板栗，又名毛栗，在中国已有至少2 500年的种植历史，素有“坚果之王”的称号。板栗经加工后入口味道甘甜、口感独特。板栗属于坚果类，富含淀粉、酚类物质、氨基酸、蛋白质、植物多糖等营养成分。板栗具防止高血压、冠心病等疾病以及抗衰老、补气血、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗凝血、抗疲劳等多种生理功能[1-3]。
研究显示，低温条件可有效降低果蔬采后的生理活动，是保持其贮藏品质和营养价值的常用有效手段[4]。贮藏温度过高，会加速板栗果实的失水萎蔫以及软化和腐烂现象。而温度过低，容易引发果实冷害和冻害问题，细胞组织受到不可逆损伤，果实出现表皮烫伤、果肉（果心）褐变等症状，严重降低果实贮藏品质。只有将温度控制到恰当的低温范围内，方可有效抑制果实呼吸强度，并减缓其乙烯的释放，各种生理代谢及酶活性水平降低并保持相对稳定，从而减少营养损耗，延缓果实的后熟和衰老过程，实现其贮藏和货架期的延长[5]。
此外，贮藏环境中温度的波动会对果实贮藏品质产生不利影响[6]，且每相差10 ℃，生物反应速率会提高2 倍～3 倍[7]。田津津等[8]研究发现，运输过程中温度波动越大，猕猴桃的营养成分损失越严重，果实也会加快衰老进程。刘佳等[9]通过扫描电子显微镜研究发现，零温度波动的环境条件下，樱桃能很好地保持果实的组织结构。同时，张哲等[10]研究发现，较大的温度波动会加剧葡萄中维生素C（vitamin，VC）的损耗，硬度下降也会加快。目前以国内现有技术条件，很难实现果蔬贮藏环境温度的绝对零波动，且温度“零波动”也可能诱导加剧果蔬冷害现象的产生。所以科学地控制贮藏温度波动条件，对于延长果蔬贮藏寿命具有重要意义。
Mata 等[11]研究发现，西红柿在采后的储存和运输过程中温度并非恒定，而是在10 ℃～15 ℃之间上下波动，较大的温度波动对西红柿的品质造成了不可逆的影响。而从板栗采后贮藏到加工期间，也存在因环度温度波动过大，从而引起板栗品质的劣变，导致商业价值降低的现象。因此，本研究主要探讨不同温度波动条件下板栗果实贮藏品质的变化，通过板栗贮藏期间的呼吸强度、失重率、腐烂率和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性变化以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量等生理生化指标，确定板栗贮藏所需的最佳条件。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
板栗：迁西县盛益隆食品有限公司。购买板栗品种为3113，板栗成熟度为八成熟，购买后在0 ℃环境中预冷24 h。
无水乙酸钠：廊坊天科生物科技有限公司；冰醋酸：天津市大茂化学试剂厂；2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸、邻苯二酚、聚乙二醇600、愈创木酚（纯度≥98%）、无水乙酸钠、冰醋酸、盐酸、葡萄糖、甲醇：天津百奥泰科技发展有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
气调保鲜库（GHT-200）、温度梯度箱（MT8102iE）：天津捷盛东辉保鲜科技有限公司；果蔬呼吸测定仪（GXH-3051H）：北京均方理化科技研究所；新世纪紫外分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司；高速冷冻离心机（TGL-16）：四川蜀科仪器有限公司；恒温水油浴锅（GY-1/2L）、电子天平（TD10002A）：奥豪斯仪器（常州）有限公司；酶标仪（ST-360）：上海寰煕医疗器械有限公司；高精度温度采集器（2638A）：美国福禄克公司。
1.3 方法
将预冷后的板栗装入打孔聚乙烯保鲜袋内，每袋200 g 左右，随机分成4 组，于基准温度为0 ℃条件下贮藏，分别置于如下贮藏环境中。1）双层泡沫箱，夹层填充保温棉，并置于温度控制箱，实现±0.1 ℃温度波动环境；2）单层泡沫箱，并置于温度控制箱，实现±0.5 ℃温度波动环境；3）普通冷库，由于普通冷库环境的温度波动为±1.0 ℃，因此不需要温度控制箱调节温度波动环境，直接存放于冷库中即可实现±1.0 ℃温度波动环境；4）普通冷库＋温度控制箱，实现±2.0 ℃温度波动环境。湿度条件均为90%～92%，试验全程使用高精度温度采集器监测试验装置的温度波动，确保温度在所设定的温度波动范围。定期随机取样，测定不同温度波动条件下板栗的贮藏指标。
1.4 指标测定及计算
1.4.1 呼吸强度的测定
呼吸速率使用呼吸强度测试仪进行测量，参照Du等[12]的测量方法，计算公式如下。
式中：X 为呼吸速率，mg/（kg·h）；W1 为空白罐中CO2 含量，%；W2 为测定后呼吸罐总CO2 含量，%；V 为呼吸罐总体积，L；M 为CO2 的摩尔质量，44 g/mol；V0为常温下CO2 的摩尔体积，L/mol；m 为果实质量，kg；t为测量时间，h。
1.4.2 失重率的测定
对4 种温度波动条件下贮藏的板栗每周进行1 次称重，每次随机选取30 个板栗进行失重率试验。失重率计算公式如下。
式中：W0 为初始质量，g；W1 为储存期间测量的质量，g。
1.4.3 腐烂率的测定
将板栗装袋（每袋约200 g）后分别于4 个精准控温箱存放，每周进行一次腐烂率评价。以板栗果实内部有明显真菌生长或细菌损伤为标准进行评价。腐烂率计算公式如下。
式中：N 为腐烂果实数；T 为果实总数。
1.4.4 PPO 活性的测定
采用Galeazzi 等[13]的方法测定板栗的多酚氧化酶活性。
1.4.5 POD 活性的测定
POD 活性采用Du 等[12]的方法测定。
1.4.6 丙二醛含量的测定
MDA 含量采用Li 等[14]的方法测定。根据以下公式计算每克果蔬样品中的MDA 含量（鲜重）。
式中：C 为反应混合物中MDA 浓度，μmol/g；V 为样品提取液总体积，mL；VS 为测定过程中吸收的提取液体积，mL；m 为样品质量，g。
1.4.7 微观结构
根据Liu 等[15]的方法，用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察板栗果实组织的微观结构。将板栗样品切成3 mm×3 mm×3 mm 的均匀小块，浸泡于2.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定过夜。再用梯度浓度的乙醇（70%、80%、90%、95%）和无水乙醇依次洗脱样品，每次15 min。最后用乙酸异戊酯处理15 min，晾干后于-65 ℃冷冻干燥12 h 后，将样品固定在铝装载平台上，镀金40 s～60 s，然后通过SEM 在样品放大500 倍条件下观察其微观结构。
1.5 数据处理
试验各处理均重复至少3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS Statistics 26 软件进行显著性分析；采用Origin 2021 软件分析作图。
2 结果与分析
2.1 温度波动对板栗呼吸强度的影响
板栗属呼吸跃变型果实，作为板栗采后最基本的生命活动，呼吸强度可以直观地反映出板栗果实后熟、衰老以及营养物质损耗等情况，而低温是抑制果实呼吸的有效方法[16]。因此，在板栗贮藏期间，不同温度波动条件下呼吸变化规律不同，导致板栗果实品质变化以及货架期长短也有所差异。不同温度波动对板栗呼吸强度的影响见图1。
图1 不同温度波动对板栗呼吸强度的影响
Fig.1 Effects of different temperature fluctuations on respiration intensity of Castanea mollissima
由图1可知，果实的呼吸强度基本上呈现先升高后降低的趋势，贮藏期间呼吸强度最大值即为呼吸高峰，呼吸高峰出现前，较大的温度波动会提升果实呼吸强度；而呼吸高峰出现后，规律性并不明显。且不同温度波动条件下果实呼吸高峰的出现时间也存在一定的差异。±2.0 ℃组果实呼吸高峰出现时间最早，为60 d，±0.1 ℃组、±0.5 ℃组和±1.0 ℃组的呼吸高峰出现在80 d 之内，且±0.1 ℃组的呼吸强度最小。结果表明，±0.1 ℃组的呼吸高峰较±2.0 ℃组的呼吸高峰明显延迟了20 d，且呼吸速率较±2.0 ℃组降低了2.59 mg/（kg·h）。这种差异的存在，可能与呼吸代谢酶活性被激活的程度有关。显然，较小的温度波动对于延缓果实呼吸高峰的出现和降低呼吸强度具有正向作用，从而有利于延长果实的贮藏寿命。因此，±0.1 ℃温度波动条件更有利于抑制板栗采后贮藏的呼吸代谢和后熟衰老。
2.2 温度波动对板栗失重率的影响
板栗采后由于隔离了母体的水分和营养供给，果实贮藏过程中由于细胞的生命活动会出现失重现象。果实的失重主要由蒸腾失水和干物质损耗引起，分别各占3/4 和1/4 的贡献度[17]。不同温度波动对板栗失重率的影响见图2。
图2 不同温度波动对板栗失重率的影响
Fig.2 Effects of different temperature fluctuations on the weight loss rate of Castanea mollissima
由图2可知，板栗在贮藏期间失重率不断升高，各温度波动条件下果实的失重率变化各有差异，基本规律为失重率的变化与温度波动幅度均呈正相关。贮藏120 d，各组果实的失重率分别达到3.41%、3.98%、4.69%和4.96%，其中±0.1 ℃组果实的失重率最小，比±2.0 ℃组果实失重有效降低了1.55%。由此可见，降低环境的温度波动，可以有效减少板栗贮藏过程中的质量损失，其中±0.1 ℃的温度波动条件对于减少果实贮藏过程中的失重现象最为有效。
2.3 温度波动对板栗腐烂率的影响
板栗的腐烂主要有真菌病害腐烂和生理病害腐烂两种。不同温度波动对板栗腐烂率的影响见图3。
图3 不同温度波动对板栗腐烂率的影响
Fig.3 Effects of different temperature fluctuations on decay rate of Castanea mollissima
由图3可知，随着板栗贮藏时间的增长，板栗均会发生一定的腐烂，在贮藏时间达到120 d 时，4 组温度波动条件下的板栗腐烂率分别为5.90%、8.62%、13.96%和16.92%，其中±0.1 ℃组的腐烂率最低，比±2.0 ℃组果实腐烂率有效降低了11.01%。由此可见，降低环境的温度波动，可以有效减少板栗在贮藏过程中发生的腐烂问题，其中±0.1 ℃温度波动条件对于减少果实贮藏过程中的腐烂现象最为有效。原因可能为较大的温度波动会加速果蔬内部的呼吸作用、氧化作用等生命活动，加速果实营养成分的流失以及细胞结构的损失，且这种伤害无法挽回，最终导致果实抗病菌能力下降，给予微生物入侵的机会，造成果实腐烂现象。
2.4 温度波动对板栗中PPO 活性的影响
PPO 被认为是导致收获后果实发生酚类褐变的主要因素[18]。由于氧化胁迫，PPO 将多酚催化氧化[19]，进而与氨基酸反应导致果实变色。不同温度波动对板栗PPO 活性的影响见图4。
图4 不同温度波动对板栗PPO 活性的影响
Fig.4 Effects of different temperature fluctuations on PPO activity of Castanea mollissima
由图4可知，各组PPO 活性随着贮藏时间的延长整体呈现出先升高后降低的趋势，4 组板栗的PPO 活性高峰期均出现在60 d 左右，±0.1 ℃组果实的PPO 活性明显低于其他3 组，±2.0 ℃组果实PPO 活性最高，相比之下，在贮藏至第60 天时，±2.0 ℃组果实PPO活性是±0.1 ℃组果实PPO 活性的1.38 倍。结果表明，±0.1 ℃的温度波动条件下有助于抑制板栗果实中PPO的活性，从而增加果实的防褐变能力，但各组的PPO活性在贮藏后期迅速下降，这可能与果实的营养成分流失，逐渐衰老有关。
2.5 温度波动对板栗中POD 活性的影响
POD 是活性氧自由基清除系统中一类重要的单电子氧化酶，是果蔬成熟、衰老和品质下降的生理指标[20]。龙国辉等[21]研究发现过氧化物酶能通过控制木质素合成阻止细胞进一步受损。POD 也会催化过氧化氢氧化酚类，产生醌类物质，进而使果蔬发生氧化作用[22]。不同温度波动对板栗POD 活性的影响见图5。
图5 不同温度波动对板栗POD 活性的影响
Fig.5 Effects of different temperature fluctuations on POD activity of Castanea mollissima
由图5可知，4 种温度波动条件下，板栗果实的POD 活性均随着贮藏时间的延长而上升，其原因可能为在贮藏期间，当板栗果实受到损伤，POD 的潜在活性被激发。其中±2.0 ℃组的板栗果实POD 活性增加量最大，达到了5.76 U/g，是±0.5 ℃组和±0.1 ℃组的1.71倍和2.03 倍，原因可能是温度发生波动时激活了板栗细胞的防御机制，产生过氧化氢，而过氧化氢激发了POD 的活性，并进一步参与合成木质素，阻止板栗果实继续受损。
2.6 温度波动对板栗中MDA 含量的影响
丙二醛是膜脂过氧化作用的重要产物之一，其可以引起核酸和蛋白质等生物大分子交联聚合，继而毒害细胞。MDA 的产生既可以间接反映植物体抗逆性，也可以反映生物膜系统的损伤程度。不同温度波动对板栗MDA 含量的影响见图6。
图6 不同温度波动对板栗MDA 含量的影响
Fig.6 Effects of different temperature fluctuations on MDA content of Castanea mollissima
由图6可知，板栗的MDA 含量在贮藏期不断升高，其主要与果实的成熟衰老生理有关，然而不同的温度波动对MDA 含量的变化产生了不同的效果。与±1.0 ℃和±2.0 ℃组相比，±0.1 ℃的温度波动条件可以有效抑制MDA 的产生，贮藏120 d 时，其MDA 的含量分别降低了5.83 μmol/g 和7.55 μmol/g。这说明较高的温度波动会加剧对细胞质膜的毒害，温度波动越小，越能够有效降低果实细胞膜体系所受的逆境损伤。因此，±0.1 ℃温度波动条件有利于维持果实质膜系统的稳定性。
2.7 温度波动对板栗微观结构的影响
图7为板栗贮藏0 d 以及4 组温度波动处理120 d时组织内部的扫描电镜照片。
图7 不同温度波动程度对板栗微观结构的影响
Fig.7 Effects of different temperature fluctuations on the microstructure of Castanea mollissima
a.0 d 的微观结构；b.不同温度波动下贮藏120 d 后的微观结构，其中1 为±0.1 ℃120 d 时的微观结构，2 为±0.5 ℃120 d 时的微观结构，3 为±1.0 ℃120 d 时的微观结构，4 为±2.0 ℃120 d 时的微观结构。
由图7可知，在最初阶段（图7a）板栗的结构比较完整，具有很明显的连续性，说明板栗没有受到损伤；而在贮藏后期（图7b），4 组处理的板栗组织均出现明显的不连续，甚至±2.0 ℃组板栗部分区域以及±1.0 ℃组板栗出现了裂缝的现象，可能是因为果实完全成熟，造成的细胞组织老化，但是±0.1 ℃组的板栗成熟期晚于另外两组，所以板栗组织相对较完整。因此，温度对板栗的组织有很重要的影响，并且当温度发生波动时，波动的幅度越大，对板栗的组织破坏就越大。
3 结论
本文研究4 种温度波动条件对板栗贮藏品质的影响，结果表明：温度波动对板栗的贮藏品质有很大影响，±0.1 ℃温度波动条件下板栗果实在贮藏条件期间能够有效降低板栗果实的呼吸强度并推迟呼吸高峰的出现。在±0.1 ℃温度波动条件下，PPO、POD 的活性以及MDA 的产生也能得到充分抑制，这有利于抑制果实产生氧化作用，保持果实的水分、营养成分以及细胞内部的稳定性，在降低失重率以及减少腐败现象的产生方面具有显著效果。温度波动越大，果实的采后生理活动越强，后熟与衰老现象越严重，营养物质的损耗也会相应加剧，最终对板栗品质产生不可逆的伤害。综上，较大的温度波动对板栗的品质和微观结构具有负向影响，而±0.1 ℃温度波动条件下能有效延缓果实衰老，±0.1 ℃温度波动条件条件下能够更好地保持果实品质不受环境影响，有利于指导生产实践，具有潜在可观的市场应用价值。
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