多糖是广泛存在于生物体中的天然聚合物，是一类由醛糖或者酮糖结合通过糖苷键连接而成重要的生物大分子，是维持生命机能的主要物质之一。植物多糖是由植物细胞产生的聚合物，其种类有10 种以上。植物多糖具有多种生物活性，包括抗氧化[1]、抗菌[2]、抗癌[3-4]和抗炎[5]等。
超声波细胞破碎法可以将电能转化为声能[6]，释放的能量可以使液体介质产生小气泡，并使得这些小气泡迅速破裂，引起爆破的效果，从而可以达到破碎细胞或其他物质的能力，使得物质瞬间破碎，加快有效物质的提取。超声波细胞破碎法有提取时间短、提取率高、无需加热等优点[7]。而传统的热水浸提法，消耗时间较长，提取率较低，需要加热，可能造成环境污染。超声波细胞破碎法辅助提取可以大大减少时间和能量的消耗，提高效率，减少环境污染，对原材料破坏少[8]，操作简便，可以提高植物中活性物质的提取效率[9]。
蒲公英（Taraxacum officinale），又称黄花地丁、婆婆丁、华花郎，是菊科植物家族中的一员，是原产于北半球的多年生草本植物。由于其抗糖尿病[10]，抗风湿和利尿[11]的特性，长期被用作中草药。研究表明，该植物的花、叶、根等几乎所有部位都具有药理活性[12]。然而，关于蒲公英叶多糖（dandelion leaf polysaccharide，DLP）的抗氧化活性及提取工艺的研究较少。本试验对蒲公英叶多糖超声波细胞破碎辅助提取法的提取工艺进行优化，并对蒲公英叶多糖的抗氧化活性进行研究，以期为蒲公叶多糖的开发及利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蒲公英叶：市售；乙醇、苯酚、过氧化氢（30%）：天津市江天化工股份有限公司；盐酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；维生素C 片：天津力生制药股份有限公司；2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）：上海麦克林生化科技有限公司；三氯化铁：天津索罗门生物科技有限公司；邻苯三酚：江苏艾康生物医药研发有限公司；三羟甲基氨基甲烷：天津百倍生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：天津市北方天医化学试剂厂；3，5-二硝基水杨酸：成都市科龙化工试剂厂：铁氰化钾：南京草木源生物科技有限公司；三氯乙酸：上海吉至生化科技有限公司，以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
超声波细胞粉碎机（JY92-ⅡN）：宁波新芝生物科技股份有限公司；恒温水浴锅（RE-52C）：巩义市英峪高科仪器厂；电子天平（BSA124S）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；立式冷藏柜（SC-242D）：青岛海尔特种电冰柜有限公司；扫描电子显微镜（JSM-IT300LV）：日本电子株式会社；摇摆式粉碎机（HK-04B）：广州市旭朗机械设备公司。
1.3 方法
1.3.1 蒲公英叶多糖的提取
采用蒸馏水将蒲公英叶清洗干净后60 ℃烘干，再将干燥后的蒲公英叶用粉碎机粉碎成粉末，过80 目筛后倒入密封袋中保存备用。称取1.0 g 蒲公英叶粉末，按照不同料液比加入蒸馏水，超声细胞破碎8 min，然后用热水提取，样品冷却至室温后，3 000 r/min 离心10 min，取上清液加入9 倍体积的90%乙醇4 ℃放置12 h，然后3 000 r/min 离心10 min 取沉淀定容至25 mL，用苯酚-硫酸法测定蒲公英叶多糖的浓度。
1.3.2 蒲公英叶多糖含量测定
以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线[13]，采用苯酚-硫酸法[14]测定蒲公英叶多糖的含量。
1.3.2.1 标准曲线的绘制
将0.1 g 葡萄糖标品定容到100 mL 容量瓶中，用移液管准确吸取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 分别置于试管中[15]，依次加入蒸馏水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mL 摇匀。分别移取上述混合溶液1.0 mL，各加入1 mL 苯酚溶液（6%），5.0 mL硫酸迅速混匀，沸水浴20 min，冷却至室温，490 nm 处测定吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。
1.3.2.2 蒲公英叶多糖提取率的测定
采用1.3.1 的方法得到蒲公英叶粗多糖溶液，取0.1 mL 提取液加入0.1 mL 苯酚溶液（6%）和0.5 mL 硫酸并快速混匀，沸水浴20 min，待冷却至室温后在490 nm 处测定吸光值，通过下述公式得出蒲公英叶多糖提取率[16]。
多糖提取率/%=[（C×V×N）÷m]×100
式中：C 为多糖浓度，μg/mL；V 为多糖溶液体积，mL；N 为溶液稀释倍数；m 为多糖质量，μg。
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 超声功率对蒲公英叶多糖提取率的影响
称取1.0 g 蒲公英叶粉末，按照1.3.1 的方法，固定料液比为1∶20（g/mL），提取温度60 ℃，提取时间20 min，考察不同超声功率（60、120、180、240、300 W）对多糖提取率的影响。
1.3.3.2 料液比对蒲公英叶多糖提取率的影响
称取1.0 g 蒲公英叶粉末，按照1.3.1 的方法，固定提取温度60 ℃，提取时间20 min，超声功率180 W，考察不同料液比[（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]对多糖提取率的影响。
1.3.3.3 提取时间对蒲公英叶多糖提取率的影响
称取1.0 g 蒲公英叶粉末，按照1.3.1 的方法，固定料液比为1∶20（g/mL），提取温度60 ℃，超声功率180 W，考察不同提取时间（10、15、20、25、30 min）对多糖提取率的影响。
1.3.3.4 提取温度对蒲公英叶多糖提取率的影响
称取1.0 g 蒲公英叶粉末，按照1.3.1 的方法，固定料液比为1∶20（g/mL），提取时间20 min，超声功率180 W，考察不同提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对多糖提取率的影响。
1.3.4 响应面试验
在单因素试验的基础上进行响应面试验的设计，对4 个因素进行比较，得出料液比、提取时间、超声功率对多糖提取率的影响较大，所以固定提取温度为60 ℃，通过Box-Benhnken 试验设计原理，以超声功率、料液比、提取时间为因素，设计三因素三水平的响应面试验，因素水平如表1所示。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平因素A 料液比/（g/mL）B 超声功率/WC 提取时间/min-11∶1018020 0 1∶1524025 1 1∶2030030
1.3.5 蒲公英叶多糖的抗氧化试验
1.3.5.1 蒲公英叶多糖还原力的测定
样品还原力的测定采用普鲁士蓝法[17]，具体操作参照Pan 等[18]的方法：整个试验在避光条件下进行，取0.1 mL 不同浓度的蒲公英叶多糖提取液，分别加入0.25 mL 磷酸盐缓冲溶液（pH6.6、0.2 mol/L）和0.25 mL 1%铁氰化钾溶液，在50 ℃条件下水浴加热20 min，取出再加入0.25 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，在3 000 r/min 的条件下离心10 min，取上清液0.25 mL，再加入0.25 mL 无水乙醇溶液和0.05 mL 0.1% FeCl3溶液，振荡摇匀，在700 nm 波长处测定其吸光值，并进行3 次平行试验，以VC 作为试验对照，最终测得OD值越高证明样品的还原力越强。
1.3.5.2 蒲公英叶多糖清除DPPH 自由基能力的测定
在避光的条件下进行清除DPPH 自由基能力的测定[19]，取0.2 mL 不同浓度的蒲公英叶多糖提取液，加入0.2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），振荡摇匀，并静置30 min，随后在517 nm 波长处测得吸光度为A1。在上述方法中，将无水乙醇溶液替代DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L）加入至不同浓度多糖样品中，在517 nm 波长处测得的吸光值为A2。以无水乙醇为对照，取0.2 mL无水乙醇溶液加入0.2 mL DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L），振荡摇匀，并静置30 min，在517 nm 波长处测得吸光度为A0。以VC 作为试验对照，并做3 次平行试验，计算蒲公英叶多糖DPPH 自由基清除率按照如下公式计算。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
1.3.5.3 蒲公英叶多糖清除羟自由基能力的测定
采用Fenton 反应体系法[20]：在避光条件下，取0.1 mL 不同浓度的蒲公英叶多糖提取液，再加入0.1 mL 6 mmol/L 的FeSO4 溶液，0.1 mL 6 mmol/L 的过氧化氢溶液，1 mL 6 mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，振荡摇匀，随后在37 ℃条件下水浴1 h，在510 nm 波长处测得吸光值为A1。同样的方法用H2O 替代多糖提取液测出的吸光值为A0，用H2O 替代H2O2 溶液测出的吸光值为A2。以VC 作为试验对照，并做3 次平行试验，计算蒲公英叶多糖的羟自由基清除率按照如下公式计算。
羟自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
1.3.5.4 蒲公英叶多糖清除超氧阴离子自由基能力的测定
取0.3 mL pH8.2 的0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液，加入样品0.1 mL，在25 ℃下恒温水浴20 min，加入0.04 mL 同样恒温25 ℃的25 mmol/L 邻苯三酚，混匀后反应4 min，再加入0.05 mL 的浓HCl 混匀，在转数为8 000 r/min 的4 ℃微型冷冻离心机中离心3 min，在96 孔板中加入每个样品的上清液0.2 mL，在325 nm处测吸光度值为A样品。以蒸馏水代替样品测出的吸光值为A空白。以同样预温为25 ℃的蒸馏水0.04 mL 代替邻苯三酚溶液测出的吸光值为A对照。每组进行3 组平行试验，超氧阴离子自由基清除率计算公式如下。超氧阴离子自由基清除率/%=[A空白-（A样品-A对照）]/A空白×100
1.3.6 蒲公英叶多糖扫描电镜分析
将蒲公英叶多糖粉末放置在样品台上，并使用真空镀膜装置涂覆金粉末，采用扫描电子显微镜观察蒲公英叶多糖的形态。
1.4 数据分析
每组试验重复3 次，结果采用平均值±标准差表示；使用Excel 2010 软件对数据进行统计分析并绘制图表，使用Design-Expert 12 进行响应面分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同超声功率对蒲公英叶多糖提取率的影响
不同超声功率对蒲公英叶多糖提取率的影响如图1所示。
图1 超声功率对蒲公英叶多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides from dandelion leaves
从图1中可以看出，蒲公英叶多糖提取率在超声功率为60 W～240 W 时逐渐升高，在240 W 时达到最大值（4.13%），随后随着超声功率的增加而下降，所以超声功率为240 W 时最佳。出现这种变化趋势可能由于超声功率的继续增加使得蒲公英叶多糖的连接键遭到破坏。
2.1.2 不同料液比对蒲公英叶多糖提取率的影响
不同料液比对蒲公英叶多糖提取率的影响如图2所示。
图2 料液比对蒲公英叶多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of polysaccharides from dandelion leaves
由图2可知，蒲公英叶多糖提取率在料液比为1∶15（g/mL）时达到最大值3.49%，随着溶剂添加量的增加而下降。可能是由于溶剂增加导致植物细胞内部和外部溶剂之间存在很大的浓度差，从而减少分子之间的相互作用，使得多糖提取率下降。因此，料液比为1∶15（g/mL）时为最优。
2.1.3 不同提取时间对蒲公英叶多糖提取率的影响
不同提取时间对蒲公英叶多糖提取率的影响如图3所示。
图3 提取时间对蒲公英叶多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from dandelion leaves
从图3中可以看出，在提取10 min～25 min 时，蒲公英叶多糖提取率随提取时间的延长而逐渐增加，但超过25 min 后，蒲公英叶多糖提取率随提取时间的延长而迅速下降。可能是随着提取时间的进一步延长，多糖被降解导致提取率下降[12]。因此，25 min 为最佳提取时间。
2.1.4 不同提取温度对蒲公英叶多糖提取率的影响
不同提取温度对蒲公英叶多糖提取率的影响如图4所示。
图4 提取温度对蒲公英叶多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from dandelion leaves
由图4可知，从40 ℃到60 ℃，蒲公英叶多糖提取率随提取温度升高而逐渐增加，达到2.98%，但随着提取温度的继续升高，多糖提取率迅速降低。这一趋势可能是因为随着提取温度的继续升高，蒲公英叶多糖的结构遭到破坏，使得多糖提取率迅速降低。因此，选择60 ℃为最佳提取温度。通过单因素数据比较，与其他几个因素相比，此因素的变化对多糖提取率的影响最小，因此不再用此因素做响应面优化试验。
2.2 蒲公英叶多糖响应面优化试验
2.2.1 响应面设计及显著性分析
选取A 料液比、B 超声功率、C 提取时间，以Y 蒲公英叶多糖提取率（%）为响应值，通过Box-Benhnken方法设计出三因素三水平的响应面试验，结果如表2～表3所示。
表2 响应面试验结果
Table 2 Results of response surface test
?
表3 回归方程的分析
Table 3 Analysis of regression equation
注：**表示影响极显著，P＜0.01；*表示影响显著，P＜0.05。
?
由表2可知，通过对试验数据进行多元回归分析，将响应值与检验变量通过以下二阶多项式方程进行关联：Y=5.09+0.110 7A-0.465 8B-0.853 6C-0.108 2AB+0.076 3AC-0.166 8BC-0.875 3A2-0.151 7B2-1.8C2。
由表3可知，一次项中A 料液比对蒲公英叶多糖提取率的影响显著，B 超声功率、C 提取时间的P 值均＜0.000 1，说明影响极显著。二次项中，AB、AC 影响不显著，而BC 影响显著，A2、C2 影响极显著，B2 影响显著。模型的P 值＜0.000 1，极显著，失拟项P 值为0.136 5，不显著，校正系数R2 为0.996，与决定系数R2Adj=0.990 8 相差极小，说明与实际值拟合较好、误差小，因此，可以很好地反映出各因素对蒲公英叶多糖提取率的影响。F 值的大小反映了单个因素对蒲公英叶多糖提取率的影响程度，3 个因素的影响程度依次为C（提取时间）＞B（超声功率）＞A（料液比）。
2.2.2 因素间交互作用结果
因素间交互作用结果如图5～图7所示。
图5 超声功率与料液比对多糖提取率交互作用的影响
Fig.5 Effect of the interaction between ultrasonic power and solid-to-liquid ratio on polysaccharide yield
图6 提取时间与料液比对多糖提取率交互作用的影响
Fig.6 Effect of the interaction between extraction time and solidto-liquid ratio on polysaccharide yield
图7 提取时间与超声功率对多糖提取率交互作用的影响
Fig.7 Effect of the interaction between extraction time and ultrasonic power on polysaccharide yield
由图5～图7看出，料液比与超声功率的交互作用不显著；料液比与超声时间的交互作用不显著。等高线图呈现椭圆形，说明功率与时间的交互作用是显著的，从右向左，等高线越来越密集，而且长轴与C（时间）变量直线相交，说明与功率相比，时间对提取率的影响更大，从响应面中可以看出，提取时间的这一面更陡峭，等高线结果与响应面相一致。
通过软件拟合可以总结出蒲公英叶多糖的最佳提取工艺为料液比1∶14.731（g/mL）、超声功率197.452 W、时间24.888 min，得出的多糖提取率为5.346%。经验证试验，得到蒲公英叶多糖提取率为4.936%，与预测值仅差0.41%。
2.3 蒲公英叶多糖抗氧化试验结果
2.3.1 蒲公英叶多糖还原力
蒲公英叶多糖和VC 的还原力测定结果如图8所示。
图8 不同质量浓度蒲公英叶多糖的还原力测定
Fig.8 Reduction power of polysaccharides at different concentrations
从图8可以看出，在质量浓度为0.2 mg/mL～1.2 mg/mL 时，VC 的总还原力要明显高于蒲公英叶多糖，并还会伴随质量浓度的增加而继续增加，而蒲公英叶多糖的总还原力在0.2 mg/mL～1.2 mg/mL 时，变化不大，继续增加蒲公英叶多糖的质量浓度其总还原力也不发生改变。由此可以看出，蒲公英叶多糖的还原力较弱。
2.3.2 蒲公英叶多糖清除DPPH 自由基能力
DPPH 自由基在517 nm 处会呈现紫色的特征吸光度，当抗氧化剂将其清除时，就会发生褪色，结果如图9所示。
图9 不同质量浓度蒲公英叶多糖DPPH 自由基清除率的测定
Fig.9 DPPH radical scavenging activity of polysaccharides at different concentrations
由图9可知，随着多糖浓度的增加，VC 的DPPH自由基清除能力显著增强。而蒲公英叶多糖的DPPH自由基的清除能力略有上升并维持在8%左右。由此可以看出，蒲公英叶多糖具有一定的清除DPPH 自由基的能力，经线性拟合，蒲公英叶多糖对DPPH 自由基的IC50 值为34.620 mg/mL。
2.3.3 蒲公英叶多糖清除羟自由基能力
羟自由基是活性氧中氧化能力最强的一种自由基，如果羟自由基过量，很多重要的生物分子结构会遭到破坏，比如蛋白质、脂质、磷酸，还会导致细胞癌变、基因突变和一些慢性疾病的产生，不同质量浓度多糖羟自由基清除能力如图10所示。
图10 不同质量浓度蒲公英叶多糖羟自由基清除率的测定
Fig.10 Hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides at different concentrations
由图10可知，随着蒲公英叶多糖的质量浓度的增加，其清除羟自由基的清除率由12.05%升高到23.42%。由此可见，蒲公英叶多糖具有较好的羟自由基的清除能力，可被认为是一种良好的羟自由基清除剂，可在一定程度上提供氧化损伤保护。经线性拟合，蒲公英叶多糖对羟自由基的IC50 值为12.156 mg/mL。
2.3.4 蒲公英叶多糖清除超氧阴离子自由基能力的测定
过量的超氧阴离子可能导致组织损伤以及各种疾病的产生。VC 和蒲公英叶多糖的超氧阴离子自由基清除率的变化趋势如图11所示。
图11 不同质量浓度蒲公英叶多糖超氧阴离子自由基清除率的测定
Fig.11 Superoxide anion radical scavenging activity of polysaccharides at different concentrations
由图11可知，两种物质随着质量浓度的增加，其超氧阴离子自由基清除率也明显提升，清除率从18.59%增加到29.58%。然而，在所有测试浓度下，蒲公英叶多糖的超氧阴离子自由基清除能力均低于VC。通过本研究可以看出，蒲公英叶多糖具有较好的超氧阴离子自由基清除能力。经线性拟合，蒲公英叶多糖对超氧阴离子自由基的IC50 值为0.979 mg/mL。
2.4 蒲公英叶多糖微观结构
通过采用扫描电子显微镜观察蒲公英叶多糖的微观结构，结果如图12所示。
图12 不同放大倍数下蒲公英叶多糖的微观结构
Fig.12 Microstructure of polysaccharides from dandelion leaves at different magnifications
A～D 分别为放大500、1 000、3 000、10 000 倍。
由图12可以看出，蒲公英叶多糖为不规则的碎块状结构，表面附有类似结晶的结构，且结构紧密，表面附有碎屑。
3 结论
利用超声波细胞破碎辅助提取法做蒲公英叶多糖提取工艺的优化，在单因素试验的基础上，进行了响应面优化试验，得到最优提取工艺为料液比1∶15（g/mL）、超声功率197 W、提取时间25 min，在此条件下得出的多糖提取率为5.346%。其清除DPPH 自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的IC50 值分别为34.62、12.16、0.98 mg/mL。综上所述，蒲公英叶多糖具有一定的抗氧化性。此外，还发现蒲公英叶多糖为不规则的碎块状结构，表面附有类似结晶的结构。本研究为开发蒲公英叶多糖作为天然抗氧化剂的潜在应用提供了科学依据。
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