酵母蛋白是酵母经超微粉碎、酶解、碱处理、酸沉、离心、洗涤、喷雾干燥等工艺处理后得到的产物[1]，其蛋白质含量50%～80%，氨基酸配比合理[2]，低脂肪无胆固醇，有较高的消化率[3]，具有调节肠道菌群、抗骨骼肌衰老等作用[4]。在酵母蛋白生产过程中，培育酵母细胞不受季节环境的影响，且生产周期短、发酵成本低、绿色环保。但是酵母细胞中核酸含量较高[5]，核酸经人体消化会水解为嘌呤，最终代谢为尿酸，人体没有能分解尿酸的酶[6]。长期食用含有大量核酸或嘌呤的食品，会导致尿酸在体内积累过多引起高尿酸血症，继而引发痛风、尿酸盐肾病等问题[7]。所以开发食用酵母蛋白时要控制产品的嘌呤含量，因此检测酵母蛋白的嘌呤含量非常重要。
目前，食品中嘌呤含量的检测还没有明确的标准，较常用的检测方法是高效液相色谱法，检测不同食品中嘌呤含量的液相色谱条件各不相同[8-11]。Rong等[10]使用Waters Atlantis T3 柱同时检测不同部位猪肉、牛肉的4 种嘌呤含量，样品用高氯酸水解后检测，牛肉嘌呤总量为936 mg/kg～1 223 mg/kg，猪肉嘌呤总量为1 129 mg/kg～1 507 mg/kg，且均以次黄嘌呤为主，回收率范围97%～105%。方妍等[11]使用Waters Atlantis dC18同时检测鸡肉和鸡汤中4 种嘌呤的含量，前处理方式为三氟乙酸-甲酸混合酸处理，检出限为0.024 mg/L～0.128 mg/L，鸡肉嘌呤总量为0.241 mg/g，鸡汤嘌呤总量为0.215 mg/g，回收率为91%～95%。郑丽婷等[12]用Ultimate AQ-C18 柱同时检测啤酒中4 种嘌呤的含量，啤酒用硫酸溶液酸解处理，检出限范围0.010 mg/L～0.030 mg/L，经检测市售啤酒嘌呤含量为50 mg/L～90 mg/L，回收率为92%～101%。李婷婷等[13]用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱同时分析海水鱼中4 种嘌呤含量，三氟乙酸-甲酸混合酸处理后的鱼肉样品嘌呤含量为779.920 mg/kg～1 500.001 mg/kg，其中所有样品次黄嘌呤含量较高，回收率范围为94%～102%，检出限范围为0.046 5 mg/L～0.105 6 mg/L。然而，高效液相色谱法检测嘌呤含量的多种方法中，4 种嘌呤分离后的保留时间均非常接近，且有的方法不能完全分离嘌呤色谱峰，因此，检测食品嘌呤含量的结果并不准确。
本试验将通过考察样品前处理方式、色谱柱、流动相组成、流动相pH 值、流动相流速、柱温等因素，建立可以同时检测酵母蛋白样品中4 种嘌呤含量的方法，并对6 种不同酵母蛋白和豌豆蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白样品中的4 种嘌呤含量进行检测分析，为酵母蛋白在食品中的推广应用提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
酵母蛋白样品（食品级，编号YP 1～YP 6）：安琪酵母股份有限公司；大豆蛋白样品（食品级）：山松生物制品有限公司；豌豆蛋白样品（食品级）：烟台双塔食品股份有限公司；乳清蛋白样品（食品级）：恒天然集团有限公司；次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、氢氧化钾、甲酸（均为色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；黄嘌呤（色谱级）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）、三氟乙酸、甲酸铵、冰乙酸（均为分析纯）：赛默飞世尔科技有限公司；磷酸二氢钾、磷酸、高氯酸、四丁基氢氧化铵（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；试验用水均为Milli-Q 设备（Millipore，美国）过滤所得。
1.2 仪器与设备
BILON-XH-D 型漩涡混合器：上海比朗仪器制造有限公司；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；EYELA 型冷却水循环装置：上海爱朗仪器有限公司；Agilent 1260 型高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；3K15 型通用台式冷冻离心机：希格玛实验室离心机公司；RE-5205旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；BCD-539 WL 型对开门冰箱：海尔电器集团有限公司。
1.3 标准溶液配制
准确称取黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和腺嘌呤4 种标准品各0.001 g，加入1 mL 1 mol/L NaOH 溶液助溶，超纯水定容至10 mL，得到100 mg/L 的混合标准储备液，置于4 ℃冰箱储存备用。采用相同方法分别配制100 mg/L 的黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和腺嘌呤标准溶液，置于4 ℃储存备用。
1.4 方法
1.4.1 样品前处理
1.4.1.1 高氯酸法
采用Zheng 等[14]的方法，准确称量0.200 g 蛋白样品加1 mL 超纯水涡旋混合30 s，加入2 mL 9%的高氯酸涡旋混合30 s 后100 ℃水浴加热60 min，期间每隔10 min 将样品涡旋混合30 s，水浴结束后将样品迅速冷却，5 000 r/min 离心20 min，取上清液，用2 mol/L KOH溶液调pH 值至7.00，再用H3PO4 将pH 值调至3.60，在pH3.60 下用最适流动相定容至10 mL，2 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm 聚醚砜（polyethersulfone，PES）滤膜过滤后备用。
1.4.1.2 混合酸法
参照李婷婷等[13]的方法并稍作修改，准确称取0.200 g 酵母蛋白，加入1 mL 超纯水混合，再加入10mL混合酸（三氟乙酸与甲酸体积比1∶1）涡旋混合30 s，85 ℃水浴加热15 min 后迅速冷却，于50 ℃下旋转蒸发至干，再用10 mL 最适流动相复溶，复溶后混合物5 000 r/min离心20 min，取上清液过0.22 μm PES 膜后备用。
1.4.2 色谱条件的优化
试验选择Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Positisil ODS-P（4.6 mm×250 mm，5 μm）2 款色谱柱用于4 种嘌呤的分析。
流动相组成的优化参考Rong 等[10]、严玮桐[15]和Sabolová 等[16]的方法，比较2 种色谱柱使用不同流动相时的分离效果，具体方法如表1所示。
表1 2 种不同色谱柱分离嘌呤混合标准溶液所用的3 种色谱条件
Table 1 Three chromatographic conditions for the separation of purine standards with two types of columns
参考文献A：pH3.60、10 mmol/L 甲酸铵；B：甲醇流动相洗脱方式进样量/μL流速/（mL/min）柱温/℃检测波长/nm 99%A，1%B 101.030254 [10]水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵（879∶100∶15∶6，体积比）100%100.830254 [13]A：pH3.60、0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4；B：乙腈0～18 min，乙腈0%～20%；18 min～22 min，乙腈20%～0%100.835254 [16]
选定色谱柱后，对流动相组成、流动相pH 值（3.00、3.46、3.50、3.53、4.00、5.00、6.00、7.00）、柱温（25、30、35 ℃）、流动相流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）分别进行优化，得到嘌呤测定的最优色谱条件。
1.4.3 标准曲线的制作
分别取0、10、100、200、500、700 μL 的混合标准储备液，用最适流动相制成0、1、10、20、50、70 mg/L 的系列梯度混合标准液，过0.22 μm PES 膜后，用最优色谱条件对其进行检测，以嘌呤浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线图。
1.4.4 方法精密度、检出限和定量限
制备混合嘌呤标准溶液，并进行6 次连续进样，进样量为10 μL，根据结果计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，确定方法的精密度。
参考张静[17]计算检出限和定量限的方法，确定仪器基线噪音，按照3 倍信噪比和10 倍信噪比计算方法的检出限和定量限。
1.4.5 蛋白样品中4 种嘌呤含量的测定和加标回收试验
取6 种酵母蛋白样品和大豆蛋白、豌豆蛋白、乳清蛋白样品，根据2.1 中的前处理方法进行样品前处理，再根据2.2 确定的色谱条件对前处理后的样品进行检测，每个样品做3 个平行，记录结果。在样品中加入低水平（本底值的1 倍）和高水平（本底值的2 倍）的对应嘌呤标准品，计算加标回收率。
1.5 数据分析
采用Agilent 1260 高效液相色谱仪自带数据处理系统采集数据，本文图片均使用Origin 2021 软件绘制，数据处理、精密度、准确度结果等均由软件Excel 2019 处理。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的选择和分析
2.1.1 色谱柱的选择和分析
选用Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，用3 种不同流动相条件进行试验，结果如图1所示。
图1 Venusil XBP C18 分离4 种嘌呤标准品色谱图
Fig.1 Chromatogram of Venusil XBP C18 for separation of four purine standard substances
①鸟嘌呤；②次黄嘌呤；③腺嘌呤；④黄嘌呤。
（A）A 相：pH3.60、0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4 溶液，B 相：乙腈（梯度洗脱0～18 min，0%～20%；18 min～22 min，20%～0%）；（B）99%A 相：pH3.60、10 mmol/L 甲酸铵，1%B 相：甲醇；（C）水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵（879∶100∶15∶6，体积比）。
由图1可知，3 种不同流动相条件均无法完全分离4 个嘌呤色谱峰。以0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4 溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱时，4 种嘌呤色谱峰的保留时间相近，4 种嘌呤在0.5 s 内全部出峰，但无法完全分离，进行单标试验得出，4 个峰依次是鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤；而甲醇-甲酸铵做流动相时，4 种嘌呤只能分离出3 个色谱峰，用单标试验验证后得出，从左到右依次为次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤；而水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵（879∶100∶15∶6，体积比）用作流动相时，只能分离出2 个峰，用单标试验验证后得出，依次是次黄嘌呤和腺嘌呤。
以上试验选用的色谱柱与Rong 等[10]、李婷婷等[13]、严玮桐[15]、Sabolová 等[16]检测嘌呤常用的色谱柱不同，嘌呤检测常用的多为Waters Atlantis T3 色谱柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱等，而Venusil XBP C18 色谱柱是一款通用型色谱柱，是常规检测的良好选择，但经试验验证，以上3 种流动相条件下均不能分离嘌呤混合物，所以选用其它类型的色谱柱。
使用色谱柱Positisil ODS-P（4.6 mm×250 mm，5 μm）进行混合嘌呤标准品的分离时，在3 种不同流动相条件下分离结果如图2所示。
图2 Positisil ODS-P 分离4 种嘌呤标准品色谱图
Fig.2 Positisil ODS-P for separation of four purine standards
①鸟嘌呤；②次黄嘌呤；③腺嘌呤；④黄嘌呤。
（A）A 相：pH3.60、0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4 溶液，B 相：乙腈（梯度洗脱0～18 min，0%～20%；18 min～22 min，20%～0%）；（B）99%A 相：pH3.60、10 mmol/L 甲酸铵，1%B 相：甲醇；（C）水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵（879∶100∶15∶6，体积比）。
由图2可知，以0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4 溶液和乙腈为流动相梯度洗脱时可分离出4 个色谱峰，根据单标试验得出，4 个峰依次是鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和黄嘌呤，但后续不断调整乙腈比例，都不能完全分离4 种嘌呤色谱峰；而用甲醇-甲酸铵做流动相和水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵（879∶100∶15∶6，体积比）用作流动相时，都只能分离出3 个色谱峰，用单标试验验证后得出，从左到右依次为次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤。
综上，0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4 溶液和乙腈为流动相梯度洗脱的效果最好，但通过改进洗脱程序无法使4 种嘌呤完全分离，最后参考黄洋等[18]的方法并稍作修改，选用pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 溶液作为流动相分离嘌呤，结果如图3所示。
图3 Positisil ODS-P 分离4 种嘌呤标准品色谱图
Fig.3 Positisil ODS-P for separation of four purine standards
①鸟嘌呤；②次黄嘌呤；③腺嘌呤；④黄嘌呤。
由于Positisil ODS-P 色谱柱填料是十八烷基硅烷键合硅胶（octadecyl silane chemically bonded to porous silica，ODS），它使用独特的键合技术增加键合相密度，能够耐受20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 溶液的流动相，而完全的封尾技术能改善碱性化合物的峰形并减少拖尾现象，其极性化合物的保留能力也明显增强，能较好的分离4 种嘌呤色谱峰。由图3可知，4 种嘌呤色谱峰完全分离，峰形完整不拖尾，经单标试验验证，4 个峰依次是鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤。因此，选择用Positisil ODS-P 色谱柱进行后续分析。
2.1.2 流动相的优化选择
使用20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 和甲醇作为流动相时，用不同甲醇比例流动相进行分离，结果如图4所示。
图4 不同甲醇比例分离效果
Fig.4 Separation effect with different methanol content
（A）90%A 相：pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-HP3PO4，10%B 相：甲醇；（B）99%A 相：pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-HP3PO4，1%B 相：甲醇；（C）pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-HP3PO4。
由图4可知，流动相不含甲醇和含有1%甲醇时，4 种嘌呤色谱峰均能分离，4 个峰从左到右依次是鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。其中，流动相为10%甲醇、90%20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 时，鸟嘌呤和腺嘌呤不能完全分离，腺嘌呤色谱峰有拖尾现象；流动相为1%甲醇、99%20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 时，4 种嘌呤色谱峰的峰型标准，没有拖尾，但腺嘌呤和次黄嘌呤不能完全分离，即甲醇比例的增加会导致4 种嘌呤的分离效果变差；以20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 作为流动相时，4种嘌呤色谱峰完全分离，峰形标准，不拖尾，所以选择20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 作为流动相检测嘌呤含量。
2.1.3 流动相pH 值的确定
选择20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 作为流动相时，流动相的pH 值对分离的效果影响很大[17-19]，pH 值的选择要保证4 种嘌呤的完全分离，而且还要保证嘌呤活性不受pH 值的影响。用H3PO4 调节20 mmol/L KH2PO4 的pH 值得到的不同分离效果如图5所示。
图5 不同pH 值流动相的分离效果
Fig.5 Separation effect of mobile phase at different pH values
①鸟嘌呤；②腺嘌呤；③次黄嘌呤；④黄嘌呤。
A～H 的pH 值依次为3.00、3.46、3.50、3.53、4.00、5.00、6.00、7.00。
由图5可知，流动相在pH3.00 和pH＞4.00 条件下均只分离出3 个色谱峰，而流动相3.00＜pH≤4.00 时，能分离出4 个色谱峰，pH3.50 的流动相能让4 种嘌呤完全分离，峰形好，不拖尾，流动相pH＜3.50 时，腺嘌呤与鸟嘌呤出峰时间接近导致无法完全分离，而pH＞3.50时，腺嘌呤与次黄嘌呤过于接近，分离效果较差。且pH小幅度变化也会影响嘌呤的分离效果，20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 流动相在pH3.46、pH3.50 和pH3.53 的条件下分离效果不同。最终选择流动相为pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 且pH 值调节要精准才能达到较好的分离效果。
2.1.4 柱温的确定
不同文献中不同色谱柱柱温条件也不相同[16,20-21]，一般为25 ℃～35 ℃，在流动相为pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 条件下，不同柱温的分离效果如图6所示。
图6 相同流动相条件下不同柱温的分离效果
Fig.6 Separation effects of different column temperatures under the same mobile phase condition
A.柱温25 ℃；B.柱温30 ℃；C.柱温35 ℃。
由图6可知，25 ℃柱温不能完全分离4 种嘌呤色谱峰，鸟嘌呤和腺嘌呤不能完全分离，在30 ℃和35 ℃下，4 种嘌呤可以完全分离，但是长时间使用较高柱温检测，会影响色谱柱的寿命，所以选择30 ℃柱温进行后续试验。
2.1.5 流动相流速的确定
保持流动相、pH 值、柱温一致，以流速0.8、1.0、1.2 mL/min，对4 种嘌呤进行检测，结果如图7所示。
图7 不同流速分离效果
Fig.7 The effect of flow rates on separation
A.流速0.8 mL/min；B.流速1.0 mL/min；C.流速1.2 mL/min。
由图7可知，使用以上流速4 种嘌呤的色谱峰均能分离，峰形标准，没有拖尾现象。结果表明，随着流速增大，保留时间缩短，当流速为1.2 mL/min 时，4 种嘌呤的保留时间在14 min 之内，腺嘌呤和次黄嘌呤的保留时间相近没有完全分离，而且流速过高会使柱压升高，容易损坏色谱柱。而流速为0.8 mL/min 和1.0 mL/min时，分离效果相同，选择1.0 mL/min 可节约检测时间，因此最终选择1.0 mL/min 作为流动相流速。
综上，检测蛋白样品中嘌呤含量的最优色谱条件为使用Positisil ODS-P（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为20 mmol/L KH2PO4-H3PO4（pH3.50），流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。
2.2 嘌呤标准曲线及回归方程
利用最优色谱条件，对检测混合标准品所得结果进行分析，以峰面积为纵坐标，嘌呤质量浓度为横坐标绘制得到混合标准品标准曲线，得到线性方程及相关系数，见图8和表2。
图8 4 种嘌呤标准曲线
Fig.8 Standard curve of four purines
表2 4 种嘌呤的线性结果
Table 2 Linear results of four purines
嘌呤回归方程相关系数R定量限/（mg/L）鸟嘌呤 y=10.455x-27.700 0.999 60～700.0500.166腺嘌呤 y=70.309x-21.066 0.999 60～700.0270.091次黄嘌呤 y=19.880x-5.353 0.999 60～700.0840.281黄嘌呤 y=29.621x-9.652 0.999 70～700.0610.203线性范围/（mg/L）检出限/（mg/L）
由表2可知，4 种嘌呤在0～70 mg/L 质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（R）符合标准。按照3 倍和10 倍信噪比计算得出检出限和定量限，检出限为0.027 mg/L～0.084 mg/L，定量限为0.091 mg/L～0.281 mg/L。
用混合标准溶液连续进样6 次进行精密度试验，结果如表3所示。
表3 精密度试验结果
Table 3 Validation of precision test
嘌呤种类测定值/（mg/L）RSD/%123456鸟嘌呤 38.534 38.526 38.530 38.520 38.546 38.510 0.03腺嘌呤 68.068 68.114 68.127 68.170 68.206 68.163 0.06次黄嘌呤 20.242 20.248 20.226 20.203 20.209 20.213 0.08黄嘌呤 61.842 61.880 61.855 61.935 61.904 61.904 0.05
由表3可知，4 种嘌呤的RSD 均小于0.1%，有良好的重现性，表明建立的高效液相色谱检测方法可用作样品嘌呤含量检测。
2.3 蛋白样品嘌呤含量检测和加标回收率试验结果分析
采用优化后的检测方法，对前处理后的样品溶液进行检测，加标回收率试验用于验证方法的准确性，不同前处理试验结果如表4和表5所示。
表4 高氯酸水解YP-3 样品加标回收率
Table 4 The spiked recovery of YP-3 sample hydrolyzed with perchloric acid
注：-表示结果物质未检出。
名称本底值/mg 加标量/mg 检出值/mg 回收率/%鸟嘌呤0.2190.200.31548.00 0.450.44049.11腺嘌呤0.4551.001.31385.80 2.502.47280.68次黄嘌呤-1.000.60560.50 2.000.98049.00黄嘌呤-1.000.79979.90 2.001.58579.25
表5 混合酸水解YP-3 号样品加标回收率
Table 5 The spiked recovery of YP-3 sample hydrolyzed with mixed acid
注：-表示结果物质未检出。
名称本底值/mg 加标量/mg 检出值/mg 回收率/%鸟嘌呤1.781.823.53196.21 3.505.308100.80腺嘌呤0.310.320.638102.50 0.701.025102.14次黄嘌呤-1.001.001100.10 2.002.042102.10黄嘌呤-1.000.99399.30 2.001.95497.70
由表4和表5可知，不同前处理方法检测结果不同，进行高氯酸提取试验时，高氯酸属于强氧化性物质，会使酸解产生的嘌呤进一步氧化，影响结果，且酸解温度较高，加热会产生有毒氯气，试验耗时，调节pH值容易突变，不易控制，导致加标回收率不高。而混合酸法前处理比高氯酸法简单，水解温度较低，不会产生有毒有害物质，更安全，甲酸能保护样品中嘌呤[20]，回收率保持在96.21%～102.50%，耗时短、易操作、试验可重复性高，所以选择混合酸法处理酵母蛋白。
2.4 蛋白样品中嘌呤含量的检测结果分析
用建立的方法测定样品中的4 种嘌呤含量，包括6 种酵母蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、乳清蛋白共9 种蛋白样品，结果如表6所示。
表6 9 种蛋白样品中4 种嘌呤含量的检测结果
Table 6 Detection results of four purines contents in protein samples mg/g
注：-表示结果物质未检出。
?
由表6可知，6 种不同酵母蛋白的嘌呤含量不同，YP-2 样品的总嘌呤含量远高于其它样品，而YP-5 和YP-6 样品的总嘌呤含量较低，尤其是YP-6 样品。据文献报道，食品根据嘌呤含量一般分为3 个等级，低于50 mg/100 g 的食品为低嘌呤含量食品、50 mg/100 g～150 mg/100 g 为中等嘌呤含量食品，150 mg/100 g 以上为高嘌呤含量食品[22]。按此标准分级，YP-5、YP-6、大豆蛋白样品、乳清蛋白样品均为低嘌呤含量食品，而YP-1、YP-2、YP-3、YP-4 均属于高嘌呤含量食品，豌豆蛋白样品则是中等嘌呤含量食品。该结果可以作为痛风患者饮食选择的指导，急性期或缓解期痛风患者要避免高嘌呤含量食品，优先选择低嘌呤含量食品[22]。
从嘌呤的组成种类看，9 种蛋白样品的嘌呤主要为鸟嘌呤和腺嘌呤，均不含次黄嘌呤，只有豌豆蛋白、大豆蛋白和YP-2 含有少量黄嘌呤，这与蔡路昀等[23]、Kaneko 等[24]的研究结果一致，即植物性蛋白食品整体嘌呤含量低，且组成主要以鸟嘌呤和腺嘌呤为主，尤其是豆类、谷类等鸟嘌呤和腺嘌呤含量均占总嘌呤含量的60%以上[25]。据研究报道，血尿酸浓度升高效率与嘌呤种类有关[26]，嘌呤核苷酸分解代谢时，黄嘌呤、次黄嘌呤代谢为尿酸的过程短，而鸟嘌呤和腺嘌呤还需要一系列转化才能形成尿酸[27]。所以酵母蛋白与动物性食品相比，黄嘌呤和次黄嘌呤的含量较低，转化为尿酸的比例低，不易引起血尿酸浓度升高[28]。
3 结论
本试验建立了检测酵母蛋白样品中4 种嘌呤含量的高效液相色谱法。具体方法为0.200 g 蛋白样品和1 mL水的混合溶液经10 mL 混合酸（三氟乙酸与甲酸体积比1∶1）提取后，在85 ℃加热15 min，迅速冷却后旋蒸，用10mL KH2PO4-H3PO4 复溶，复溶后混合物5 000 r/min 离心20 min，取上清液过滤膜，用Positisil ODS-P（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以pH3.50、20 mmol/L KH2PO4-H3PO4 为流动相，在流速1.0 mL/min、柱温30 ℃、进样量10 μL、检测波长254 nm 的条件下进行检测。经验证，方法在0～70 mg/L 的范围内线性关系良好，相关系数为0.999 6～0.999 7，方法检出限范围0.027 mg/L～0.084 mg/L，定量限范围0.091 mg/L～0.281 mg/L，方法精密度在0.03%～0.08%之间，加标回收率范围96.21%～102.50%，该方法适用于蛋白样品中4 种嘌呤的测定。用此方法对6 种酵母蛋白和豌豆蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白样品的嘌呤含量进行检测，得出9 种蛋白样品的4 种嘌呤含量，并根据总嘌呤含量进行分类，YP-5、YP-6、大豆蛋白、乳清蛋白样品均为低嘌呤含量食品，YP-1、YP-2、YP-3、YP-4 均为高嘌呤含量食品，豌豆蛋白是中等嘌呤含量食品。酵母蛋白样品的嘌呤含量相差较大，在开发以酵母蛋白为原料的食品中，需要根据食品的指标要求，选定不同嘌呤含量的酵母蛋白。
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