卡拉胶（carrageenan）又称鹿角藻胶、角叉菜胶等，与海藻酸盐、琼脂胶同为三大工业海藻多糖，是重要的经济产品[1]。卡拉胶类型多样，包括λ、ν、κ、μ、ζ、ι和θ等类型[2]，其中κ 卡拉胶最为常见。κ 卡拉胶（κ-carrageenan，κ-C）是一种重要的海洋硫酸多糖，可以作为重要加工原料和降解改性活性材料[3-5]，在食品、药物、化妆品等领域受到广泛关注[6-8]。
溶解性问题是制约多糖研究深度和应用广度的普遍问题[9]。κ-C 存在常温下难溶解的问题，在κ-C 溶解之前进行加热的必要性会对其在食品和药物系统中的一些应用，产生较大的工业化和技术限制。以往针对κ-C 溶解性的改善多采用添加助溶剂（如钠盐、钾盐、磷酸盐等）的方式进行，存在成本较高、食品安全隐患大、在不同食品中使用受限等问题。
超声技术是一种常见的食品非热加工技术，以其独特的加工优势，在食品工业中，被广泛应用于辅助提取、解冻、干燥、清洗、灭菌等过程，发挥着越来越重要的作用[10]。因而，研究超声对于食品原料的影响就更显得尤为重要[11]。除此之外，在多糖的无加热凝胶化，以及通过超声来辅助进行多糖膜的制备方面，超声技术也得到越来越多的应用[12]。例如，有学者研究发现通过超声处理可以实现κ-C 的冷凝胶化，即免除加热阶段，只通过超声作用来完成整个凝胶化过程[12]。也有学者发现在经过超声处理后，糊化淀粉多糖的溶解度会显著增加[13]。但是以往研究中存在超声处理时间较短，处理过程添加盐类物质助溶等现象，缺乏对超声处理改善κ-C 多糖溶解性的更直观表示，关于超声对κ-C结构和功能性质的作用规律研究也尚不全面，故有待进一步研究。
本文通过对κ-C 进行超声处理，研究其改善κ-C溶解性的可行性，并总结超声处理对κ-C 的作用规律。不仅可以缩短加工时间和降低能耗，提高κ-C 使用的便利性，推动其在医药、食品等诸多领域的进一步工业化应用，同时也可为解决其他多糖溶解性问题提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
精制κ 卡拉胶：临沂艾德森生物科技有限公司；硝酸钠、无水乙醇：天津市江天化工有限公司；标准葡聚糖（优级纯）：美国Sigma 公司；DNS 试剂、0.22 μm 聚醚砜滤膜、透析袋（50 mm×5 m）：北京索莱宝公司。
1.2 仪器与设备
TA.XT.plus 质构测定仪：Stable micro systems 公司；X622-ZH 电子天平：奥豪斯中国分公司；W1-600/0.5 超高压设备：华泰森淼超高压装备工程技术有限公司；JY92-IIN 超声破碎仪：宁波新芝生物有限公司；Bruker 700M 核磁共振仪、SU1510 扫描电子显微镜：日本Hitachi 公司；Q50 热重分析仪：美国TA Instruments有限公司；LD-10 高速大容量冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；LP Vortex Mixer 加热磁力搅拌器：赛默飞世尔科技有限公司；MARS60 动态流变仪：德国HAAKE 公司；CHRIST 快速冷冻干燥机：北京五洲东方科技发展有限公司；INFINITE 200 PRO 酶标仪：瑞士TECAN 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备
称量κ-C 样品，用去离子水配制成10.00 mg/mL的溶液。采用超声破碎仪在常温下对该溶液进行超声处理，设置参数为超声功率617.5 W，设置超声时间分别为0、15、30、60、240 min，超声探头深入液面1.5 cm。超声过程中添加温度监控和降温装置并通过延长间歇时间来保证超声温度稳定。处理完毕进行冻干，得到不同超声时间处理的κ 卡拉胶超声样品（κ-CUT）。
1.3.2 分子量测定
以0.1 mg/mL 的硝酸钠溶液作流动相。将1.5 mg样品用1 mL 0.1 mg/mL 的硝酸钠溶液60 ℃搅拌充分溶解，过0.22 μm 的聚醚砜滤膜收集过滤液备用。采用配备示差检测器的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定不同超声处理时间样品的分子量。柱温箱温度设置为40 ℃，色谱柱为ultrahydrogel column linear（10 μm，7.8 mm×300 mm），流速为0.6 mL/min。以不同分子量的葡聚糖作为标准品对样品的分子量进行标定。根据HPLC 出峰时间和分子量对数绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品分子量。
1.3.3 还原糖含量测定
取干净试管并标号1～6，分别加入1 mg/mL 的葡萄糖标准液各0、20、40、60、80、100 μL，加水补至1 mL混匀备用。另取几支标号后的试管各加入1 mL 的2 mg/mL 浓度待测样品溶液。分别向试管中加入2 mL的DNS 试剂，随后在沸水浴中煮沸5 min 后迅速取出，用自来水冷却至室温。随后向各管中加入9 mL 去离子水稀释并涡旋充分混匀。从各管中取200 μL 于酶标板中，以1 号管空白对照组调零，检测540 nm 处的吸光度，绘制标准曲线并计算各样品还原糖含量。
1.3.4 溶解性测定
溶解度通常用水溶性指数（water soluble index，WSI）来表示。将待测样品烘干至恒重，称取κ-C 样品用去离子水配制成10.00 mg/mL 的溶液，常温下搅拌溶解3 h，11 640 r/min 离心30 min，分离上清液和沉淀，干燥后称量上清液的质量。水溶性指数计算公式如下。
式中：m 为初始样品质量，mg；m1 为干燥后上清液的质量，mg。
1.3.5 流变特性测定
取一定量样品均匀滴于动态流变仪测试台平行板上，选用直径为60 mm 的平板，平板与样品台间距设置为1 mm。流变学数据使用HAAKE RheoWin 数据管理器软件进行分析。
1.3.5.1 样品制备
将κ-C 和经过不同超声时间处理的超声样品κ-CUT 按溶液质量浓度0.5%、1.0%、1.5%和2.0%溶解于去离子水中，70 ℃搅拌2 h 后静置过夜冷却12 h 至室温，得到样品溶液（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%κ-C 或κ-CUT）。
1.3.5.2 表观黏度测定
在CS/CR 型旋转渐变测量单元下，温度为25 ℃，剪切速率为0.1 s-1～800.0 s-1 条件下测定样品表观黏度。
1.3.5.3 振荡频率扫描
进行应变扫描确定线性黏弹区，随后设置频率为0.1 Hz～10.0 Hz 测定储能模量（G′）和损耗模量（G″）的变化。
1.3.5.4 表观黏度的测定
安装好保温罩并进行硅油涂抹处理，将温度以5 ℃/min 的速度从25 ℃加热至85 ℃，在此温度下保持5 min，然后以相同速度冷却至25 ℃，记录表观黏度值随温度的变化。
1.3.6 质构特性测定
取κ-C 样品、不同超声时间处理得到的κ-CUT样品用去离子水加热配制成浓度为20.00 mg/mL 的凝胶。测试前取出冷却至室温的样品，制备为10 mm×10 mm×10 mm 的正方体样品在室温下进行全质构分析（texture profile analysis，TPA）。试验采用P/36R 探头，设置测前速率5 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，压缩程度50%，停留时间5 s，触发力为5 g[14]。
1.3.7 热稳定性分析
称取5 mg～10 mg 的κ-C、κ-CUT（240 min）样品放入坩埚中，氮气流速为20 mL/min，温度设置为40 ℃～600 ℃，升温速率为10 ℃/min[15]。
1.3.8 样品微观结构观察
将κ-C、κ-CUT（60 min 和240 min）样品进行冷冻干燥后，然后用导电胶将少量样品均匀涂抹并固定在样品架上，表面喷金后在20 kV 的加速电压下，用扫描电镜观察样品放大100 倍和800 倍的形态并采集相应图谱。
1.4 数据统计分析方法
采用SPSS 23.0 软件进行方差分析和差异显著性分析。试验所得数据利用Excel 进行数据整理，通过Origin 2018 软件对试验数据进行绘图。
2 结果与分析
2.1 超声时间对分子量的影响
对超声前后的样品进行分子量测定，结果见图1。
图1 超声时间对κ-C 分子量的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic time on the molecular weight of κ-carrageenan
由图1可知，κ-C 的分子量大小与超声处理时间呈负相关趋势，在超声处理的前60 min，分子量的降低速度最快，但是在60 min 以后分子量降低逐渐缓慢。这可能是由于在超声处理的短时间内，κ-C 分子解聚过程占主导地位，导致分子量急剧下降，溶解度增加。但此后，随着超声处理时间的延长，尤其是超声60 min后，κ-C 中部分分子链被打断，聚合物的降解起主要作用，分子量降低逐渐缓慢[16]。超声处理可以有效降解如κ-C 等多糖而不对分子的整体结构产生较大破坏的作用。但是多糖分子链的降解有其极限，不会随着超声时间延长而发生进一步降解。然而，可以不断增加超声波处理的频率、强度和温度条件，以达到降解的另一个极限[17]。
2.2 超声时间对还原糖含量的影响
多糖分子方向为从非还原端到还原端（含有游离半缩醛羟基的一端）。一个κ-C 分子中可以有多个非还原端，但只有一个还原端。而一个多糖链发生断裂后，则会产生一个还原端基。因此通过测定还原糖含量可以判断多糖链的断裂程度。随着超声处理时间的延长，κ-C 还原糖含量随之变化的情况如图2所示。
图2 超声时间对κ-C 还原糖含量的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on the reducing sugar content in κ-carrageenan
不同字母表示具有显著性差异（p＜0.05）。
由图2可知，κ-C 还原糖含量的大小与超声波作用时间总体上呈正相关趋势。在超声处理的短时间内，虽然发生分子链断裂导致还原糖含量有所升高，但仍然是κ-C 分子解聚过程占主导地位。超声强度一定的条件下，随着超声时间持续延长，κ-C 分子量急剧下降，还原糖含量持续上升，说明卡拉胶分子链的断裂越多，超声对κ-C 的降解作用越强[18]，与图1的结论一致。
2.3 超声时间对溶解性的影响
κ-C 在常温下，由于分子间交联点之间互相纽结，无法进行充分溶解，只会发生溶胀现象。而当在水中进行加热时，由于分子的运动速率随温度升高而加快，分子链间相互连接键更易被打开，因此其分子结构会变得舒展和开放，大分子可以自由分散在水中而不是互相连接缠绕，因此可以形成流动性好的均一溶液，冷却后重新产生凝胶。超声时间对κ-C WSI 的影响如图3所示。
图3 超声时间对κ-C WSI 的影响
Fig.3 Effects of ultrasonic time on the water soluble index of κ-carrageenan
不同字母表示具有显著性差异（p＜0.05）。
由图3可知，在施加超声后，κ-C 的常温WSI 急剧增加，超声时间达到60 min 时常温WSI 达到98.91%并且继续延长超声时间WSI 基本趋于稳定。因此可以得出结论，超声可以显著改善κ-C 在常温下的溶解性。这是由于超声波的空化效应可以产生破坏κ-C 分子内键的剪切力，这一过程导致聚合物构象和结构的改变，将κ-C 的紧密结构在溶液中变成随机线圈，分子结构舒展，亲水区域更加暴露于水分子中，从而使得溶解性增强，更易与水结合形成凝胶[19]。
2.4 流变特性测定
流变学特性是多糖胶体最主要的特性，对流变学等特性变化的研究能较全面地反映多糖分子结构上的变化，因此了解食品的流变特性非常重要[20]。超声处理对κ-C 流变学行为的影响见图4。
图4 超声处理对κ-C 流变性的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic treatment on the rheological properties of κ-carrageenan
（a）1%浓度超声0～240 min 的样品的表观黏度测定结果；（b）对0.5%和1%浓度κ-C 进行超声240 min 处理前后的振荡频率扫描结果；（c）1%浓度不同超声处理时间样品的表观黏度在升温和降温过程中的变化情况。
由图4（a）可以发现所有样品均表现出剪切稀化现象，属于假塑性流体（非牛顿流体），这是因为随着剪切速率增加，凝胶的内部结构逐渐被破坏，导致黏度降低[21]。样品浓度相同时，超声时间越长，体系的黏度越低，超声240 min 后，黏度随剪切速率的变化较小，趋于牛顿流体的特性[22]。出现黏度下降的主要原因是因为超声增强了聚合物的自由流动性并促进了高分子链的部分解聚和简单断裂，分子量和聚合度降低，分子网络结构被破坏，导致表观黏度的急剧下降和溶解度的增加。这与Cheng 等[23]的研究结果一致。由图4（b）可知样品的储能模量（G′）和损耗模量（G″）均随着频率升高而逐渐增大，并且能够发现1%浓度κ-C 样品的黏弹性比0.5%浓度κ-C 样品更强。超声处理后这两种浓度样品的黏弹性均下降，1%浓度κ-C 由真凝胶变为弱凝胶。图4（c）表示不同超声时间处理后，κ-C 表观黏度随温度的变化，首先是升温，从25 ℃升高到85 ℃，黏度随着温度的升高而降低，然后从85 ℃降低到25 ℃，黏度会逐渐恢复，且升温降温过程均在40 ℃～60 ℃黏度发生急剧变化，这是由于40 ℃～50 ℃之间发生了升温过程凝胶的融化和降温过程凝胶的生成。在加热升温的过程中，首先发生的是κ-C 的分子运动加快，其网状有序缠结的紧密结构开始松散，逐渐变为双螺旋的状态。当温度进一步升高，其分子结构又会继续舒展，分子间连接进一步变弱，逐渐变为单螺旋的状态。最后，随着加热的进行，κ-C 的单螺旋状态会进一步分散，逐渐呈现出在溶液中无规则卷曲分散的状态，因此流动性变强，凝胶结构变弱，在升温过程中黏度不断下降。而κ-C 凝胶具有热可逆的性质，当温度由高温开始逐渐降低时，κ-C 分子会反过来由无规则卷曲分散的状态重新恢复到紧密有序的凝胶网络结构，从而其黏度恢复。
2.5 质构特性分析
超声前后的κ-C 凝胶质地的TPA 检测结果见表1。
表1 超声时间对卡拉胶凝胶性能的影响
Table 1 Effect of ultrasonic time on the gel properties of κ-carrageenan
注：同列不同字母表示具有显著性差异（p＜0.05）。
超声时间/min硬度/g黏附性/g弹性/g黏聚性/g胶着性/g恢复性/g 0 1 063.90±63.42a2.50±0.25a0.970±0.004ab0.620±0.010a663.91±44.65a0.450±0.006a 15697.06±35.37b1.99±0.33a0.950±0.005ab0.540±0.011b378.67±25.02b0.360±0.010b 30462.22±13.82c3.01±0.11a0.950±0.001b0.500±0.019c230.19±17.92c0.300±0.013c 60279.11±20.35d2.33±0.26a0.900±0.003c0.450±0.013d125.76±8.46d0.270±0.006d
由于超声240 min 处理得到的样品在2%浓度下不能形成稳固凝胶，故不对该样品进行TPA 分析。硬度与物体变形或穿透的力有关。弹性与物体快速恢复变性和恢复程度有关。黏聚性指标反映了物体内部结合力的大小，胶着性反映物体内部的黏性，恢复性是物体变形后恢复程度的性质。由表1可知，超声对κ-C 凝胶的胶着性、硬度、恢复性、黏聚性均有显著影响。随着超声时间的延长，κ-C 的胶着性、硬度、黏聚性、恢复性逐渐降低。这可能是由于超声的机械和空化效应[22-26]，致使超声处理加剧了κ-C 中部分键断裂，从而导致κ-C 聚合物分子之间的相互作用减弱，在宏观上的表现便是κ-C 的硬度、黏聚性、胶着性、恢复性逐渐下降，但这种结构的改变对于弹性的影响小于上述4 个指标。黏附性是被测物体黏附在探头上的力。从表1中可以看出，随着超声处理κ-C 时间的延长，κ-C的黏附性并没有显著变化。
2.6 热稳定性分析
通过测定超声前后样品的热失重分解温度可以对样品热稳定性进行评价。超声处理对κ-C 热重（thermal gravimetry，TG）和差热重（differential thermal gravimetry，DTG）曲线的影响如图5所示。
图5 超声处理对κ-C 样品TG 和DTG 曲线的影响
Fig.5 Effects of ultrasonic treatment on the thermal gravimetry and differential thermal gravimetry of κ-carrageenan
（a）TG 曲线；（b）DTG 曲线。
从κ-C、κ-CUT 的TG 曲线中可以看出，上述样品的失重过程均分为两个阶段。第一个阶段范围为40 ℃～237 ℃之间，这一阶段的产生和很多其他大分子多糖一致，主要是由于随着温度升高，样品中的结合水、游离水挥发因此造成了样品的快速失重。在此阶段κ-CUT 样品的质量损失略低于κ-C 样品；第二阶段为237 ℃～600 ℃，是由于样品分子随温度的升高不断被降解造成，在第二个阶段，κ-C 的失重高于κ-CUT 样品，因此整体而言，经过超声后，样品的持水性有所增加。通过观察DTG 曲线可以发现，κ-C 样品在237 ℃～287 ℃温度范围内出现第一次快速失重，并且在267 ℃时产生最大热分解速率，此阶段质量损失率达18.54%；紧接着在287 ℃～457 ℃范围内出现新的快速失重峰，并且在308 ℃时产生最大热分解速率，第二阶段质量损失率达25.3%。457 ℃以后样品以缓慢速度继续分解。κ-CUT 同样出现了两个失重峰，但是其两次快速失重对应的最大热分解速率温度分别为257 ℃和307 ℃，最大热分解速率温度均有所提前，这可能是由于超声处理后样品热稳定性降低，热降解速率提高。
2.7 样品微观结构观察
电镜扫描结果见图6。
图6 样品微观结构电镜扫描图
Fig.6 Scanning electron microscopy images of sample microstructure
（a）κ-C，100×；（b）60 min 超声κ-CUT，100×；（c）240 min 超声κ-CUT，100×；（d）κ-C，800×；（e）60 min 超声κ-CUT，800×；（f）240 min 超声κ-CUT，800×。
由图6可知，κ-C 分子链间连接紧密，在三维空间中会相互连接和相互耦合，由此可以纽结形成紧密的网络结构，结构越紧密则在宏观上表现为样品表面存在褶皱，不舒展，在功能特性上表现为凝胶强度和黏弹性的增强。但是通过对样品进行超声处理，随着处理时间的延长，可以看到样品表面褶皱逐渐伸展，表面变得光滑和松散，其显微结构呈片状，从而凝胶的强度和黏弹性变弱，这与流变学分析和凝胶质构性的检测结果一致。同时κ-C 凝胶样品的持水性和溶解性与微观结构有关，更紧密的凝胶结构会导致更高的持水性和较低的溶解性[27]。由于超声作用破坏了样品的微观结构，使其变得更加松散和多孔。这也表明胶体的保水性下降[28]，溶解性会有所升高。
3 结论
为研究超声处理对κ-C 分子量、还原糖含量、溶解性、热稳定性、流变性和凝胶质构性等功能性质的影响。从超声对κ-C 结构的影响来看，κ-C 还原糖含量的大小与超声作用时间总体上呈正相关趋势。κ-C的分子量大小与超声处理时间呈负相关趋势。研究表明，在超声处理的短时间内，κ-C 分子解聚过程占主导地位。但此后，随着超声处理时间的延长，κ-C 中部分分子链被打断，聚合物的降解起了主要作用。从电镜扫描结果看超声会改变样品表观形态。随着超声时间的延长，κ-C 表面褶皱逐渐伸展，表面变得光滑，其显微结构呈片状。从超声对κ-C 功能性质的影响来看，超声处理可以通过使κ-C 发生解聚和部分降解后改善κ-C的溶解性。超声60 min 后样品常温水溶性指数可达98.91%。此外通过超声作用可以对κ-C 的质构特性进行调节，调节其硬度、黏弹性等，使其在工业生产中的应用更加灵活。综上，本文总结了超声对κ-C 结构和功能性质的影响机制，发现超声是改善κ-C 溶解性的有效方法，从而可以为其他多糖溶解性的改善提供参考。
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