番石榴（Psidium guajava L.）又称鸡矢果、拔子、芭乐等，为桃金娘科（Myrtaceae），番石榴属（Psidium）植物，原产地为中南美洲墨西哥、秘鲁、巴西等地区，在台湾、海南、广东、广西、福建、云南、贵州、四川、江西等地均有栽培[1]。番石榴营养成分丰富，含有较高的维生素A、维生素C、矿物质、胡萝卜素、叶绿素、叶黄素，以及磷、钾、钙、镁等微量元素，还富含膳食纤维、果胶、蛋白质和多酚物质等[2-4]。番石榴具有降血糖、降脂、抗衰老、抗癌等功能，还具有消食、开胃等功效[5-7]。番石榴因适应性强，一年四季均可采摘，但其果实不耐贮藏，导致果农增产不增收，所以番石榴加工产品和技术研发尤为重要和迫切。番石榴果实除生产鲜果汁外，还可加工为果汁粉、果醋、果脯、果酱。其果籽可用于提炼食用油；番石榴的树叶枝条作肥料与饲料原料，嫩芽可作茶叶等[8-11]。
花色米酒是近年畅销的新型米酒饮料，在糯米型米酒中辅以药材、谷物、果肉、食用菌等制成[12-15]。番石榴果实营养丰富、风味独特，开发番石榴米酒，其经济价值高、市场发展前景好。但是，目前有关番石榴酒品酿造工艺的研究鲜有报道，对番石榴的研究主要集中于栽培技术、病害防治、营养成分分析等方面，不利于番石榴产业的可持续发展[16-19]。
本研究对番石榴米酒的发酵工艺采用单因素和响应面试验法进行优化，检测番石榴米酒的酒精度并进行感官评价，探究最佳的酿造工艺条件，为番石榴利用及新型米酒的开发提供参考，对番石榴加工产业具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
“翡翠”白肉番石榴：2020年8月20日从广州市从化吕田镇试验基地采集；酒曲：安琪酵母股份有限公司；糯米：市售。
电子天平（AL204）：上海智态电子科技有限公司；电子计重秤（BNS-15-N）：昆山巨天仪器设备有限公司；手持酒度计（PAL-102/104）：杭州齐威仪器有限公司；搅拌机（HR2870）：飞利浦中国有限公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：江苏省金坛市友联仪器研究所；糖度仪（ATC）：武强县天垒仪表厂；恒温恒湿箱（HSX-150）：广州市深华生物技术有限公司。
1.2 工艺流程
番石榴米酒酿制工艺流程如图1所示，操作技术要点参考邝瑞彬等[20]的工艺。其中，番石榴汁的制备：采集无病虫害、无腐烂和损伤的番石榴果实，洗浄晾干，切成约2 cm 方块，沸水烫漂1 min～2 min，然后加入到搅拌机进行打浆操作，用120 目纱布过滤，留取澄清果汁备用。
图1 番石榴米酒酿制工艺流程
Fig.1 Fermentation technology route of guava wine
1.3 番石榴米酒感官评价
参照NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》[21]中的方法，从米酒样品的澄清度（20 分）、色泽（20 分）、气味（30 分）、滋味（30 分）4 个方面进行感官评价，共计100 分。10 人进行品评及打分，总分取10 人平均分，评分标准见表1。
表1 番石榴米酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standard of guava rice wine
项目评分标准感官评分澄清度（20 分）无明显可见固形物的乳浊或透明至半透明液体，允许有微量聚集物，无外来可见异物11～20有明显的可见固形物的乳浊或透明至半透明液体，允许有微量聚集物，无外来可见异物0～10色泽淡黄色，有光泽16～20（20 分）色泽略差，无变色9～15酒体变色0～8气味具有番石榴米酒特有的清香，无异味21～30（30 分）具有较淡的番石榴米酒清香，无异味11～20具有番石榴米酒的清香，无异味0～10滋味味感柔和，酸甜可口21～30（30 分）味感较柔和，酸甜可口11～20味感不柔和0～10
1.4 理化指标的测定
番石榴米酒成品理化指标的测定参考NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》[21]中的方法；酒精度的测定参考GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法[22]。
1.5 单因素试验
1.5.1 发酵时间对番石榴米酒的影响
在糯米200 g、酒曲添加量0.6%、番石榴汁添加量40%、发酵温度27 ℃、番石榴汁添加时间为发酵后48 h 的条件下，分别发酵2、4、6、8、10、12、14 d，探究发酵时间对番石榴米酒酒精度和感官评分的影响。
1.5.2 酒曲添加量对番石榴米酒的影响
在糯米200 g、番石榴汁添加量40%、发酵温度27 ℃、番石榴汁添加时间为发酵后48 h、发酵时间8 d的条件下，分别添加0.3%（0.6 g）、0.4%（0.8 g）、0.5%（1.0 g）、0.6%（1.2 g）、0.7%（1.4 g）、0.8%（1.6 g）酒曲，探究酒曲添加量对酒精度和感官评分的影响。
1.5.3 番石榴汁添加量对番石榴米酒的影响
在糯米200 g、酒曲添加量0.6%、发酵温度27 ℃、番石榴汁添加时间为发酵后48 h、发酵时间8 d 的条件下，番石榴汁添加量分别为20%、30%、40%、50%、60%，探究番石榴汁添加量对酒精度和感官评分的影响。
1.5.4 番石榴汁添加时间对番石榴米酒的影响
在糯米200 g、酒曲添加量0.6%、番石榴汁添加量40%、发酵温度27 ℃、发酵时间8 d 的条件下，分别在发酵后12、24、36、48、60、72、84 h 添加番石榴汁，探究番石榴汁添加时间对酒精度和感官评分的影响。
1.5.5 发酵温度对番石榴米酒的影响
在糯米200 g、酒曲添加量0.6%、番石榴汁添加量40%、番石榴汁添加时间为发酵后48 h、发酵时间8 d的条件下，分别在21、24、27、30、33 ℃的温度下发酵，探究发酵温度对酒精度和感官评分的影响。
1.6 番石榴米酒响应面试验设计
在单因素试验分析结果的基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken 响应面设计方法，在发酵温度27 ℃和番石榴汁添加时间为发酵后48 h 的条件下，选择发酵时间、酒曲添加量、番石榴汁添加量3 因素进行试验，以感官评分为指标进行工艺优化，试验设计因素与水平见表2。
表2 响应面试验因素和水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments
水平因素A 发酵时间/d B 酒曲添加量/% C 番石榴汁添加量/%-160.530 0 8 0.640 1100.750
1.7 验证试验
经软件Design-Expert 8.0 优化，分析得到的最佳试验条件，对响应面分析法优化的工艺条件进行适当调整，在此条件下进行3 次验证试验，测定酒精度并进行感官评价分析。
1.8 数据处理与分析
数据进行处理采用Excel 2007，响应面法设计和统计分析采用Design-Expert 8.0。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 发酵时间对番石榴米酒品质的影响
图2为发酵时间对番石榴米酒品质的影响。
图2 发酵时间对番石榴米酒品质的影响
Fig.2 Effects of fermentation time on guava wine quality
由图2可知，感官评分随着发酵时间的延长呈先上升后降低的趋势。发酵时间低于8 d 时，番石榴米酒气味较淡，酒香不足，口感偏甜；当发酵时间为8 d 时，番石榴米酒酒色澄清，口感佳，感官评分最高；但当发酵时间超过8 d 后，发酵时间过长，米酒带有酸味，口感欠佳，澄清度较低，感官评分下降。因此，发酵时间为8 d 左右为宜，此条件下感官评分为84，酒精度为13.0%vol。
2.1.2 酒曲添加量对番石榴米酒品质的影响
图3为酒曲添加量对番石榴米酒品质的影响。
图3 酒曲添加量对番石榴米酒品质的影响
Fig.3 Effects of wine koji amount on guava wine quality
由图3可知，感官评分随着酒曲添加量的增加呈先上升后降低的趋势。酒曲添加量小于0.6%时，番石榴米酒澄清度较低，番石榴米酒气味较淡；当酒曲添加量为0.6%时，酒色较澄清，色泽清亮，口感较佳，感官评分最高；当酒曲添加量超过0.6%后，米酒色泽较差，口感欠佳。因此，酒曲添加量在0.6%左右为宜，此条件下感官评分为80，酒精度为16.0%vol。
2.1.3 番石榴汁添加量对番石榴米酒品质的影响
图4为番石榴汁添加量对番石榴米酒品质的影响。
图4 番石榴汁添加量对番石榴米酒品质的影响
Fig.4 Effects of guava juice amount on guava wine quality
由图4可知，感官评分随着番石榴汁添加量的增加呈先上升后降低的趋势。番石榴汁添加量小于40%时，番石榴米酒风味突出，色泽不佳；当番石榴汁添加量为40%时，酒色较澄清，色泽较佳，口感较好；当添加量高于40%时，大量的番石榴汁促进了发酵，番石榴米酒带有酸味，口感欠佳，澄清度较低。因此，番石榴汁添加量在40%左右为宜，此条件下感官评分为80，酒精度为11.0%vol。
2.1.4 番石榴汁添加时间对番石榴米酒品质的影响
图5为番石榴汁添加时间对番石榴米酒品质的影响。
图5 番石榴汁添加时间对番石榴米酒品质的影响
Fig.5 Effects of guava juice addition time on guava wine quality
由图5可知，感官评分随着番石榴汁添加时间的延长呈先上升后降低的趋势。番石榴汁添加时间小于48 h 时，番石榴米酒的色泽浑浊，口感不佳；当番石榴汁添加时间为48 h 时，番石榴米酒酒色较澄清，微黄清亮，口味佳；当番石榴添加时间超过48 h 时，番石榴米酒的番石榴香味较淡，色泽较浑浊，口感较差。因此，番石榴汁添加时间为48 h 左右为宜，此条件下感官评分为86，酒精度为15.0%vol。
2.1.5 发酵温度对番石榴米酒品质的影响
图6为发酵温度对番石榴米酒品质的影响。
图6 发酵温度对番石榴米酒品质的影响
Fig.6 Effects of fermentati on temperature on guava wine quality
由图6可知，感官评分随着发酵温度的升高呈先上升后降低的趋势。发酵温度小于27 ℃时，番石榴米酒风味突出，口感不佳；当发酵温度为27 ℃时，番石榴米酒的感官评分最高；当发酵温度高于27 ℃时，较高的温度促进发酵，番石榴米酒带有酸味，口感欠佳，澄清度较低。因此，发酵温度为27 ℃左右为宜，此条件下感官评分为84，酒精度为15.0%vol。
2.2 响应面分析
响应面试验设计及结果如表3所示。
表3 响应面试验设计与结果
Table 3 Experimental design and results of response surface methodology
序号因素Y 感官评分A B C 1 0 1-177 2-11080 3 0 0 0 86 4 89 5 1 0 1 82 0 0 0 79 7 0 0 0 87 6 0 1 1-1080 9 0 0 0 87 8 1 100-1-178 1100088 12-10177 13-1-1081 140-1181 15-10-178 1610-178 1711083
利用Design-Expert 8.0 软件对表3数据进行整理分析，得到各因素与感官评分间的数学模型：Y=87.40+0.88A-0.12B+1.00C+1.00AB+1.25AC-0.25BC-3.20A2-3.20B2-5.45C2。
回归模型方差分析结果如表4所示。
表4 回归模型方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model
注：**表示影响极显著，P＜0.01；*表示影响显著，P＜0.05。
?项目平方和 自由度 均方F 值P 值显著性模型258.52928.7220.210.000 3**A6.1316.134.310.076 6 B0.1310.130.0880.775 4 C8.0018.005.630.049 4*AB4.0014.002.810.137 3 AC6.2516.254.400.074 2 BC0.2510.250.180.687 5 A243.12143.1230.330.000 9**B243.12143.1230.330.000 9**C2125.061125.0687.98 ＜0.000 1**残差9.9571.42失拟项4.7531.581.220.411 6纯误差5.2041.30总和268.4716
表4回归模型方差分析表明，一次项C 为显著水平（P＜0.05），二次项A2、B2、C2 达到极显著水平（P＜0.01），其他各项不显著（P＞0.05），F 值显示各因素对番石榴米酒感官评价影响的主次顺序为番石榴汁添加量（C）＞发酵时间（A）＞酒曲添加量（B）。该模型决定系数R2=0.962 9，校正决定系数R2Adj=0.915 3，模型P=0.000 3，表明该二次方程模型极显著（P＜0.01）；失拟项不显著（P＞0.05），表明该模型拟合程度高。
2.3 各因素的交互作用
响应面可以直接反映各因素交互作用强弱，根据回归方程绘制的等高线和响应面如图7～图9所示。
图7 发酵时间与酒曲添加量交互作用的等高线和响应面分析
Fig.7 Response surface plots and contour lines of the interaction between fermentation time and wine koji amount
图8 发酵时间与番石榴汁添加量交互作用的等高线和响应面分析
Fig.8 Response surface plots and contour lines of the interaction between fermentation time and guava juice amount
图9 酒曲添加量与番石榴汁添加量交互作用的等高线和响应面分析
Fig.9 Response surface plots and contour lines of the interaction between wine koji amount and guava juice amount
由图7可知，响应面有极大值，说明发酵时间（A）与酒曲添加量（B）因素水平合理。当发酵时间不变时，番石榴米酒的感官评分随酒曲添加量的增加呈现先升高后降低的趋势；当酒曲添加量不变时，番石榴米酒的感官评分随发酵时间的延长呈现先升高后降低的趋势。响应面曲面较平缓且等高线的形状近似圆形，说明发酵时间（A）与酒曲添加量（B）之间的交互作用对番石榴米酒感官评分影响并不显著。
由图8可知，响应面有极大值，说明发酵时间（A）与番石榴汁添加量（C）因素水平合理。发酵时间不变的条件下，感官评分随着番石榴汁添加量的增加出现先升高后降低的趋势；番石榴汁添加量不变的条件下，感官评分随发酵时间的延长出现先升高后降低的趋势。响应面曲面较陡且等高线的形状近似椭圆形，说明发酵时间（A）与番石榴汁添加量（C）因素之间的交互作用对番石榴米酒感官评分的影响较大。番石榴汁添加量（C）的陡峭度大于发酵时间（A）的陡峭度，番石榴汁添加量（C）的等高线密度高于发酵时间（A）的等高线密度，说明番石榴汁添加量（C）对番石榴米酒发酵的影响大于发酵时间（A）对番石榴米酒发酵的影响。
由图9可知，响应面有极大值，说明酒曲添加量（B）与番石榴汁添加量（C）因素水平合理。酒曲添加量不变的条件下，感官评分随番石榴汁添加量的升高出现先升高后降低的趋势；番石榴汁添加量不变的条件下，感官评分随酒曲添加量的增加出现先升高后降低的趋势。响应面曲面较陡且等高线的形状近似椭圆形，说明酒曲添加量（B）与番石榴汁添加量（C）因素之间的交互作用对番石榴米酒感官评分的影响较大。番石榴汁添加量（C）的陡峭度大于酒曲添加量（B）的陡峭度，番石榴汁添加量（C）的等高线密度高于酒曲添加量（B）的等高线密度，说明番石榴汁添加量（C）对番石榴米酒发酵的影响大于酒曲添加量（B）对番石榴米酒发酵的影响。
综合以上分析，酒曲添加量、发酵时间与番石榴汁添加量之间有一定的交互作用，其中发酵时间和番石榴汁添加量的交互作用最强，最佳预测点在试验考察范围内。因此，该二阶模型具有良好的拟合度，能真实地描述各因素与响应值之间的关系。应用Design-Expert 8.0 分析，在最佳的发酵工艺为发酵时间8.32 d、番石榴汁添加量41.1%和酒曲添加量0.6%的条件下，感官评分预测值为87.5。
2.4 验证试验
基于试验的可操作性，调整优化的发酵工艺：发酵时间8 d、番石榴汁添加量41%、酒曲添加量0.6%，3次重复验证试验。此条件下，番石榴米酒的感官评分为88.7±1.5，响应面的试验值与回归方程预测值良好吻合，模型预测性强。番石榴米酒的酒精度为（15.2±0.3）%vol，其酒体色泽清亮，风味醇香，无苦涩味，典型性好。
3 结论
本研究以番石榴和糯米为原料，在米酒传统工艺的基础上加入番石榴汁进行酿制，采用单因素试验、Box-Behnken 试验设计和响应面法对番石榴米酒的工艺进行优化，得到最佳工艺条件为发酵时间8 d、番石榴汁添加量41%、酒曲添加量0.6%。此条件下，番石榴米酒的感官评分为88.7±1.5，酒精度为（15.2±0.3）%vol，经发酵得到的番石榴米酒色泽清亮、呈淡黄色，口感醇厚且无异味，兼具番石榴和米酒的风味。本研究为番石榴利用及新型米酒的开发提供参考，对我国酒业开发及番石榴产业发展具有重要意义。
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