黄精（Polygonatum sibiricum）别名土灵芝，为百合科黄精属多种植物的干燥块茎，主要分布于北温带和北亚热带。黄精富含多糖、黄酮、生物碱、氨基酸等功能性成分，具有增强免疫功能、抑菌抗炎、降血糖、降血脂等功效，在食品、医疗等领域均具有良好的应用前景[1-4]。黄精是一种药食同源类中药材，常加入粥中熬制，也可蒸制后食用，除此之外，黄精还可加工为米酒、酸奶、发酵饮料等[5-8]。
速溶茶是在保证有效成分的基础上，通过粉碎、浸提、过滤、浓缩和干燥等工艺过程，加工成的一种能够迅速溶解的新型固体饮料，具有饮用方便、便于携带、容易保存等优点[9]。目前，已有关于青钱柳、桑椹、鱼腥草等速溶茶产品的研究报道[10-12]，而黄精速溶茶的报道相对较少。念波等[13]以黄精为原料，乙醇为浸提剂，以乙醇体积分数、料液比为自变量，通过响应面法优化其工艺参数，得到的黄精速溶茶得率和多糖含量均较高，然而试验中浸提剂乙醇的加入虽能促使有效成分溶出量增多，但也有可能改变有效成分的结构，从而影响效果。水煮中药，其有效成分溶出量不多，但生物酶的加入有利于提高有效成分的溶出[14]。前期，课题组研究发现，复合酶（纤维素酶与果胶酶的质量比=1∶1）所得的黄精多糖得率远高于单一酶法的黄精多糖得率，因此，为了进一步提高黄精速溶茶的得率，本试验拟采用超声辅助复合酶法浸提黄精速溶茶，考察液料比、加酶量、酶解温度、酶解时间对黄精速溶茶得率的影响，通过响应曲面法确定最佳工艺条件，旨在为黄精的进一步开发和利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄精：江苏中药科技园，经江苏农牧科技职业学院动物药学院李锋涛博士鉴定为黄精。
葡萄糖对照品：中国食品药品检定研究院；芦丁：上海源叶生物科技有限公司；纤维素酶（1.1×105U/g）、果胶酶（5×104U/g）：和氏璧生物科技有限公司；乙醇、硫酸、三氯化铝（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-1800PC-DS2型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；LE204E电子天平：梅特勒-托利多有限公司；HH-1数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；HK-02A多功能粉碎机：上海烨昌食品机械有限公司；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TDL-5-A低速离心机：上海安亭科学仪器厂；GPW120-II喷雾干燥机：山东天力干燥股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黄精预处理
黄精在60℃下真空干燥，经多功能粉碎机粉碎，过80目筛，所得黄精粉末密封贮藏，备用。
1.3.2 黄精速溶茶提取工艺
称取黄精粉末10 g于具塞锥形瓶中，按照一定的液料比加入一定浓度的复合酶溶液，在一定温度下以200W的超声功率酶解一定时间，再过滤，滤液于100℃水浴1 h灭酶，重复3次，合并3次滤液，冷却、减压浓缩后，加入2%麦芽糊精，170℃喷雾干燥，得黄精速溶茶，根据下列公式计算黄精速溶茶得率。
1.3.3 酶解法提取工艺对黄精速溶茶得率的影响
1.3.3.1 单因素试验
在加酶量1.5%（纤维素酶与果胶酶质量比=1∶1）、酶解温度40℃、酶解时间30 min条件下，考察不同液料比[5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）]对黄精速溶茶得率的影响；在液料比20∶1（mL/g）、酶解温度40℃、酶解时间30 min条件下，考察不同加酶量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对黄精速溶茶得率的影响；在液料比20∶1（mL/g），加酶量1.5%（纤维素酶与果胶酶质量比=1∶1），酶解时间30 min条件下，考察不同酶解温度（30、35、40、45、50℃）对黄精速溶茶得率的影响；在液料比20∶1（mL/g）、加酶量1.5%（纤维素酶与果胶酶质量比=1∶1）、酶解温度40℃条件下，考察不同酶解时间（10、20、30、40、50 min）对黄精速溶茶得率的影响。每个试验平行测定3次。
1.3.3.2 响应面优化黄精速溶茶生产工艺
根据单因素分析结果，以液料比（A）、加酶量（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）为自变量，以黄精速溶茶得率为响应值（Y），采用Box-Behnken试验设计法进一步优化黄精速溶茶生产工艺。分析因素及水平见表1。
表1 响应面试验分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平D酶解时间/min-1 15∶1 1.0 40 30 0 20∶1 1.5 45 40 1 25∶1 2.0 50 50因素A液料比/（mL/g） B加酶量/% C酶解温度/℃
1.4 黄精速溶茶品质指标检测
1.4.1 黄精多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法测定黄精多糖含量[15]，以葡萄糖浓度x为横坐标，吸光度y为纵坐标，绘制标准曲线y=0.0109x+0.0918，R2=0.9993，在10.88μg/mL～50.82μg/mL范围内，葡萄糖浓度与其吸光度具有良好线性关系。
根据下列公式计算多糖含量。
1.4.2 黄精中总黄酮含量测定
以芦丁为标准品，采用三氯化铝显色法测定黄精中总黄酮含量[16]。芦丁标准曲线为y=0.064 2x+0.165 8，R2=0.999 4，在 10.24 μg/mL～51.12 μg/mL 内，芦丁浓度与其吸光度具有良好线性关系。根据下列公式计算黄精黄酮含量。
1.4.3 黄精速溶茶感官评价
取0.75 g黄精速溶茶，在自然光线下观察色泽和外观形态，分别取30、60、100℃的250 mL蒸馏水冲泡，观察溶解性、滋味和气味等变化，并进行评定。
1.5 黄精速溶茶抗氧化活性研究
1.5.1 DPPH自由基清除力测定
参照Shimada等[17]方法进行适当改进，配制4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/mL 黄精速溶茶水溶液，精密移取1.00 mL不同浓度黄精速溶茶水溶液于比色管中，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，置于暗处30 min，测定吸光度。以样品溶剂为空白，测定其上清液在515 nm波长处吸光度A，同时测定在515 nm处样品溶液吸光度A0及DPPH甲醇溶液吸光度A1[18]，平行测定3次，求平均值。按下式计算黄精速溶茶DPPH自由基清除率。
1.5.2 超氧阴离子自由基清除率测定
参照伏有为等[19]的方法进行适当改进，配制4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mg/mL 黄精速溶茶水溶液，准确移取1.00 mL不同浓度的黄精速溶茶水溶液于比色管中，加入 4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）和2 mL 20 mmol/L邻苯三酚溶液，水浴反应15 min，加入2 mL 1%HCl溶液，以蒸馏水为空白在325 nm处测定吸光度Ax，空白对照组吸光度A0，平行测定3次，求平均值。按下式计算黄精速溶茶超氧阴离子自由基清除率。
1.6 数据分析
利用Design-Expert 10.0.3软件进行响应面分析，利用Microsoft Excel 2016进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 液料比对黄精速溶茶得率的影响
液料比对黄精速溶茶得率的影响见图1。
图1 液料比对黄精速溶茶得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea
由图1可知，随着液料比的增加，黄精速溶茶得率先升高后下降，当液料比为20∶1（mL/g）时，黄精速溶茶得率达到26.29%，这可能是由于随着液料比的增加，黄精细胞内外浓度差增大，有利于多糖、黄酮等有效成分浸出，但当液料比过高时，可能减小了黄精有效成分与酶的接触，影响黄精速溶茶的得率[18]。因此，后续响应面试验液料比设置为20∶1（mL/g）。
2.1.2 加酶量对黄精速溶茶得率的影响
加酶量对黄精速溶茶得率的影响见图2。
图2 加酶量对黄精速溶茶得率的影响
Fig.2 Effect of enzyme dosage on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea
由图2可知，当加酶量为0.5%～1.5%时，黄精速溶茶得率逐步增加，之后趋于稳定。这可能是由于随着加酶量的增加，酶与黄精有效成分的结合点增多，加速细胞壁的溶解，有利于多糖、黄酮等有效成分的浸出。因此，后续加酶量选择1.5%左右进行响应面试验。
2.1.3 酶解温度对黄精速溶茶得率的影响
酶解温度对黄精速溶茶得率的影响见图3。
图3 酶解温度对黄精速溶茶得率的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea
由图3可知，随着酶解温度的上升，黄精速溶茶得率先上升，之后有所下降。这可能是因为温度升高能够促进酶解作用，且细胞内溶质分子的扩散速度也会加快，有利于多糖、黄酮等有效成分的溶出[20]，但当温度超过45℃时，黄精速溶茶得率略微下降，这可能是因为每种酶都有最适宜的温度，其中果胶酶和纤维素酶的最适温度在40℃～50℃，故温度过高，会影响酶解作用[21]。因此，后续酶解温度选择45℃左右进行响应面试验。
2.1.4 酶解时间对黄精速溶茶得率的影响
酶解时间对黄精速溶茶得率的影响见图4。
图4 酶解时间对黄精速溶茶得率的影响
Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea
由图4可知，当酶解时间由10 min增加到40 min时，黄精速溶茶得率增加，之后略有下降。这是因为随着酶解时间的延长，酶解反应逐渐进行完全，当酶解时间达到40 min时，黄精多糖、黄酮等有效成分浸出量最多，速溶茶得率达到最大。因此，后续酶解时间选择40 min左右进行响应面试验。
2.2 响应曲面试验设计及结果
2.2.1 黄精速溶茶得率的数学模型建立
根据单因素分析结果，以液料比（A）、加酶量（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）为自变量，以黄精速溶茶得率为响应值（Y），采用Box-Behnken试验设计法进行四因素三水平的响应面试验结果见表2，回归模型方差分析见表3。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface test
试验号A/（mL/g）B/%C/℃D/mim速溶茶得率/%1 15∶1 1.5 45 50 20.42 2 25∶1 1.5 40 40 22.89 3 20∶1 1.5 45 40 26.68 4 25∶1 2.0 45 40 23.87 5 20∶1 1.0 45 50 22.10 6 25∶1 1.5 50 40 22.61 7 20∶1 1.5 50 30 24.49 8 20∶1 1.5 45 40 27.22
续表2 响应面试验设计与结果
Continue table 2 Design and results of response surface test
试验号A/（mL/g）B/%C/℃D/mim速溶茶得率/%9 15∶1 1.5 45 30 18.49 10 20∶1 1.0 50 40 21.72 11 15∶1 2.0 45 40 20.02 12 15∶1 1.5 40 40 17.13 13 25∶1 1.5 45 30 23.78 14 20∶1 2.0 45 50 25.16 15 20∶1 1.5 40 50 24.02 16 15∶1 1.0 45 40 19.08 17 20∶1 1.0 45 30 22.12 18 20∶1 1.5 45 40 27.59 19 20∶1 2.0 50 40 24.79 20 15∶1 1.5 50 40 18.68 21 25∶1 1.0 45 40 21.17 22 20∶1 2.0 40 40 23.35 23 20∶1 1.5 45 40 27.88 24 20∶1 1.5 50 50 24.43 25 20∶1 2.0 45 30 25.32 26 20∶1 1.0 40 40 22.12 27 25∶1 1.5 45 50 24.01 28 20∶1 1.5 45 40 28.06 29 20∶1 1.5 40 30 23.12
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 227.84 14 16.27 38.13 ＜0.000 1 **A液料比 50.06 1 50.06 117.28＜0.000 1 **B加酶量 16.80 1 16.80 39.37 ＜0.000 1 **C酶解温度 1.39 1 1.39 3.27 0.092 3 D酶解时间 0.66 1 0.66 1.55 0.233 2 AB 0.77 1 0.77 1.81 0.199 4 AC 0.84 1 0.84 1.96 0.183 1 AD 0.72 1 0.72 1.69 0.214 3 BC 0.85 1 0.85 1.98 0.180 9 BD 4.9×10-3 1 4.9×10-3 0.011 0.916 2 CD 0.23 1 0.23 0.54 0.474 7 A2 132.01 1 132.01 309.27＜0.000 1 **B2 30.76 1 30.76 72.06 ＜0.000 1 **C2 36.17 1 36.17 84.73 ＜0.000 1 **D2 11.78 1 11.78 27.60 0.000 1 **残差 5.98 14 0.43失拟项 4.76 10 0.48 1.57 0.261 2误差 1.22 4 0.30总和 233.81 28
通过Design-Expert10.0.3软件分析模型，拟合得到黄精速溶茶得率回归方程：得率Y=27.49+2.04A+1.18B+0.34C+0.245D+0.44AB-0.46AC-0.43AD+0.46BC-0.035BD-0.24CD-4.51A2-2.18B2-2.36C2-1.35D2。
由表3可知，建立的模型具有较高的F值（38.13），较低的P值（P＜0.01），说明该模型极显著，失拟项P=0.261 2＞0.05，不显著，说明模型适合本试验，可用于黄精速溶茶提取工艺优化。该模型相关系数R2=0.974 4，校正后系数R2Adj=0.948 9，说明该模型能解释94.89%的响应变化。A、B、A2、B2、C2、D2对速溶茶得率影响差异极显著（P＜0.01），由F值得到影响因素主次顺序为A＞B＞C＞D，即液料比＞加酶量＞酶解温度＞酶解时间。
2.2.2 黄精速溶茶工艺的响应面分析
黄精速溶茶工艺的响应面分析见图5。
图5 各因素交互影响黄精速溶茶得率的曲面图
Fig.5 Surface graph of factor interactions on the yield of Polygonatum sibiricum instant tea
响应面的陡峭程度反映了不同因素对黄精速溶茶得率的影响程度，响应面越陡，说明该因素对结果的影响越大，反之对试验结果影响小[22]。由图5可知，黄精速溶茶得率随着液料比的增加，先急剧上升后下降，响应曲面最陡，说明液料比对黄精速溶茶得率影响最大，之后影响因素依次为加酶量、酶解温度、酶解时间，与方差分析结果一致。
2.2.3 模型验证
根据响应面法建立的模型预测黄精速溶茶最佳酶解工艺为液料比20.737∶1（mL/g）、加酶量1.369%、酶解温度46.876℃、酶解时间37.373 min，此条件下，得率为26.82%，考虑实际操作的可控性，将上述最优酶解工艺修正为液料比21∶1（mL/g）、加酶量1.4%、酶解温度47℃、酶解时间37 min。在此条件下进行验证试验，平行测定3次，黄精速溶茶平均得率为26.08%，与预测值26.82%较为接近，表明该模型能够预测黄精速溶茶的提取工艺，模型可靠。
2.3 黄精速溶茶品质测定
2.3.1 感官评审
最佳酶解工艺条件下干燥后得到的黄精速溶茶，其感官评价见表4。
表4 黄精速溶茶感官评价
Table 4 Sensory evaluation of Polygonatum sibiricum instant tea
指标 性质色泽 黄色溶解性 在沸水中全部溶解滋味和气味 微甜，带原药材香气形态 均匀粉末
2.3.2 不同冲泡温度对黄精速溶茶溶解性影响
取0.75 g最佳酶解工艺条件下的黄精速溶茶，分别加入250 mL的30、60、100℃蒸馏水冲泡，冲泡温度对黄精速溶茶溶解性的影响见表5。
表5 冲泡温度对黄精速溶茶溶解性影响
Table 5 Effect of brewing temperature on the solubility of Polygonatum sibiricum instant tea
冲泡温度/℃ 性质100 15 s内速溶，汤色呈黄色60 30 s内速溶，汤色呈淡黄色30 50 s内速溶，汤色呈淡黄色
2.3.3 理化指标测定结果
最佳酶解工艺条件下黄精速溶茶中的黄精多糖含量为3.73%，黄酮含量为0.95%。
2.4 黄精速溶茶抗氧化活性分析
黄精速溶茶对自由基的清除率见图6。
图6 黄精速溶茶对自由基的清除率
Fig.6 Free radical scavenging rate of Polygonatum sibiricum instant tea
由图6可知，黄精速溶茶对DPPH自由基和超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，且清除率随着黄精速溶茶浓度的增加而增大，之后趋于稳定，当黄精速溶茶浓度达到20.00 mg/mL时，其对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力分别达到62.18%和55.15%，黄精速溶茶对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的半清除率IC50分别为14.34 mg/mL和16.45 mg/mL。
3 讨论与结论
浸提是速溶茶加工中最关键的工序之一，超声辅助复合酶法具有浸提速度快、易于控制等优点，可实现有效活性成分高效提取。耿丽晶等[21]通过复合酶辅助法制备速溶普洱茶，得出最佳工艺参数为复合纤维素酶∶果胶酶∶蛋白酶=1∶1∶1，酶添加量为0.75%，酶解温度为45℃，酶解60 min，茶水比为1∶12（g/mL），浸提2次，产品平均得率为26.23%。王家健等[23]比较了速溶茶酶法提取工艺和传统沸水浸提工艺，结果表明酶法制备的速溶茶更多地保留了茶叶中的有效成分。
本试验采用黄精做原料，利用超声辅助复合酶法浸提制成黄精速溶茶，通过响应曲面法确定最佳工艺条件为液料比21∶1（mL/g）、加酶量1.4%、酶解温度47℃、酶解时间37 min，此条件下，黄精速溶茶平均得率26.08%。所得产品为黄色粉末，在沸水中全部溶解，具有原药材香味，微甜。该茶饮用方便，适合人们快节奏的生活方式。然而，本试验所得黄精速溶茶的得率不高，这可能是由于速溶粉受潮导致粘壁。今后，将进一步研究速溶茶的最佳喷雾干燥技术，为黄精资源的开发开辟新途径。
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