淀粉酶是酶制剂中最早投入工业化生产的酶类，据统计淀粉酶产量已经占据酶制剂市场的30%以上[1]。淀粉酶按照淀粉水解产物的异头碳构型进行分类可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶[2]，其中α-淀粉酶较为常见，广泛用于生产葡萄糖、果糖和环糊精[3]，在食品、纺织品、纸张、洗涤剂和生物燃料等行业中发挥重要作用，是目前市场上主流淀粉酶品种[4]。在淀粉加工、烘焙、酿造、造纸过程中常常要求高温蒸煮加工等高温环节，因此，耐高温α-淀粉酶凭借热稳定性可在高温环境中发挥酶解作用[5]。
目前，耐高温α-淀粉酶已从动植物[6]、微生物[7]等多种来源中分离获得。相比之下，从微生物来源获得耐高温α-淀粉酶，因其成本低、生产效率高、易优化等优点被广泛用于工业生产中[8]。有研究表明能够产耐高温α-淀粉酶的微生物主要有Bacillus[9]、Geobacillus[10]、Parageobacillus[11]、Anoxybacillus[12]、Streptomyces[13]、Paecilomyces[14]等属，但在火山口、温泉、地热区等常年处于高温的环境中，还存在着许多未知的野生型耐高温淀粉酶资源，可进行深入发掘为耐高温淀粉酶的开发提供参考。
21世纪以来，耐高温淀粉酶产业在欧美形成规模化生产并在全球淀粉制糖行业广泛应用。中国业界从引入外源基因、构建重组高效工程菌株入手，实现了耐高温α-淀粉酶的改良表达，使得该产业从最初的野生菌株发酵转变为精准调控的工程菌可调控的规模化生产模式[15]。目前，研究者们仍在继续筛选优良菌株、挖掘本土耐高温α-淀粉酶基因、通过基因工程提高其产酶能力及酶活。本文从高温土壤中分离获得一株热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）Y62，探究其生产耐高温淀粉酶的能力，并对其所产的耐高温淀粉酶进行分析，通过基因工程技术对该菌株所产耐高温淀粉酶进行异源表达，以期为今后的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品采集：土壤样品为2018年6月采集自青岛市食品经营摊位常年热油覆盖土壤，采样深度为地表5cm～10 cm。
T4 DNA 连接酶、胶回收试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、限制性内切酶（EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ）、硫酸卡那霉素：上海生工生物工程有限公司；基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒：北京天根生化科技有限公司；胰蛋白胨、蛋白胨:北京双旋微生物培养基制品厂；酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限公司；琼脂：德国Biofroxx 公司；麸皮：市售；其余非特殊注明试剂均为分析纯。
菌株和质粒：大肠杆菌BL21（DE3）和质粒pET-28a（+）。
1.2 仪器与设备
电子分析天平（JA2003）：上海津平科学仪器有限公司；高速冷冻离心机（CR21N）：日立HITACHI 公司；生物显微镜（YS100）：日本NIKON 公司；恒温振荡培养箱（THZ-C）：苏州培英实验设备有限公司；超净工作台（SW-CJ-1D）：苏州净化设备有限公司；50L 发酵罐：江苏丰泽生物工程设备制造有限公司；生化培养箱（SPX-250B-Z）、全自动高压灭菌锅（YXQ-LS-75S11）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外可见分光光度计（UV-9000S）：上海元析仪器有限公司；聚合酶链式反应仪（CFX96）、电泳仪（Power PAC 3000）、全自动凝胶成像仪（GelDoc XR+）：美国BIO-RAD 公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基的配制
LB（Luria-Bertani）培养基：10 g/L NaCl、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉。
淀粉培养基：10 g/L NaCl、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L酵母浸粉、2 g/L 可溶性淀粉、20 g/L 琼脂。
种子培养基：10 g/L 蛋白胨、5 g/L NaCl、5 g/L 牛肉浸粉，pH9.0。
发酵培养基：30 g/L 麸皮、5 g/L 酵母浸粉、5 g/L CaCl2、1 g/L K2HPO4，pH9.0。上述培养基均在121 ℃灭菌20 min。
1.3.2 产耐高温淀粉酶菌株筛选及鉴定
取1 g 土样加入到50 mL LB 液体培养基中，65 ℃、180 r/min 恒温振荡培养箱富集培养24 h。取1 mL 培养液加入到9 mL 无菌水中进行梯度稀释，取合适梯度的稀释液涂布于LB 固体培养基上，65 ℃培养16 h。待长出单菌落后，利用划线法进行分离纯化。纯化得到的菌种在淀粉培养基平板上点板，65 ℃培养16 h，测量透明圈直径/菌落直径（D/d）值，挑选比值较大的菌株进行液体复筛。70 ℃下测量发酵液酶活，筛选出酶活最高的菌株（编号Y62），甘油-80 ℃保藏。
参照《常见细菌系统鉴定手册》[16]对Y62 进行生理生化实验。同时，对菌株进行革兰氏染色，并用透射电镜观察Y62 的菌体形态特征。
1.3.3 16S rRNA 基因序列分析及系统发育树构建
以Y62 菌株的基因组DNA 为模板，采用细菌16S rRNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR 产物送上海生物工程股份有限公司进行测序。测序结果在GeneBank 中进行BLAST 比对，采用Neighbor-Joining 法构建系统发育树。
1.3.4 液体深层发酵与酶的提取
耐高温淀粉酶的液体深层通气发酵在50 L 不锈钢发酵罐上完成。将菌株Y62 接种于种子培养基后，65 ℃摇瓶培养16 h，制取种子，接种量控制在1%。50 L 发酵罐中装液量为20 L，发酵温度为65 ℃，发酵培养基初始pH9，罐压设定为0.5 kg，发酵时间为48 h，发酵罐的电极校正和灭菌等操作按照发酵罐说明书执行。
菌株Y62 经过中试规模液体深层发酵后发酵液经4 ℃、8 000 r/min 离心15 min，合并上清液。在冰水浴条件下，向上清液中加入研磨后的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别达到30%、40%、50%、60%、70%，冰上静置2 h 后，4 ℃、8 000 r/min 离心15 min 保留上清。再分别向上述上清液中补加硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到40%、50%、60%、70%、80%，充分溶解后冰中静置2 h，4 ℃、8 000 r/min 离心收集沉淀物。所得沉淀用适量的磷酸缓冲盐溶液溶解，分别取5 μL 混合液至淀粉培养基平板上，置65 ℃培养过夜后，平板中加入适量碘液静置1-2 min，观察透明圈[17]。同时，对样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测。
对中试发酵后的菌液和硫酸铵沉淀得到的粗酶液分别进行酶活的测定，求比值计算酶的回收率。
1.3.5 淀粉酶热稳定性检测
将经过硫酸铵分级沉淀后所得的粗酶液在50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 ℃下水浴10 min，按照《新编酶制剂实用技术手册》[18]中的方法进行酶活检测并计算淀粉酶的失活率。
1.3.6 耐高温淀粉酶异源表达及纯化
1.3.6.1 目的基因扩增与表达载体构建
以NCBI 数据库中Geobacillus 属编码淀粉酶的基因序列为基础，用Primer 5 软件设计该基因上下游引物EDYFF（5'-GGAATTCATGGGGAACCGGCTTTTTATGCT-3'）和EDYRR（5'-CCCTCGAGTTATTCATTTGTCCGTTTTGTTCGTTTTTTCACC-3'），酶切位点分别为EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ。以Y62 的基因组DNA 为模板，扩增EDY 基因，分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对扩增片段和质粒载体pET-28a 进行双酶切。采用胶回收试剂盒对酶切产物进行胶回收。用T4 连接酶在16 ℃条件下连接8 h～12 h 后，热激转化大肠杆菌DH5α，转入LB 液体培养基中，37 ℃、150 r/min 振荡培养90 min 后，取100 μL 均匀涂布于含有50 μg/mL 硫酸卡纳霉素的LB 平板上，37 ℃恒温培养16 h。待长出菌落后，对其进行PCR 鉴定，结果为阳性的菌落进行质粒提取并进行双酶切验证，筛选出阳性转化子后送至上海生物工程股份有限公司测序。
1.3.6.2 淀粉酶基因诱导表达与蛋白纯化
提取重组质粒pET-28a-EDY，热激转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取单菌落于含50 μg/mL 硫酸卡那霉素的LB 培养基中，37 ℃180 r/min 培养至菌液OD600 到0.8 左右。加入0.1 mmol/L 的IPTG 诱导表达3 h，所得菌液4 ℃、8 000 r/min 离心10 min 收集菌体，用磷酸缓冲盐溶液洗涤2 次后重悬。对重悬菌体进行超声破碎（功率750 W）后离心，分别取上清液和沉淀，进行SDS-PAGE 检测，分析观察目的蛋白条带。上清液过Ni 柱纯化目的蛋白，收集到的洗脱液处理后进行SDS-PAGE 检测，分析蛋白纯化效果。
1.3.7 淀粉酶的鉴定和结构预测
将纯化后的淀粉酶进行SDS-PAGE 检测，切下目的条带送往上海生工生物工程有限公司检测其分子量和相关数据。对所表达的耐高温α-淀粉酶EDY 进行跨膜预测（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、蛋白三级结构预测（https://www.swissmodel.expasy.org/）以及保守结构域分析等。
1.4 数据处理与统计分析
数据采用SPSS 23 进行单因素方差分析，利用邓肯多重检验评定样品间差异性，显著水平为P＜0.05；采用Excel 2016 对数据进行整理并绘图。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选与生理生化
通过平板初筛、酶活复筛，最终从常年有热油覆盖的土壤中获得一株具有耐高温淀粉酶活性的优良菌株Y62。菌株Y62 形态特征见图1。
图1 菌株Y62 形态特征
Fig.1 Morphological characteristics of the strain Y62
a.LB 平板上的菌落形态；b.淀粉平板上的透明圈；c.透射电镜图。
由图1a 可知，在LB 平板上65 ℃培养16 h 后，Y62 菌落直径约4 mm～5 mm，呈米白色、菌落平坦、不规则、有叶状边缘。由图1b 可知，在淀粉平板上呈现出具有明显的透明圈。由图1c 可知，该菌株革兰氏染色呈阴性，通过透射电镜观察，菌株呈直杆状，两端为圆形，周生鞭毛。通过触酶试验、吲哚试验、V-P 试验等生理生化性质鉴定，Y62 菌株的理化性质如表1所示。
表1 菌株生理生化实验
Table 1 Physiological and biochemical tests of the strain
注：+表示阳性；-表示阴性。
试验项目菌株Y62热反硝化地芽孢杆菌淀粉水解试验++葡萄糖发酵++蔗糖发酵++麦芽糖发酵++V-P 试验--尿酶试验--吲哚试验--过氧化氢酶试验++硝酸盐还原试验++
参照文献[19]中的描述，由表1可知，该菌株理化性质与热反硝化地芽孢杆菌（Geobacillus thermodenitrificans）所描述一致。
Geobacillus 属是2001年从Bacillus 属分离出来重新命名的，该属的菌株具有嗜热的特点，大多数能在55 ℃以上生长，并且该属的菌株具有合成耐高温生物酶的潜在价值[20]。Geobacillus 属细菌的细胞壁虽然为革兰氏阳性结构，但是革兰氏染色后的结果会呈现阳性或者阴性[19]，本研究筛选出的菌株Y62 革兰氏染色结果为阴性。
2.2 16s rRNA 基因序列鉴定
对Y62 的16S rRNA 基因扩增后测序，将其核苷酸序列输入到NCBI 数据库中，进行BLAST 比对，结果显示菌株 Y62 与Geobacillus thermodenitrificans strain BGSC 94A1（模式菌株）序列相似性为99.86%，利用软件MEGA 7.0 构建菌株Y62 的系统发育树，结果见图2。
图2 根据16S rRNA 序列构建的菌株Y62 系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of the strain Y62 based on 16S rRNA sequence
由图2可知，结合菌株Y62 的形态学、生理生化特性和16S rRNA 的鉴定结果，最终鉴定Y62 菌株为热反硝化地芽孢杆菌（G.thermodenitrificans）。将其送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.17559。
2.3 耐高温淀粉酶的中试工程化发酵及粗酶的提取
菌株Y62 经过中试规模50 L 液体深层发酵48 h后，发酵液酶活达到112.7 U/mL。上清液经过硫酸铵一步法沉淀得到的粗酶酶活为101.6 U/mL，酶回收率达90.2%。此结果说明采用简单的硫酸铵沉淀法即可实现该淀粉酶的分离提取，也展示出Y62 菌株的简单蛋白谱利于下游目标蛋白的工程化分离。
50%～60%硫酸铵浓度区间所得蛋白见图3。
图3 50%～60%硫酸铵浓度区间所得蛋白
Fig.3 Proteins obtained with 50%-60% ammonium sulfate
M 为marker；1 为50%～60%硫酸铵浓度粗酶液。
由图3可知，经硫酸铵分级沉淀后，在50%～60%硫酸铵浓度区间所得沉淀，具有降解淀粉的活性。SDSPAGE 电泳显示在分子量约60 kDa 处具有单一的蛋白条带，可能为菌株Y62 所产的淀粉酶。因此，将50%～60%硫酸铵沉淀所得蛋白作为粗酶，进行后续研究。
2.4 淀粉酶热稳定性研究
在工业生产中，会有很多高温加工过程，因此对具有良好热稳定性的耐高温淀粉酶需求较大。为测试该菌株所产淀粉酶在不同温度下的失活率，对粗酶进行了热稳定性研究，结果如图4所示。
图4 淀粉酶的热稳定性
Fig.4 Thermal stability of the amylase
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，淀粉酶在80 ℃条件下仍能保持80%以上酶活性，温度高于80 ℃时淀粉酶酶活下降较快。当温度升至90、95 ℃和100 ℃时，该酶分别保持58.4%、49.2%和37.8%的酶活性，表明该酶具有良好的耐高温潜质。
Burhanoglu 等[21]研究发现，菌株Geobacillus sp.GS33所产耐高温α-淀粉酶在65 ℃下保留了50%的残留活性，16 h 后在85 ℃下仅保留了20%的活性。从印度温泉分离出一株G.thermoleovorans K1C，其所产α-淀粉酶活性的最适温度为80 ℃，但在有底物存在情况下该酶的热稳定性增加[22]。G.thermodenitrificans Y62 所产淀粉酶的活性，随着温度升高其酶活逐渐降低，但该酶在100 ℃时仍能维持37.8%的相对酶活，相比于同一菌种的其他菌株所产的α-淀粉酶的热稳定性，该淀粉酶热稳定性更高，可耐受大多数工业过程的高温操作。
2.5 淀粉酶基因的克隆与表达
利用上下游引物对目的基因进行PCR 扩增、测序，其基因大小为1536 bp，将核酸序列上传至国家微生物科学数据中心（National Microbiology Data Center），基因编号：NMDCN00011OH。将扩增得到的目的基因连接到质粒载体pET-28a 上，通过双酶切验证，成功构建了目的基因的重组质粒pET-28a（+）-EDY，重组质粒双酶切结果见图5。
图5 重组质粒双酶切
Fig.5 Enzymatic digestion for the recombinant plasmid
M 为DL5000 DNA marker；1 为pET-28a；2 为pET-28a 双酶切；3 为pET-28a-EDY 双酶切。
提取重组质粒pET-28a（+）-EDY 转入大肠杆菌BL21（DE3）中，构建表达该蛋白酶的基因工程菌BL21（DE3）-pET-28a（+）-EDY。以IPTG 为诱导物诱导目的基因表达，结果显示在诱导3 h 的发酵液中约60 kDa处出现了目的条带，淀粉酶诱导表达电泳图见图6。对BL21-pET-28a-EDY 进行诱导表达后，分别对超声破碎后的上清和沉淀进行电泳检测，分析表达产物为可溶性蛋白还是包涵体，结果见图7。随后对异源表达出的淀粉酶进行纯化，纯化出的淀粉酶电泳图见图8。
图6 淀粉酶的诱导表达
Fig.6 Induced expression of amylase
M 为marker；1 为BL21-pET-28a-EDY诱导；2 为BL21-pET-28a 诱导。
图7 可溶性蛋白的表达
Fig.7 Expression of soluble protein
M 为marker；1、2 分别为0.08 mmol/L IPTG，14 ℃下诱导17 h 后，破碎后上清和破碎后沉淀。
图8 淀粉酶的纯化
Fig.8 Purification of the amylase
M 为marker；1 为纯化后得到的目的蛋白。
由图6可知，箭头所指蛋白条带为目的蛋白，分子量在60 kDa 左右。
由图7可知，该蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中，将沉淀破碎后的上清液和沉淀进行蛋白质电泳，破碎后上清有着明显的可溶性蛋白。
由图8可知，大部分目的蛋白存在于沉淀中，经Ni 柱纯化，咪唑浓度为250 mmol/L 时，得到单一较纯的目的蛋白。
2.6 淀粉酶质谱测定
纯化后的目的蛋白送往上海生物工程股份有限公司进行检测分析，结果如图9所示。
图9 目的蛋白质谱检测结果
Fig.9 Mass spectrometry results of the target protein
由图9可知，蛋白质检测为α-淀粉酶，编码511个氨基酸序列，与预测结果完全一致。对目的基因EDY的核苷酸序列进行建库，将蛋白酶解得到谱图后，与理论谱图进行拟合比对，从而鉴定相应的肽段，比对后的序列覆盖率为77%，与NCBI 预测结果基本一致，可确定导入到大肠杆菌BL21 中的基因片段即为淀粉酶基因。
2.7 跨膜预测
使用ExPASy 服务器的ProtParam 功能对编码蛋白进行预测，结果表明预测蛋白等电点为5.65，分子量为59.86 kDa，分子式为C2748H4149N705O770S15，不稳定指数为32.9，脂溶指数为81.62，亲水性分析的GRAVY值为-0.461，为疏水性蛋白。利用蛋白跨膜区预测软件TMHMM 对编码蛋白的跨膜区域进行分析，结果见图10。
图10 EDY 编码蛋白跨膜区分析
Fig.10 Analysis on the transmembrane domain of EDY
由图10可知，该蛋白有2 个跨膜区域，分别位于N 端5 个～24 个氨基酸残基和C 端480 个～502 个氨基酸残基，可确定该基因编码的蛋白为跨膜蛋白。
2.8 三级结构预测
使用SWISS-MODEL 对Y62 的α-淀粉酶EDY 的三级结构进行预测，结果见图11。
图11 三级结构预测结果
Fig.11 Tertiary structure prediction results
由图11可知，Y62 的淀粉酶模型GMQE 值为0.85，与菌株G.thermoleovorans CCB_US3_UF5 的α-淀粉酶GTA（4e2o.1.A）结构高度相似，相似度为93.58%。G.thermoleovorans CCB_US3_UF5 分离自马来西亚群岛温泉，该菌在60 ℃时生长最快，并且可以在高达70 ℃的温度下存活。α-淀粉酶GTA 编码513 个氨基酸，有3 个典型的结构域，预测有2 个Ca2+结合位点，1个被Ca2+强烈结合，1 个则是无序结构，虽然添加CaCl2并未增强酶的活性，但CaCl2 存在时，GTA 的热稳定性明显提高。GTA 有两个富含芳香残基的区域，但不存在明显的淀粉结合结构域[23]。与其他α-淀粉酶相比，GTA 具有较小的结构域B 和几个较短的环，具有最紧密的α-淀粉酶折叠，这可能有助于其与Ca2+紧密结合和热稳定性。Y62 的淀粉酶EDY 编码511 个氨基酸，与GTA 的结构高度相似，也预示着具有相似的理化性质。
2.9 同源序列比对与保守结构域分析
氨基酸序列比对见图12。
图12 氨基酸序列比对
Fig.12 Sequence alignment of amino acid
3 个严格保守的催化残基用黑色三角形表示，2 个Ca2+结合的残基分别用白色和黑色菱形表示，催化位点I～III 用方框表示。
由图12可知，Y62 的α-淀粉酶EDY 与菌株G.thermoleovorans CCB_US3_UF5 的α-淀粉酶GTA 序列进行比对，同样具有3 个催化位点，分别为PGGYHGY（96～102）、YDHPWL HDPAKKD（145～157）、GWVYGL（177～182）；3 个严格保守的催化残基D215 位的天冬氨酸（Asp）、E244 位的谷氨酸（Glu）和D312 位的天冬氨酸；2 个Ca2+结合位点，与三级结构预测结果相一致。
3 结论
本研究从高温土壤中筛选获得了一株产耐高温α-淀粉酶的热反硝化地芽孢杆菌Y62。在摇瓶发酵基础上成功进行了50 L 中试规模液体深层通气上游工程化发酵生产，发酵液酶活达到112.7 U/mL。采用简便的硫酸铵一步沉淀法实现了淀粉酶的下游提取，回收率达90.2%。所获得的耐高温淀粉酶提取物在不加任何保护剂的条件下表现出较优秀的热稳定性，在100℃的条件下仍能保持37.8%的活性。结果表明，Y62 是一株具有工业化潜质的耐高温淀粉酶产生菌株，若假以蛋白质工程手段对其进行分子水平的结构优化，或可成为高效表达耐高温淀粉酶的优良工程化菌株。
本研究对Y62 的耐高温淀粉酶基因成功地进行了异源表达。SDS-PAGE 检测比对结果确认所表达的蛋白与菌株Y62 中试发酵所产耐高温淀粉酶蛋白一致。生物信息学分析显示该耐高温淀粉酶等电点为5.65，分子量为59.86 kDa，分子式为C2748H4149N705O770S15，为疏水蛋白，其蛋白三级结构与已报道的G.thermoleovorans CCB_US3_UF5 所产α-淀粉酶GTA 结构高度相似，有进一步开发的应用潜力。
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