灵芝[Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.]属于担子菌纲、多孔球菌科、灵芝属。灵芝胶囊具有补气血、安神、止咳、镇静、平喘功效[1]。灵芝及其有效成分具有调节血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等作用[2]。灵芝子实体成分中富含多种天然人体多种必需类维生素物质及活性氨基酸、多糖、三萜酮等多种抗肿瘤生物合成活性多肽物质，其中灵芝多糖已经被证实为灵芝子实体提取物中具有抗癌与抗氧化两种功效的主导生理活性物质[3]。多糖作为灵芝子实体中主要有效成分，由于它的深度开发和利用，目前已经成为研究热点。在其他功能活性方面：吴睿婷等[4]的研究中报道了黑灵芝多糖对II 型糖尿病大鼠血糖血脂水平调节作用及正常肠道菌群功能的影响。在食品工业生产方面：周春晖等[5]的研究中报道了通过对灵芝多糖功能饮料产品的工艺研发设计，以及对体外生物抗氧化物质活性分析。
现阶段关于灵芝多糖的相关研究已被大量报道[6-10]：王晓玲等[7]在研究中报道了米酒糟培养泰山赤芝工艺；李双祁等[9]在研究中报道了灵芝发酵在美白因子方面的探析；游俊健等[10]在研究中报道了灵芝子实体多糖的变化规律。国内对此已有文献的报道研究工作多集中于灵芝多糖的分离提取的条件分析和制备工艺[11]，而国外对灵芝子实体多糖提取发酵的工艺、抗氧化等活性方面研究鲜见报道[12]。为深入研究灵芝子实体多糖的生物发酵萃取工艺稳定性和生物抗氧化生理活性，本系列研究还备选出了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、产朊假丝酵母（Candida utilis）和扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）3 种酵母菌可以对各种灵芝子实体多糖等进行直接发酵，其中酿酒酵母菌株属于传统直接发酵的菌株[13]；而产朊假丝酵母中的多糖蛋白质类和水溶性维生素及辅酶B 群类的物质含量等与传统普通的酿酒酵母菌相比前者较小远略超过后者[14]，产朊假丝酵母也作为另外一种十分重要的发酵工业微生物，产朊假丝酵母可作为一种有机食品微生物安全检测菌种使用（美国食品药品监督管理局认证），它能广泛运用于各种食品发酵添加领域和化学制药业应用领域，以及多种饲料工业应用的行业。而扣囊复膜孢酵母菌株除了发酵产酶性和抗糖化降解能力强，另外它的产香和产酯能力较好，是我们近年来食品发酵加工行业应用研究探讨的研究热点[15]。
另外，由于清除游离自由基也是表征生物体抗氧化还原能力水平的另外一个比较重要的指标，而1，1-二苯基-2-亚苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基是一种分子结构相容性较好且稳定活性好的含氮自由基，有着较强的可重复性和广泛的使用范围。所以为了进一步研究开发及挖掘和拓展灵芝子实体的食药价值和应用，本研究将DPPH 自由基清除率作为灵芝子实体多糖发酵工艺参数优化的选取指标。
本研究以灵芝子实体为原料，通过传统水提法制备灵芝子实体多糖液，通过生长曲线、DPPH 自由基清除率和铁离子还原力分析挑选出发酵优势菌株。在灵芝单因素试验设计方法和研究基础上，利用Box-Behnken 试验设计的响应面法，优化确定灵芝子实体多糖产品的发酵与提取关键工艺条件，为灵芝子实体多糖研制或开发等提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灵芝子实体：市售；发酵常用菌种（酿酒酵母、产朊假丝酵母、扣囊复膜孢酵母）：河南省工业微生物菌种保藏工程技术研究中心。
DPPH 自由基清除能力试剂盒、铁离子还原能力测试试剂盒：上海原鑫生物科技有限公司；多糖含量测试盒：江苏三黍生物科技有限公司；纤维素酶（50 000 U/g）：上海华上翔洋生物技术有限公司。维生素C：上海沪震实业有限公司；蒽酮：上海源叶生物科技有限公司；硫酸、无水乙醇：北京伊诺凯科技有限公司，所有化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-5 紫外可见吸收分光光度谱计：上海元析仪器有限公司；JY6002 电子天平：上海精其科技有限公司；0.22 μm 微孔过滤器：北京泽平科技有限责任公司；FS-1000FPM 超声波清洗机：苏州富怡达超声波有限公司；JC-80 粉碎机：青岛聚创环保集团有限公司；KH23A 冷冻离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；LH-PH3M pH 计：北京连华永兴科技发展有限公司；CT-B 蒸汽灭菌器：济南天勤好生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种的选取
分别选取产朊假丝酵母、扣囊复膜孢酵母、酿酒酵母，以及酿酒酵母和产朊假丝酵母混合菌种、酿酒酵母和扣囊复膜孢酵母混合菌种、产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母混合菌种；后三者混合体积比均为1∶1，多糖样品的制备浓度为0.5 mg/mL，将未发酵样品设为试验对照，并进行4 次平行重复验证。筛选出最佳菌株进行灵芝子实体多糖发酵。
1.3.2 培养基制备
酵母粉和麦芽糖提取物粉培养基（yeast maltose，YM）配方：葡萄糖2 g，酵母粉0.4 g，蛋白胨粉1 g，麦芽提取物粉0.4 g，蒸馏水100 mL。121 ℃灭菌15 min。
1.3.3 菌种生长曲线绘制
选取抗氧化生物活性含量高的产朊假丝酵母、扣囊复膜孢酵母，按照1%的接种菌量分别接种于YM 酵母培养基，分别设定培养时间（0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h） 为横坐标，设定纵坐标为吸光度（OD600），根据以上参数绘制生长周期曲线，观察菌种的生长周期。
1.3.4 发酵原液制备
以灵芝子实体为基本原料，采用水提法提取灵芝子实体多糖[料液比为1∶20（g/mL），提取温度为75 ℃，提取时间为3 h][16]。制备含有灵芝子实体多糖的YM 发酵培养基（200 mL），首先制备并处理好灵芝子实体多糖提取液，用来替代YM 发酵培养基中原本所用的蒸馏水，制备好的YM 发酵培养基于121 ℃下灭菌处理15 min，静置或经冷却干燥处理后即可以获得灵芝子实体多糖YM 培养基。酵母菌的接入量为3%，25 ℃的条件下静置培养发酵至温度55 h，获得灵芝子实体多糖发酵液，以备待用。
1.3.5 多糖的制备及含量测定方法
将已发酵加工完毕后的灵芝子实体发酵液，加相同体积的蒸馏水经稀释处理后，首先加入纤维素酶10 mg/mL；然后进行超声波水浴处理（超声温度为70 ℃，超声时间为15 min，超声功率为80 W）；6 000 r/min 离心20 min；取上清液进行sevag 法脱蛋白2 次；4 000 r/min离心10 min 后取上清液；上清液加入3 倍体积的95%乙醇过夜（12 h）使得多糖沉淀完全；干燥后获得粗多糖。通过总淀粉多糖含量试剂盒进行葡萄糖标准曲线测定[17]，精密吸取葡萄糖标准液（0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）用蒸馏水补充至2 mL，以蒸馏水为空白对照，室温下80 ℃水浴15 min，冷却至室温，于540 nm处测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程。
1.3.6 DPPH 自由基清除能力的测定
通过DPPH 自由基清除能力试剂盒进行测定：分光光度计预热30 min 以上，调节波长至515 nm，无水乙醇调零。阳性对照的准备：若需要线性关系，建议将10 mg/mL 的维生素C 溶液用提取液配制成0.3、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL 的维生素C溶液待用，若需要清除率约为100%的阳性对照，则建议将10 mg/mL 维生素C 溶液用提取液配制成大于0.3 mg/mL 的维生素C 溶液待用。
通过下面公式计算DPPH 自由基清除率。
式中：Ai 为测定管的吸光度，Aj 为阳性对照管的吸光度，A0 表示空白管的吸光度。
1.3.7 铁离子还原能力的测定
在试管中分别加入0.5 mL 的样品。同时加入2.5 mL pH6.6 的磷酸缓冲液和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液。混合物50 ℃水浴20 min 后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，室温静置10 min。取2.5 mL 反应液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液。反应10 min 后测定700 nm 处吸光度值，以0.1 mg/mL 的丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯为阳性对照。
1.3.8 发酵工艺优化单因素试验
发酵时间分别设置为36、48、60、72、84 h，菌种的接种量分别设置为1%、2%、3%、4%、5%，pH 值分别设置为3、4、5、6、7，发酵温度分别设置为24、26、28、30、32 ℃；另外，在使用初始培养基来测定培养到发酵结束的时间时，接种的量为1%，pH 值为4，发酵温度为28 ℃。根据对以上各项试验研究设定出的试验条件，取200 mL 发酵灵芝子实体多糖发酵液进行灵芝的抗氧化生物学活性参数比较筛选试验，以发酵前灵芝子实体多糖中抗氧化的含量DPPH 自由基清除率因子为试验最终效果评价和重要指标，考察接种量、pH 值、发酵时间及发酵温度对发酵后灵芝子实体多糖的抗氧化生物学活性影响。
1.3.9 发酵工艺优化响应面试验设计
本研究通过Box-Behnken 试验设计[18]，在单因素数据优化和统计基础上对灵芝子实体多糖的发酵工艺参数的响应面试验优化，本研究设定4 个自变量，分别为发酵时间（A）、接种量（B）、pH 值（C）和发酵温度（D），发酵完成后得到的灵芝子实体多糖中的DPPH自由基清除率为响应值（Y）；响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface test factors and levels
水平 A 发酵时间/hB 接种量/% C pH 值 D 发酵温度/℃-1482426 0603528 1724630
1.4 数据处理与分析
采用Excel 2016 软件来进行数据量的分析统计处理和作图，采用Design Expert 12 软件来进行响应面试验模型的优化设计优化建模和实验仿真和结果分析。
2 结果与分析
2.1 绘制标准曲线
葡萄糖标准曲线见图1。
图1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 Standard curve of glucose
2.2 发酵菌种的选取
2.2.1 菌种抗氧化活性比较
在其生长繁殖过程中，小分子糖即为酵母菌株碳主要的氧源糖，所以有些酵母菌也会通过水酵解将这些大分子糖转变为小分子糖，使得裸露在表面的羟基自由基数目较多，从而显著提高自身抗氧化生物活性[19]。3 种酵母菌株及混合菌种铁的DPPH 自由基清除率以及对铁离子氧化还原反应能力等数值比较关系见图2。
图2 3 种酵母菌株及混合菌种的DPPH 自由基清除率以及铁离子还原能力的比较
Fig.2 Comparison of DPPH free radical scavenging rate and iron ion reduction ability in three yeast strains and mixed cultures
*代表产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母混合菌种的抗氧化活性在同一指标下组间差异显著（P＜0.05）。
由图2所示，发酵后抗氧化活性高于发酵前水平。许多研究表明多糖的抗氧化活性与其分子量有关，Yang 等[20]和Liu 等[21]的研究表明多糖的分子量在通过发酵后是低于发酵前的水平，并且发酵后活性提高。而其中产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母在发酵灵芝子实体多糖后DPPH 自由基清除率明显高于传统的酿酒酵母（P＜0.05）。可能由于产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母不但可以利用单糖、二糖，而且可以利用三糖，对小分子糖消耗多，可以显著降低多糖分子量。另外产朊假丝酵母与扣囊复膜孢酵母所产生的胞外多糖量相对大，而本身其产蛋白量高，胞外多糖抗氧化能力可能也优于传统酿酒酵母[22]。DPPH自由基清除率和铁离子还原力数据均显示，产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母混合菌种的抗氧化活性较之其它各组最显著（P＜0.05）。
2.2.2 菌种生长曲线
通过抗氧化活性结果分析，选取产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母测定生长曲线。产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母测定生长曲线见图3。
图3 两种酵母菌的生长曲线
Fig.3 Growth curves of two yeast strains
由图3可知，在12 h 时，产朊假丝酵母会比扣囊复膜孢酵母要先一步而进入对数的增长的后期阶段；在36 h 时，两种菌株的菌丝生长均处于较平稳时期；而在两个菌种生长到超过60 h 时均将进入菌丝生长稳定期。
综上所述，产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母进行混合的菌种对灵芝子实体多糖发酵后抗氧化活性最好，后期选取产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母混合菌为发酵菌种。
2.3 发酵工艺优化单因素试验
2.3.1 发酵时间对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响
发酵时间对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响见图4。
图4 发酵时间对多糖DPPH 自由基清除率的影响
Fig.4 Effects of fermentation time on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides
由图4可知，菌株发酵时间在36 h 和60 h 这两个生理时期之间的多糖DPPH 自由基清除率差异十分明显，菌株在这个时间段的生长逐渐加快，处于高对数的生长时期。对单糖和半双糖等多种小分子糖利用率亦不断提高，抗氧化物质活性指数也出现明显上升。随着发酵过程持续进行，发酵液培养基中多糖的DPPH 自由基清除率在发酵60 h 左右才逐渐开始保持平稳。随着发酵时间逐渐增加，小分子糖原在菌种逐渐水解下不断减少[19]，发酵时间为60 h 时，发酵液中多糖DPPH 自由基清除率已趋于稳定。因此，发酵时间以60h 为宜。
2.3.2 接种量对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响
接种量对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响见图5。
图5 接种量对多糖DPPH 自由基清除率的影响
Fig.5 Effects of inoculating volume on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides
由图5可知，当发酵菌种接种量小于3%时，灵芝酵母菌接种量与灵芝子实体多糖的DPPH 自由基清除率呈正比，而DPPH 自由基清除率又随着灵芝接种菌量的增加而逐步升高，接种菌量为1%时DPPH 自由基清除率最低；而当接种菌量大于3%以上时，DPPH 自由基清除率反而下降，可能正是由于抑制菌种的不断增殖产生并会不断地积累成一些抑制性产物，从而大大限制了发酵中菌种的正常生长[13]。因此，接种量以3%为宜。
2.3.3 pH 值对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响
pH 值对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响见图6。
图6 pH 值对多糖DPPH 自由基清除率的影响
Fig.6 Effects of pH on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides
由图6可知，随着pH 值的不断增加，酵母得到稳定生长的同时多糖DPPH 自由基清除率也开始逐步增加，pH 值大于5.0 时，多糖的DPPH 自由基清除率开始明显降低，在pH 值为中性时，酵母菌对发酵液中营养物质的吸收和利用受到影响[18]。在pH 值达到5.0 时，其多糖DPPH 自由基清除率最高。因此，pH 值以5.0 为宜。
2.3.4 发酵温度对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响
作为真核微生物的酵母菌，其最佳适宜温度为25 ℃～30 ℃[23]，上下浮动1 ℃～2 ℃，取24 ℃～32 ℃作为发酵工艺调节温度。发酵温度对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率的影响见图7。
图7 发酵温度对多糖DPPH 自由基清除率的影响
Fig.7 Effects of fermentation temperature on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides
由图7可知，在28 ℃时其DPPH 自由基清除率达到最大。在发酵中温度处于24 ℃～28 ℃时，发酵液样品中多糖DPPH 自由基清除率可随发酵温度的持续升高而逐渐增加。而在发酵中温度处于28 ℃～32 ℃时，多糖的抗氧化活性开始缓慢地降低。因此，发酵温度28 ℃为宜。
2.4 发酵工艺优化响应面试验
2.4.1 Box-Behnken 试验设计和结果
结合发酵过程前期进行的单因素试验取得的有关参数结果，并可以要求在对其进行试验结果基础上再以设定的发酵过程的发酵时间（A）、接种量（B）、pH值（C）、发酵温度（D）作为试验自变量；以灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率（Y）为响应值，设计四因素三水平试验。Box-Behnken 试验设计和结果见表2。
表2 Box-Behnken 试验设计结果
Table 2 Results of Box-Behnken experiments design
试验号因素DPPH 自由基清除率/%ABCD 10-10181.23 2-110074.56 3000092.62 41-10078.15 5000091.59 60-1-1077.23 7000092.35 8001-174.02 9-100178.20 10110088.78 11010-188.66 12-10-1073.67 13011071.61 1400-1-177.20 150-10-182.20 16000093.39 17-100-175.05 18001175.25 19101079.31 200-11067.90 2100-1176.21 22000092.04 23-1-10065.34 24-101058.81 25100192.42 2601-1080.84 2710-1083.54 28010187.48 29100-190.82
本研究采用Design-Expert12 统计软件对表2结果进行二次多元回归分析并获得二次多元回归方程：Y=90.40+7.28A+3.32B－3.48C+0.24D+0.35AB+2.66AC－0.39AD+0.03BC－0.05BD+0.6CD－7.14A2－6.47B2－12.52C2－2.13D2。
2.4.2 回归方差分析显著性检验
回归模型方差分析见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Regression model analysis of variance
注：**表示影响极显著（P＜0.01）。
来源平方和 自由度 均方F 值P 值 显著性模型2 207.72 14157.69 18.81 ＜0.000 1**A636.441636.44 75.92 ＜0.000 1**B132.551132.55 15.81 0.001 4**C145.531145.53 17.36 0.001 0**D0.676 610.676 6 0.080 7 0.780 5 AB0.493 010.493 0 0.058 8 0.811 9 AC28.25128.253.370.087 8 AD0.606 810.606 8 0.072 4 0.791 8 BC0.002 610.002 6 0.000 3 0.986 1 BD0.010 510.010 5 0.001 3 0.972 3 CD1.2311.230.146 2 0.708 0 A2330.441330.44 39.42 ＜0.000 1**B2271.741271.74 32.41 ＜0.000 1**C21 016.7511 016.75 121.28 ＜0.000 1**D229.37129.373.500.082 3残差117.37148.38失拟项115.541011.5525.30 0.003 5**纯误差1.8340.456 6校正总和 2 325.09 28
由表3可知，发酵时间（A）、接种量（B）、pH 值（C）的一次项中及各平方项均对灵芝子实体多糖DPPH 自由基清除率（Y）的影响极显著（P＜0.01）。依据方差分析的结果显示F=18.81，P＜0.000 1，说明该模型进行拟合的程度非常好，回归模型数据极显著（P＜0.01），总决定系数R2=0.949 5，R2Adj=0.899 0（调节决定系数），F 值与响应值呈正相关，F 值越大则对响应值的影响越大。由此得出各因素对DPPH 自由基清除率的影响程度发酵时间（A）＞pH 值（C）＞接种量（B）＞发酵温度（D）。
2.4.3 响应面及等高线分析
两个影响因素间具有交互放大作用：响应面曲线如果坡度越高陡，颜色层次变化越多，则表明该曲线中DPPH 自由基清除率越大，受到的相应影响因素的影响就越大[24]。等高线的各种形状还可以大致反映的出交互效应作用的具体强弱，椭圆形可以表示这两个因素之间交互效应作用十分显著，而圆形则与此之相反。各因素及交互作用对DPPH 自由基清除率的影响见图8。
图8 各因素交互作用对DPPH 自由基清除率水平的影响
Fig.8 Effects of interaction of various factors on DPPH free radical scavenging rate level
从图8可知，发酵时间（A）对菌种发酵影响程度大，使得对多糖DPPH 自由基清除率影响最大，而pH值（C）、接种菌量（B）对菌种发酵影响比培养时间（A）稍弱，发酵温度（D）的变化对菌种发酵的影响程度则相对最低，与表3的分析结果应大体能一致。根据响应面试验分析的结果来对其他各交互项因素的强弱综合评分计算和分析，各交互项因素之间的交互的强弱顺序表现为AC＞CD＞AD＞AB＞BD＞BC。
2.4.4 验证试验
为了能方便进一步试验研究，以确认最佳发酵工艺参数，通过设计响应面分析软件（Design-Expert 12）来收集分析和试验得到的相关数据，获取出下述最佳发酵的工艺参数:发酵时间温度为58.5 h，接种菌量为2.72%，初始发酵pH 值为4，发酵温度为26 ℃。为了进一步更好方便实际菌种发酵的操作，本研究将灵芝子实体多糖发酵最佳发酵工艺参数为发酵时间60 h、接种菌量3%、初始发酵pH 值为4，发酵温度26 ℃。并进行4 次平行试验，在实际操作中，灵芝子实体多糖样品中的DPPH 自由基的清除率达到90%，原试验预测值为92%，两者相比，相对误差较小。由此分析也说明通过响应面优化法而获得回归条件分析模型数据和分析结果均准确与稳定，回归条件分析的模型结果推导过程合理，条件估计分析性能稳定，具有一定科学高度的应用推广价值。
3 结论
本研究重点通过优化菌种生长条件及发酵过程工艺控制，从而有效达到通过微生物发酵灵芝子实体多糖以及提高多糖抗氧化等活性能的工艺目的。结果分析发现以产朊假丝酵母和扣囊复膜孢酵母为主的两种混合发酵菌种可以作为发酵菌株，在混合发酵工艺条件下单因素分析试验设计基础上，依据Box-Behnken 试验设计结果建立了数学模型，通过响应面法进一步优化了发酵试验工艺，从而可获得最佳的混合发酵菌株工艺参数：发酵时间为60 h、接种菌量为3%、pH 值为4、发酵温度为26 ℃。在此条件下，灵芝子实体多糖中DPPH 自由基清除率可以达到最高90%，说明了在采用此发酵的工艺条件下，灵芝的子实体多糖中抗氧化因子活性最好。
本研究重点研究和解决了灵芝子实体多糖发酵菌种的选取和搭配，以及发酵工艺条件的优化，而其中发酵菌种的选取是本研究的重点之一，在兼顾菌种发酵效率和实际应用的基础上提高灵芝子实体多糖的抗氧化活性。前人的研究主要集中在灵芝多糖提取和灵芝自身发酵的工作上，而这也是本研究与其他研究人员的区别。通过开展本方向研究能为该领域以后的灵芝子实体和相关生物产业发展理论和现实应用问题提供相关理论参考。
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