半纤维素在自然界中含量仅次于纤维素，位居第二[1]。木聚糖是植物细胞壁和某些藻类中半纤维素最重要的成分之一[2]。木聚糖酶属于糖苷水解酶（glycosidehydrolase，GH），是能够降解木聚糖为低聚木糖和木糖的复合酶系中最关键的酶之一[3-4]。木聚糖酶在纸浆造纸、食品加工及能源开发等行业应用广泛，是现阶段生物研究的热点领域之一[5]。酸性木聚糖酶的最适pH 值低、酸稳定性好，是一种特殊的木聚糖酶。其在一些酸性环境下应用的行业，如酿酒、饲料、果汁加工等，具有突出的应用价值[6-7]。
因木聚糖酶需要满足工业生产中所需的苛刻条件，这就要求酶具有良好的热稳定性、较宽范围的pH适应性和较高的比活力[8-9]。然而，通过筛选天然产木聚糖酶微生物来获得能够满足工业生产要求的木聚糖酶资源量有限[10-13]。目前，不同来源的木聚糖酶已成功在大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、毕赤酵母（Pichia）等宿主中进行了异源表达，不同程度地提高了木聚糖酶的表达量。同时，与游离酶相比，固定化酶稳定性好，利用率高，在实际应用中能降低生产成本，增加生产能效[14-15]。目前，对于木聚糖酶的固定化有壳聚糖法[16]、海藻酸钠法[17]、壳聚糖-海藻酸钠微胶囊法[18]和交联酶聚集体法[19]等手段。固定化的重组木聚糖酶可作为降解大量天然半纤维素的生态友好型工具而被关注。
现阶段，关于木聚糖酶的研究多集中于其耐热及耐碱性方面，而对具有极大应用潜力的酸性木聚糖酶的研究相对较少[20-21]。本试验将酸性木聚糖酶XynA 基因克隆后于大肠杆菌BL21（DE3）中成功进行异源表达，并对其进行酶学性质研究，通过单因素试验探究其固定化条件再进行响应面优化试验，以期得到酶的最佳固定化条件，能为工业化生产酸性木聚糖酶提供一定的理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
表达质粒pET-28a（+）：武汉淼灵生物科技有限公司；限制性内切酶（Nco I 和Not I）、T4 DNA 连接酶：NEB（北京）有限公司；山毛榉木聚糖：爱尔兰Megazyme 公司；质粒提取试剂盒：天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒：美国Omega 公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒：碧云天生物技术有限公司。壳聚糖、海藻酸钠、大孔树脂（X-5、AB-8、D-101）、柠檬酸、柠檬酸钠、纳米Fe3O4、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STPP）、戊二醛、新戊二醇二缩水甘油醚（均为国产分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
LB（Luria-Bertani）培养基（g/L）：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 5 g，蒸馏水定容至1 L。
1.2 仪器与设备
梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）（S1000）扩增仪：美国Bio-Rad 公司；恒温摇床（HNY-200B）：上海智诚实验设备有限公司；高速冷冻离心机（5424R 型）：德国Eppendorf 公司；超声波细胞粉碎机（Scientz-IID）：宁波新芝生物科技有限公司；紫外可见分光光度计（UV-2102型）：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 目的基因的克隆和重组质粒的构建
利用National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库获得木聚糖酶（ID：FJ860893.1）的基因序列，设计特异性引物（表1），获得目的基因；进行异源表达。目的基因由公司合成并整合在PUC57 质粒载体，转染到大肠杆菌DH5α。基于载体上携带的抗性基因，在LB 培养基中培养并测序验证，测序正确的基因在Nco I 和Not I 酶切位点与pET28a（+）连接，然后转移到大肠杆菌BL21（DE3）中，重组菌株编号为XynA。
表1 木聚糖酶XynA 基因扩增引物
Table 1 Xylanase XynA gene amplification primers
?
1.3.2 重组木聚糖酶的诱导表达
将含有重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）转移到LB 培养基中，在150 r/min、37 ℃条件下培养，然后用500 mmol/L 异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（ispropyl-β-D-thinogalactoside，IPTG）溶液诱导表达。将诱导表达后的细胞溶液在4 ℃，5 000 r/min 状态下离心5 min，菌体加入10 mL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.0）。粗酶液超声处理15 min，再离心得到上清液。取上清液采用SDS-PAGE 电泳测定蛋白质的分子质量。
1.3.3 木聚糖酶活性测定
根据GB/T 23874—2009《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》，木聚糖酶的1 个酶活力单位被定义为1 min 水解木聚糖底物形成1 μmol 还原糖（以木糖计）所需的酶量。通过将0.9 mL 的1 mg/mL 山毛榉木聚糖与0.1 mL 适当稀释的木聚糖酶（50 mmol/L乙酸缓冲液，pH5.5）在55 ℃、反应5 min 下测定[22]，并用3，5-二硝基水杨酸法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）计算释放的还原糖量[23]。
相对酶活力即各条件的酶活力与酶最适条件下的酶活力的百分比；残余酶活力即各条件下保温后的酶活力与未处理的酶活力的百分比。
1.3.4 酶学性质研究
1.3.4.1 最适pH 值和pH 稳定性
酶液用不同pH 值的缓冲液稀释（50 mmol/L 甘氨酸-盐酸缓冲液pH2.0、2.5、3.0、3.5，50 mmol/L 柠檬酸-盐酸缓冲液pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），以1%山毛榉木聚糖为底物用DNS 法测定不同pH 值下木聚糖酶的酶活，每组3 个平行确定其最佳pH 值（以最适pH 条件下的酶活力定义为100%）。酶液用不同pH 值的缓冲液稀释，在37 ℃条件下保温1 h，并在最佳pH 值下测量残留的酶活性，每组3 个平行以研究酶的pH 稳定性（以未处理的酶活力为100%）。
1.3.4.2 最适温度和温度稳定性
以1%山毛榉木聚糖作为底物使酶液在不同温度（40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃）下反应，用DNS法测定不同温度下木聚糖酶的酶活，每组3 个平行确定其最佳温度（以最适温度条件下的酶活力定义为100%）。酶液在不同温度下保温1 h 后，以1%榉木木聚糖作为底物并在最适温度下测量残留的酶活性，每组3 个平行以研究酶的温度稳定性（以未经处理的酶活力为100%）。
1.3.5 不同材料固定木聚糖酶
1.3.5.1 壳聚糖的固定化
将2 g 壳聚糖溶解于100 mL 的2%醋酸溶液中，搅拌均匀，再用注射器将其滴到4 mol/L 的NaOH 溶液中，形成微球，然后用蒸馏水洗至中性。将制好的壳聚糖微球加入到一定的1.5%戊二醛中，交联3 h，再用蒸馏水反复洗去戊二醛。称取0.5 g 的壳聚糖微球，加入10 mL 的酶液，4 ℃振荡固定16 h 后，用蒸馏水洗去多余酶液即得固定化酶[24]。
1.3.5.2 磁性壳聚糖微球的固定化
取0.2 g Fe3O4 溶于50 mL STPP 溶液中进行超声溶解，再用注射器将其滴加入2%的壳聚糖溶液，形成磁性微球。先后用强磁铁块、去离子水重复进行收集、洗涤、收集3 次。取一定量的磁性微球水重悬液加入到一定的1.5%戊二醛，避光置于25 ℃，120 r/min 条件下进行交联。交联结束后，用去离子水洗涤3 次，加入5 mL pH6.0 的0.1 mol/L 的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液，并加入一定量酶液，25 ℃120 r/min 条件下进行酶固定化[25]。
1.3.5.3 海藻酸钠的固定化
将4 g/L 海藻酸钠缓慢加入温水中并迅速搅拌，溶化均匀后按体积比1∶1 与粗酶液混合后静置片刻。用注射器缓慢滴入一定浓度的氯化钙溶液中固定40 min后，缓慢搅拌并过滤。得到的球状固定化酶用去离子水洗涤，加入戊二醛溶液在26 ℃下进行交联，交联后用去离子水洗涤，即得到固定化酶[26]。
1.3.5.4 大孔树脂的固定化
将常用的3 种大孔树脂X-5、AB-8、D-101 分别用无水乙醇浸12 h，再用蒸馏水冲洗至无醇。取适量处理后的大孔树脂，用滤纸擦干表面水分，分别称取1.0 g 放入PE 管中，加入10 mL 酶液，200 r/min 振荡吸附4 h，过滤即得固定化酶，晾干12 h，40 ℃烘干4 h。向吸附完成的体系中加入一定的1.5%戊二醛，40 ℃120 r/min，振荡4 h，完成交联[27]。
1.3.6 壳聚糖固定木聚糖酶的优化
1.3.6.1 壳聚糖浓度对固定化酶的影响
按照1.5%戊二醛交联剂，在30 ℃下恒温水浴摇床摇动交联3.0 h，考察壳聚糖浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%对固定化木聚糖酶的影响。
1.3.6.2 交联剂对固定化酶的影响
按照2.0%壳聚糖浓度，30 ℃下恒温水浴摇床摇动交联3.0 h，分别选用1.5%和3.0%浓度的戊二醛、新戊二醇二缩水甘油醚作为交联剂，4 ℃振荡固定16 h，考察不同交联剂对固定化木聚糖酶的影响。
1.3.6.3 交联剂浓度对固定化酶的影响
按照2.0%壳聚糖浓度，30 ℃下恒温水浴摇床摇动交联3.0 h，4 ℃振荡固定16 h，考察新戊二醇二缩水甘油醚交联剂浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%对固定化木聚糖酶的影响。
1.3.6.4 交联时间对固定化酶的影响
按照2.0%壳聚糖浓度，1.5%新戊二醇二缩水甘油醚交联剂，在30 ℃下恒温水浴摇床摇动交联，考察交联时间分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h 对固定化木聚糖酶的影响。
1.3.6.5 固定化时间对固定化酶的影响
按照2.0%壳聚糖浓度，1.5%新戊二醇二缩水甘油醚交联剂，在30 ℃下恒温水浴摇床摇动交联3.0 h，4 ℃振荡固定，考察固定化时间分别为10、12、14、16、18 h对固定化木聚糖酶的影响。
1.3.7 响应面优化固定条件
在单因素试验的基础上利用Design-Expert 8.0.6 软件设计Box-Behnken 试验，选取对固定化酶影响显著的3 个因素为自变量，以酶活回收率为响应值（Y）进行响应面试验，确定最优的固定化条件并进行试验验证。
1.3.8 酶活回收率计算方法
以酶活回收率来表示固定木聚糖酶的优劣，计算公式如下。
式中：Y 为固定化酶活回收率，%；A 为固定化酶活力；B 为投入的游离酶活力。
1.4 数据处理
使用GraphPad Prism 8.2.1 软件对数据进行处理和作图，Design-Expert 8.0.6 软件对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 重组质粒的构建
以木聚糖酶目的基因为模板，利用设计好的引物，进行PCR 试验。将PCR 的扩增产物用1%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳法进行检测，检测结果如图1所示。
图1 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 Results of DNA agarose gel electrophoresis
M.5 000 bp DNA Maker；1.目的基因。
由图1可知，通过PCR 扩增获得657 bp 的条带，与木聚糖酶目的基因长度一致。
2.2 重组木聚糖酶的表达
将细胞置于超声波中进行破壁处理，然后离心取上清液进行SDS-PAGE 检测，结果如图2所示。
图2 木聚糖酶的SDS-PAGE 分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of xylanase
M.蛋白质Maker；1.空白对照；2.粗酶。
由图2可知，目标蛋白有清晰的条带，表达量较高，且与理论分子量一致。
2.3 XynA 的酶学性质
2.3.1 最适pH 值和pH 稳定性
不同pH 值对重组木聚糖酶XynA 的影响，结果如图3所示。
图3 pH 值对重组木聚糖酶XynA 的影响
Fig.3 The effect of pH on the recombinant xylanase XynA
a.最适pH 值；b.pH 稳定性。
如图3a 所示，当pH 值低于5.0 时，木聚糖酶的酶活性与pH 值呈正相关；木聚糖酶的酶活性在pH5.5～7.0 的条件下均低于pH5.0。因此pH5.0 是山毛榉木聚糖为底物时木聚糖酶的最佳pH 值。
酸性木聚糖酶大多数能在pH5.0～7.0 微酸条件下表现出高活性[28]，如图3b 所示，木聚糖酶在pH4.5～5.5处理1 h，能保持很好的pH 稳定性，其残余酶活力在62.37%以上，因此该木聚糖酶具有良好的耐酸性。其后随着pH 值的升高，其残余酶活力逐渐降低，在pH7.0 时，酶活性基本丧失。
2.3.2 最适温度和温度稳定性
不同温度对重组木聚糖酶XynA 的影响，结果如图4所示。
图4 温度对重组木聚糖酶XynA 的影响
Fig.4 The effect of temperature on the recombinant xylanase XynA
a.最适温度；b.温度稳定性。
如图4a 所示，木聚糖酶的相对酶活力在55 ℃以下时，与温度呈现正相关的关系；当反应温度高于55 ℃时，木聚糖酶的相对酶活力随着温度的升高而降低；其相对酶活力在90 ℃时降至最低（24.98%）。因此55 ℃是山毛榉木聚糖为底物时木聚糖酶的最佳温度。
如图4b 所示，木聚糖酶在温度低于40 ℃条件下处理1 h，保持较高的温度稳定性，其残余酶活力为72.91%左右，其后随着温度的升高，其温度稳定性明显降低，超过60 ℃时，酶活性基本丧失。
2.4 不同材料固定化木聚糖酶
选用不同固定化材料对重组木聚糖酶XynA 进行固定化研究，结果表2所示。
表2 不同材料的酶活回收率
Table 2 Enzyme activity recovery rate of different materials
固定材料酶活回收率/%壳聚糖32.24海藻酸钠19.59磁性壳聚糖14.73 X-5 大孔树脂7.69 AB-8 大孔树脂4.48 D-101 大孔树脂5.16
由表2可知，不同的材料的固定化效果不同，壳聚糖的酶活回收率比其它材料都好，达到32.24%；其中大孔树脂的固定化效果最差。
2.5 壳聚糖固定木聚糖酶的优化
2.5.1 壳聚糖浓度对固定化酶的影响
不同浓度的壳聚糖对固定化酶的影响，结果如图5所示。
图5 壳聚糖浓度对固定化酶的影响
Fig.5 The effect of chitosan concentration on the immobilization of enzyme
由图5可知，随着当壳聚糖浓度的增加，固定化酶活回收率先增加，当壳聚糖浓度为2.0%时固定化效率最好；当浓度再增加，固定化效率反而下降。固定化条件决定了酶的稳定性，因为它取决于酶与载体基质之间的相互作用[29-30]。可能是壳聚糖浓度低时，形成的壳聚糖微球不易成形，容易分散，导致其固定化效果差；当浓度过高时，壳聚糖微球很厚很结实，可能导致孔隙过于紧密，对酶产生了屏蔽，固定化效果也不理想[31]。
2.5.2 交联剂对固定化酶的影响
不同交联剂对固定化酶的影响，结果如图6所示。
图6 两种交联剂对固定化酶的影响
Fig.6 The effect of two cross-linking agents on immobilized enzyme
由图6可知，选择戊二醛和新戊二醇二缩水甘油醚为交联剂时，在1.5%和3.0%的浓度下，新戊二醇二缩水甘油醚的固定化效果都强于戊二醛。由于戊二醛呈带有刺激性气味，可引起局部皮肤黏膜刺激，对人体的毒性远大于新戊二醇二缩水甘油醚，因此选择新戊二醇二缩水甘油醚为交联剂。
2.5.3 交联剂浓度对固定化酶效率的影响
不同浓度的交联剂对固定化酶的影响，结果如图7所示。
图7 交联剂浓度对固定化酶的影响
Fig.7 The effect of cross-linking agent concentration on the immobilization of enzyme
由图7可知，当新戊二醇二缩水甘油醚的浓度低于2.0%时，木聚糖酶的固定化效果随着新戊二醇二缩水甘油醚浓度的增加而增加，当交联剂浓度为2.0%时，酶的固定化效果达到最好。可能是交联剂浓度较低时，木聚糖酶结合量少；而过量的交联剂会与酶蛋白过度交联，导致活性中心的改变而使酶失活[32]。
2.5.4 交联时间对固定化酶效率的影响
不同交联时间对固定化酶的影响，结果如图8所示。
图8 交联时间对固定化酶的影响
Fig.8 The effect of cross-linking time on the immobilization of enzyme
由图8可知，随着交联时间的增加，固定化酶活回收率会逐渐提高，当交联时间为3.0 h 时，酶固定化效果最好；当时间再延长，酶活回收率会降低。可能是交联初始，游离酶被交联量较低，因此固定化酶活回收率低；而当吸附酶分子饱和后再增加交联时间，载体孔隙堵塞，使酶促反应时酶分子不能充分展开，导致酶活回收率降低[26]。
2.5.5 固定化时间对固定化酶效率的影响
不同固定化时间对固定化酶的影响，结果如图9所示。
图9 固定化时间对固定化酶的影响
Fig.9 The effect of immobilization time on immobilized enzyme
由图9可知，木聚糖酶的酶活回收率随着固定化时间的增加而增加，当固定12 h 时，固定效果达到最佳。而随着固定化时间的逐渐增加，酶逐渐失活，酶活回收率反而降低。可能是固定化时间过短，酶没有得到较好的固定；而随着固定化时间的逐渐增加，酶会逐渐失活，酶活回收率反而降低。
2.6 响应面试验结果
2.6.1 Box-Behnken 设计与结果
根据单因素试验结果选取壳聚糖浓度（A）、交联时间（B）、固定化时间（C）3 个具有显著影响的因素作为自变量，以酶活回收率（Y）作为响应值。利用Box-Behnken 试验设计原理：试验因素与水平如表3所示；设计17 个试验点的响应面分析试验，试验设计与结果如表4所示。
表3 Box-Behnken 试验因素与水平
Table 3 Factors and levels of Box-Behnken test
水平因素壳聚糖浓度/%交联时间/h固定化时间/h-11.52.510 0 2.03.012 1 2.53.514
表4 Box-Behnken 试验设计与结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken test
试验号A 壳聚糖浓度/%酶活回收率%12.53.01036.72 22.03.01240.09 32.53.51236.27 42.03.51037.63 52.03.01240.42 61.53.01437.24 71.53.01035.75 82.03.51437.31 92.02.51438.67 102.53.01436.53 112.03.01240.16 122.52.51236.01 132.03.01239.84 142.03.01240.29 151.52.51236.59 162.02.51036.85 171.53.51235.88 B 交联时间/h C 固定化时间/h
2.6.2 回归模型的建立及其显著性检验
利用Design-Expert 8.0.6 软件对表4的试验结果进行多元二次回归拟合，回归方程的方差分析结果见表5。
表5 响应面回归方程的方差分析
Table 5 Analysis of variance of response surface regression equation
注：**表示影响极显著，p＜0.01；*表示影响显著，p＜0.05。
方差来源平方和 自由度 均值F 值p 值 显著性模型47.7395.30165.55 ＜0.000 1 **A 壳聚糖浓度6.125×10-4 16.125×10-4 0.019 0.893 9 B 交联时间0.1310.134.14 0.081 3 C 固定化时间 0.9810.9830.59 0.000 9 AB0.2410.247.34 0.030 2*AC0.7110.7122.03 0.002 2**BC1.1411.1435.74 0.000 6**A226.61126.61 830.61 ＜0.000 1 **B28.9618.96279.71 ＜0.000 1 **C24.9714.97155.10 ＜0.000 1 **残差0.2270.032失拟项0.03230.0110.23 0.874 5误差项0.1940.048总和47.9516
由表5可知，回归模型F 值为165.55，且显著性检验为极显著（p＜0.000 1），失拟项不显著（p=0.874 5＞0.05），可知该模型可靠。利用Design-Expert 8.0.6 软件对表5数据进行回归拟合，得到多元回归方程：酶活回收率=40.16+8.750×10-3A-0.13B+0.35C+0.24AB-0.42AC-0.54BC-2.51A2-1.46B2-1.09C2，回归方程决定系数R2=99.53%，R2Adj=98.93%表明该模型预测值与实测值之间具有较好的拟合度和可信度，该方案结果可靠。
2.6.3 各因素响应面交互作用分析
利用Design-Expert 8.0.6 软件对二次响应面回归模型做出相应的响应曲面。由回归模型绘制的响应面图如图10所示。
图10 各因素交互作用的响应面和等高线图
Fig.10 Response surface and contour map of the interaction of various factors
响应曲面图可以直观地反映各因素之间的相互作用。由图10可知，壳聚糖浓度和交联时间、壳聚糖浓度和固定化时间、交联时间和固定化时间，这两者之间存在明显的交互作用，证明了响应面曲线的分析结果的准确性。
2.6.4 最佳固定条件的确定及验证
从上述回归模型中求得固定化最佳条件：壳聚糖浓度为2.25%、交联时间为2.99h、固定化时间为12.14 h。此条件下，模型预测值酶活回收率为39.544 9%。考虑到实际情况，调整条件：壳聚糖浓度为2.0%、交联时间为3.0 h、固定化时间为12 h 进行验证试验。结果表明，在最佳固定条件下重复3 次，其酶活回收率为39.45%，与预测值基本接近，说明所建模型拟合良好且可靠。
3 讨论与结论
本试验成功将酸性木聚糖酶XynA 基因在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达，得到具有活性的可溶性木聚糖酶。经过研究发现该木聚糖酶在酸性条件下表现出良好的稳定性，其最适的pH 值为5.0。该木聚糖酶在pH4.5～5.5 内保持62.37%的酸稳定性；最佳的反应温度为55 ℃，在中温条件下较为稳定。同时，在试验中采用响应面分析法对固定木聚糖酶的材料和条件进行了优化，得到了稳定性好且利用率高的木聚糖酶。研究结果表明：壳聚糖浓度2.0%、交联时间3.0 h、固定12 h 时，酶活回收率为39.45%。该木聚糖酶的酶活回收率高于单宗星等[17]所报道的海藻酸钠固定化木聚糖酶的酶活回收率（28.77%）；但与吴春玲等[33]使用交联酶聚集体法固定化木聚糖酶的酶活回收率（42.2%）相比较低。大多数天然木聚糖酶是中温的，只有在特定的温度、pH 值范围内才能很好地发挥作用。由此可见该方法固定化木聚糖酶具有一定的研究价值，同时为酸性木聚糖酶更好地应用于工业生产提供了一定的理论基础。
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