癌症是全球性的健康问题，严重威胁人类身体健康，其中肝癌是2020年全球第六大最常诊断的癌症和第三大癌症死亡原因，约有906 000 例新病例和830 000 例死亡病例[1]。许多治疗癌症的方法是促使肿瘤细胞内产生过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），从而诱导肿瘤细胞凋亡。放疗和化疗是常用的抗癌疗法，其诱导产生的O2-·、H2O2 及·OH 等ROS 会引起氧化应激反应，从而导致癌症细胞死亡[2]，但是，癌症放疗和化疗诱导的ROS 不仅能杀死肿瘤细胞，同时也会使正常组织产生损伤[3]，破坏细胞内的脂质、蛋白质和DNA 等成分，引起短期和长期的疲劳、疼痛、恶心、脱发，甚至死亡等副作用[4-5]。
细胞内存在着由非酶促体系和酶促体系两大抗氧化系统，抵御ROS 对细胞的损害。非酶促抗氧化体系包括谷胱甘肽、硫氧还原蛋白、维生素C 和维生素E等，酶促抗氧化体系包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。两大抗氧化体系相互协作，共同拮抗ROS 的氧化作用，保护细胞及其内部成分不受损害[6]。除了人体中存在的抗氧化系统，还可以通过人为补充外源抗氧化剂提高机体对ROS 的抵抗作用，从而消除放疗和化疗对机体产生的损伤。
近年来，天然抗氧化剂由于其较好的治疗价值和较少的生物副作用受到关注[4，7]。但是进入人体的外源抗氧化剂不仅会保护正常细胞免受ROS 损伤，也能保护癌细胞免受ROS 损伤，从而降低放疗和化疗对癌细胞的治疗效果。虽然国内外研究已经大量报道了抗氧化剂在癌症放疗和化疗过程中的运用[8]，但尚未深入对比研究其对癌细胞ROS 损伤的影响。
类胡萝卜素是一种异戊二烯类脂质[9]，主要存在于各种植物、微生物中[10]。类胡萝卜素的营养价值为人们所熟知[11]，可以保护视力、预防癌症和心血管疾病，同时也是一种很好的抗氧化剂[12-14]。其中，法夫酵母可以产生多种类胡萝卜素[15]，包括虾青素、β-类胡萝卜素和海胆酮等，具有显著的抗氧化效果[16-18]。有研究表明虾青素的抗氧化活性分别是β-胡萝卜素和维生素E的10 倍和100 倍[19]。基于以上研究背景，本研究以人类肝癌细胞系HepG2 细胞为对象，对比研究虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和法夫酵母类胡萝卜素提取物对癌症细胞ROS 损伤的保护作用，为利用类胡萝卜素研发高效的肝癌放疗和化疗ROS 氧化损伤保护剂提供基础，同时为研发其他癌症放疗和化疗的外源抗氧化剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
人类肝癌细胞系HepG2 细胞：中国科学院细胞库（上海）；法夫酵母菌体：厦门汇盛生物有限公司；虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮、甲基噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）：美国Sigma 公司；法夫酵母类胡萝卜素提取物：集美大学海洋食品与生物工程学院发酵实验室制备；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：以色列Biological Industries 公司；100×抗生素溶液（10 mg/mL 硫酸链霉素和10 000 IU/mL 氨苄青霉素）：Sigma-Aldrich 中国上海公司；达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：美国HyClone 公司；胰蛋白酶消化液（含0.25%胰蛋白酶）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量检测试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司。
1.1.2 主要仪器与设备
JY92-ΠN 型超声波细胞破碎机：宁波新艺超声设备有限公司；Avanti JXN-30 型高速冷冻离心机：德国贝克曼公司；HERACELL Vois 160i 型CO2 培养箱：德国赛默飞世尔科技公司；TS-100 型倒置显微镜：日本尼康公司；8 W（320 nm～420 nm）紫外线A（ultraviolet A，UVA）灯管：飞利浦（中国）投资有限公司；ST513 型紫外线辐照计：先驰光电股份有限公司；BioTek Cytation-5 型酶标仪：美国伯腾仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 HepG2 细胞的培养
将液氮罐保藏的HepG2 细胞冻存管放入37 ℃温水振荡解冻，将该细胞接种于含10% FBS 和1%双抗的DMEM 中，并置于CO2 培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养。待HepG2 细胞达到85%左右融合时进行细胞传代，倒掉培养基，用PBS 清洗数次以除去细胞代谢产物与残余培养基，加入0.25%胰蛋白酶消化液，待细胞空隙变大、皱缩变圆，除去消化液，加入DMEM 终止消化并制备细胞重悬液，按1∶4 的比例进行传代，该试验采用5 代～30 代细胞。
1.2.2 HepG2 细胞ROS 损伤
参考陈晓晨等[20]的方法进行HepG2 细胞辐照试验，设置正常细胞组（无样品孵育也不对细胞进行UVA 辐照）、阴性对照组（无样品孵育但对细胞进行UVA 辐照）和试验组（有样品孵育且对细胞进行UVA辐照），将细胞密度为1.5×105 个/mL 的HepG2 细胞接种到6 孔板中，待细胞达85%左右融合时进行UVA辐照试验，UVA 辐照剂量分别设置为0、8.10、12.15、16.20、20.25、24.30 J/cm2。辐照完成后培养24 h，采用倒置显微镜在10×目镜、20×物镜下观察细胞形态。
1.2.3 类胡萝卜素对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞存活率的影响
先将待试验的HepG2 细胞加入少量PBS 代替培养基，待细胞达85%左右融合时进行试验，加入浓度分别为1 μg/mL 的虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和法夫酵母类胡萝卜素提取物孵育2 h，以不加样品孵育作为正常细胞组，每组6 个平行，吸弃样品液和PBS，加入DMEM 培养24 h 后进行MTT 细胞毒性试验。
向HepG2 细胞中加入1 μg/mL 的虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和法夫酵母类胡萝卜素提取物孵育2 h，用1.2.2 筛选得到的细胞半致死率的辐照剂量进行细胞UVA 辐照试验，其中，正常细胞组、阴性对照组和试验组同1.2.2，每组6 个平行。辐照结束后用新的DMEM替换原来的PBS，继续培养24 h。用MTT 法测定细胞存活率。
1.2.4 类胡萝卜素对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞GSH 含量的影响
将类胡萝卜素作为试验样品，参照1.2.3 的方法孵育和辐照细胞，每组3 个平行。辐照结束继续培养24 h后，根据GSH 含量检测试剂盒说明书的步骤，将细胞超声破碎5 min（功率200 W）后，8 000 r/min 转速下离心10 min 获取细胞提取液，将细胞提取液作为检测样品，进行显色反应后于412 nm 波长下测定吸光度。
1.2.5 类胡萝卜素对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞TAOC 的影响
将类胡萝卜素作为试验样品，参照1.2.3 的方法孵育和辐照细胞，每组3 个平行。辐照结束继续培养24 h后，按照T-AOC 检测试剂盒说明书的步骤，将细胞超声破碎3 min（功率200 W），然后以10 000 r/min 的转速离心10 min，得到的上清液作为样品，进行显色反应后在波长593 nm 处测吸光度。
1.3 数据统计分析
采用SPSS 26.0 进行数据统计分析，对数据进行差异显著性分析（p＜0.05 表示差异显著），并采用Microsoft Excel 2016 进行绘图，用平均值±标准差表示试验数值。
2 结果与分析
2.1 UVA 辐照剂量对HepG2 细胞损伤的影响
UVA 辐照剂量对HepG2 细胞形态的影响见图1。
图1 UVA 辐照剂量对HepG2 细胞形态的影响（200×）
Fig.1 Effect of UVA irradiation dose on the morphology of HepG2 cells（200×）
A.无UVA 辐照；B.UVA 辐照剂量为8.10 J/cm2；C.UVA 辐照剂量为16.20 J/cm2；D.UVA 辐照剂量为24.30 J/cm2。
由图1可见，经0、8.10、16.20 J/cm2 和24.30 J/cm2剂量的UVA 辐照后的HepG2 细胞形态中，正常HepG2 细胞（无UVA 辐照）分布密集，堆积生长，呈现多边形，经UVA 辐照后细胞形态发生了变化，细胞膜遭到破坏，细胞贴壁减少，随着辐照剂量的增加，细胞数量逐渐减少。
UVA 辐照剂量对HepG2 细胞存活率的影响见图2。
图2 UVA 辐照剂量对HepG2 细胞存活率的影响
Fig.2 Effect of UVA irradiation dose on survival rate of HepG2 cells
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
从图2可以看出，UVA 辐照剂量对HepG2 细胞增殖具有明显的抑制作用，经UVA 辐照后HepG2 细胞存活率均低于无UVA 辐照的正常细胞组（p＜0.05），且细胞存活率随着UVA 辐照剂量的增加而降低。UVA辐照剂量在8.10 J/cm2 时，HepG2 细胞存活率为66.8%，当UVA 辐照剂量达到16.20 J/cm2 时，HepG2 细胞存活率为48.2%，接近于细胞半致死率。有研究表明，外源性来源如紫外线可以显著增加ROS 水平[21]。ROS 过量产生不仅会损害线粒体DNA 的完整性，还会通过诱导脂质过氧化破坏线粒体结构，从而进一步增加氧化应激反应并加重线粒体损伤，可刺激凋亡细胞死亡途径[22]。相关研究常选择细胞半致死辐照剂量作为试验剂量，开展紫外线照射HepG2 细胞的研究[23]，本研究发现当辐照剂量为16.20 J/cm2 时，细胞存活率为50%左右，所以将16.20 J/cm2 作为后续试验的辐照剂量。
2.2 类胡萝卜素对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞存活率的影响结果
类胡萝卜素种类对正常HepG2 细胞存活率的影响见图3。
图3 类胡萝卜素种类对正常HepG2 细胞存活率的影响
Fig.3 Effect of carotenoid compounds on survival rate of normal HepG2 cells
相同小写字母表示差异不显著，p＞0.05。
从图3可以看出，添加1 μg/mL 浓度的虾青素、β-胡萝卜素、海胆酮和法夫酵母类胡萝卜素提取物对HepG2细胞的增殖没有显著的促进或抑制作用（p＞0.05）。
类胡萝卜素种类对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞存活率的影响见图4。
图4 类胡萝卜素种类对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞存活率的影响
Fig.4 Effects of carotenoid compounds on the survival rate of HepG2 cells injured by irradiation ROS
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
从图4可以看出，正常细胞组的细胞存活率为100%，经辐照ROS 损伤的HepG2 细胞（阴性对照组）存活率为49.23%；添加虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮后辐照ROS 损伤的HepG2 细胞存活率分别为68.48%、64.11%和61.12%，均显著高于阴性对照组（p＜0.05），这说明虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮对ROS 损伤的HepG2 细胞具有抗氧化保护作用。添加法夫酵母类胡萝卜素提取物后，ROS 损伤的HepG2 细胞存活率为50.73%，与阴性对照组没有显著差异（p＞0.05），说明法夫酵母类胡萝卜素提取物对ROS 损伤的HepG2细胞没有明显保护作用。Li 等[24]研究表明，番茄中提取的类胡萝卜素可以降低H2O2 介导HepG2 的细胞死亡。Martin 等[25]研究表明β-胡萝卜素和叶黄素能够保护HepG2 人类肝细胞免受氧化剂诱导的损害。大量研究表明，类胡萝卜素具有氧化损伤保护作用，本研究中虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮对ROS 损伤的HepG2 细胞具有抗氧化保护作用，与相关研究结论相似[24-25]。
2.3 类胡萝卜素对辐照ROS 损伤HepG2 细胞中GSH含量的影响结果
类胡萝卜素对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞中GSH 含量的影响见图5。
图5 类胡萝卜素种类对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞中GSH 含量的影响
Fig.5 Effects of carotenoid compounds on GSH content of HepG2 cells injured by irradiation ROS
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
从图5可以看出，阴性对照组的GSH 含量为337.22 μg/mL，显著低于正常细胞组（p＜0.05）。添加虾青素和海胆酮后，辐照ROS 损伤的HepG2 细胞的GSH 含量分别达到463.62 μg/mL 和400.42 μg/mL，显著高于阴性对照组（p＜0.05），这表明虾青素和海胆酮对于辐照ROS 损伤的HepG2 细胞具有保护效果。添加β-胡萝卜素和法夫酵母类胡萝卜素提取物后，GSH含量与阴性对照相比没有显著变化，说明β-胡萝卜素和法夫酵母类胡萝卜素提取物对于辐照ROS 损伤的HepG2 细胞没有明显保护效果。GSH 是哺乳动物细胞中重要的非酶抗氧化剂之一，其清除作用大部分来自于谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶的相互作用。GSH 含有巯基（-SH），可保护染色质纤维之间的二硫键免受ROS 引起的氧化损伤[26]。本研究发现，与阴性对照组相比，添加虾青素和海胆酮可以显著提高辐照ROS 损伤HepG2 细胞中GSH 含量，与Chen 等[27]研究表明口服富含水溶性类胡萝卜素蛹虫草提取物能升高GSH 水平的结果相似。同时，本研究发现法夫酵母类胡萝卜素提取物没有明显提高辐照ROS 损伤的HepG2 细胞的GSH 含量，这进一步说明法夫酵母类胡萝卜素提取物可能是比单种类胡萝卜素更有效的放疗和化疗辅助治疗。
2.4 类胡萝卜素对辐照ROS 损伤HepG2 细胞T-AOC的影响结果
类胡萝卜素种类对辐照ROS 损伤HepG2 细胞的T-AOC 的影响见图6。
图6 类胡萝卜素种类对辐照ROS 损伤的HepG2 细胞T-AOC 的影响
Fig.6 Effects of carotenoid compounds on T-AOC of HepG2 cells injured by irradiation ROS
不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
从图6可以看出，与正常细胞组比较，阴性对照组的T-AOC 显著降低（p＜0.05），为0.129 μmol/mL。添加虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮后，T-AOC 分别达到0.156、0.159、0.154 μmol/mL，均显著高于阴性对照组（p＜0.05），说明这几种类胡萝卜素对ROS 损伤的HepG2 细胞的T-AOC 具有提升作用。添加法夫酵母类胡萝卜素提取物之后，其T-AOC 与阴性对照组相比没有显著变化，说明法夫酵母类胡萝卜素提取物对ROS 损伤的HepG2 细胞的T-AOC 没有促进作用。TAOC 已被证明是评估总抗氧化能力的一种有效指标，且在对抗ROS 方面具有协同作用[28]。Shen 等[29]研究发现叶片T-AOC 与总类胡萝卜素含量呈正相关，研究表明类胡萝卜素的积累有助于植物增强抗氧化能力，减少氧化损伤。Zhu 等[30]研究表明低浓度和中浓度的虾青素可以提高珊瑚鳟鱼肝脏的T-AOC。封海生等[31]研究表明虾青素和β-胡萝卜素可以显著提升蛋鸡血清和蛋黄的T-AOC；其中，虾青素组蛋鸡血清和蛋黄中的T-AOC 分别为对照组的223%和176%[31]。本研究中的虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮也可以提高辐照ROS 损伤的HepG2 细胞的T-AOC，与上述相关研究结果相一致。另外，本研究发现法夫酵母类胡萝卜素提取物没有显著提高辐照ROS 损伤的HepG2 细胞的T-AOC，这同样也说明法夫酵母类胡萝卜素提取物可能是更有效的放疗和化疗辅助治疗保护剂。
3 结论
虾青素、β-胡萝卜素和海胆酮均能提高UVA 辐照ROS 损伤的HepG2 细胞的存活率、GSH 含量和TAOC，其中虾青素对HepG2 细胞的氧化保护作用最强，而法夫酵母类胡萝卜素提取物对HepG2 细胞氧化损伤没有明显保护作用。该结果显示法夫酵母类胡萝卜素提取物在癌症放疗和化疗辅助治疗过程中，可能对正常细胞ROS 氧化损伤具有保护作用，而对癌细胞ROS 氧化损伤不具有保护作用，因此可能是更有效的放疗和化疗辅助治疗保护剂，本文为研究抗氧化剂对癌症放疗和化疗的辅助保护作用提供了一定的参考。
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