较高，特别是在添加量为1.5% 时，DKGM的强疏水性使其形成了更小更均匀的凝胶网络结构，从而使肉糜凝胶的保水性提高。
3 结论
研究结果表明，添加DKGM可以明显改善反复冻融肉糜的流变特性、质构特性及保水性，且添加量为1.5% 时效果最佳，1次F-T后，G'可达到鲜肉组水平，5次F-T后，质构特性与鲜肉组无明显差异；水分分布的结果进一步说明DKGM可以调节F-T中肉糜水分的流失，从而延缓其凝胶品质的劣变。推测是由于DKGM的加入影响了蛋白质分子间的疏水相互作用，对蛋白质结构形成了保护作用，从而改善了其凝胶网络结构；也可能是由于DKGM的加入影响了蛋白质与蛋白质之间的相互作用，从而影响了Ca2+-ATP酶活性的变化，起到了冷冻保护作用，而DKGM对猪肉糜凝胶特性及其蛋白质的冷冻保护机制还有待研究。
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