近年来，随着时代的发展，人们越来越关注食品对健康的影响，消费者对食品的关注从最初的美味转向食品对健康的影响。近代研究表明，食品中生物活性成分如多酚、黄酮等在预防疾病方面可以发挥重要作用[1]。因此，关于食品中多酚、黄酮等活性成分的研究已成为热点。现在已经证明酚类化合物在抗氧化功能中起着非常重要的作用[2]。可以有效清除人体内自由基、具有预防动脉粥样硬化、延缓衰老、抗炎及抗癌等功效[3-5]，对维护人体健康具有重要意义。莫凡等[6]以糯米为主料，莲子为辅料，酿造莲子糯米酒，表明得到的莲子糯米酒各项指标都符合国家标准且风味独特，多酚含量为0.864 mg/L，总黄酮含量为0.135 mg/L，生物活性成分得到了提高。赵文净等[7]以糯米为主料，红茶为辅料，采用正交试验研究红茶糯米酒的生产工艺配方，既有糯米酒的香醇又有红茶的芳香且生物活性茶多酚达56.36 mg/kg。赵谋明等[8]以糙米、糯米为主料，青苹果、番石榴、脐橙、芒果为辅料，采用多菌种发酵，表明优化工艺条件下的功能性水果饮料的总酚质量浓度为1 420.14 mg/L，DPPH自由基清除能力为10.14 mmol/L，氧自由基吸收能力为16.65 mmol/L，制备出一种酸甜可口、带水果香味，且酒精度低、富含多酚类化合物，具有强抗氧化活性的水果发酵饮料。魏劲松等[9]以糯米为主料，蕨根为辅料，采用响应面分析法优化蕨根米酒发酵工艺条件，在此条件下总黄酮含量达43.88 mg/L、感官评分85、酒精度为12.65%vol，得到的蕨根米酒是一种富含黄酮类物质、有机酸、氨基酸等多种成分，具有一定养生功能的饮品。
板栗中富含蛋白质、氨基酸、微量元素以及较多的多酚、黄酮类等生物活性成分[10-12]，其中板栗仁多酚类物质含量较高，主要有没食子酸、原儿茶酸、槲皮素、山奈酚等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用[13]。生姜是一种集营养、保健、调味于一体的经济作物[14]。具有多种生物活性物质如黄酮、多酚、多糖等，其中多酚化合物（如姜酚、沙果醇和姜烯酚）含量最高，具有较强的抗氧化、抗炎和抗癌活性[15-16]。中国板栗和生姜的产量在全球均名列前茅，二者在贮藏过程中容易发生腐败，造成严重资源浪费且深加工产品较少，亟需开展深加工技术研究；同时，对食品中多酚、黄酮等生物活性成分研究，虽已深入开展但通过辅料调配定向增加产品中多酚含量，以期改善其功能性的系统研究尚未开展。因此本文以糯米为主料，板栗、生姜为辅料，建立板栗生姜糯米黄酒发酵工艺，以多酚含量和感官评分为评价指标，并通过对比糯米黄酒、市售糯米黄酒、板栗糯米黄酒、板栗生姜糯米黄酒的多酚含量，探讨板栗生姜等辅料对黄酒中多酚含量的影响。为通过辅料调配开发高多酚含量黄酒初步奠定了理论基础，在此基础上进一步深入研究将有利于改善其功能性；同时明确提出将板栗、生姜等果蔬类农产品作为加工辅料和多酚来源纳入食品配方的研究新方向。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
板栗、糯米、生姜：市售；红曲：浙江丽水生物科技公司；小曲：湖南华伟铭化工科技有限公司；无水碳酸钠、没食子酸（均为分析纯）：天津欧博凯化工有限公司；福林酚（分析纯）：上海源叶科技有限公司；糯米黄酒：市售。
1.2 仪器与设备
HL-10D蒸饭柜：浙江宁波赵记电器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；雷磁PHS-25指示计：上海仪电科学仪器股份有限公司；酒精计：河北省武强县华欧仪表配件厂；L530台式低速离心机：湖南湘仪设备有限公司；UV2600A型紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。
1.3 试验方法
板栗生姜糯米黄酒制备工艺流程如下。
生姜汁的制取：选用出汁率高、香味浓、淀粉少的鲜姜；清洗时，应将泥土、须根和烂姜在自来水中彻底清洗干净，然后放进有孔的筐中沥干。先将生姜切成小块，再加3倍的水，用打浆机将其打碎。打碎的姜汁过滤2次，然后高速离心（4 500 r/min离心15 min），取上清液。在20℃～22℃下将红曲和小曲活化2 h。然后将蒸熟的板栗和糯米、过滤后的姜汁与浸泡好的曲混合均匀，放陶罐中搭窝并培菌4 d。然后加入1.5倍体积的水冲缸进行主发酵，每8 h搅拌一次。经过主发酵的板栗生姜糯米黄酒，用无菌纱布进行粗滤，然后在15℃下进行陈酿。最后将陈酿后的板栗生姜糯米黄酒在65℃的条件下煎酒20 min再进行装瓶。
1.4 单因素试验
选择板栗添加量、生姜汁添加量、红曲添加量、小曲添加量、发酵时间、发酵温度进行单因素试验，以产品的多酚含量和感官评分为指标确定最佳发酵工艺参数。发酵初始工艺：板栗添加量为25%、生姜汁添加量为0.6%、小曲添加量为0.8%、红曲添加量为13%、发酵温度为22℃、主发酵时间为8 d。表1为单因素的试验设计。
表1 单因素试验水平
Table 1 Single factor experiment level
水平 板栗添加量/%发酵时间/d 1 20 0.2 12 0.2 20 6 2 25 0.4 13 0.4 22 7 3 30 0.6 14 0.6 24 8 4 35 0.8 15 0.8 26 9 5 40 1.0 16 1.0 28 10生姜汁添加量/%红曲添加量/%小曲添加量/%发酵温度/℃
1.5 正交优化试验
在单因素试验的基础上，选择板栗添加量、生姜汁添加量、小曲添加量、发酵时间4个影响明显因素进行L9（34）正交试验，每个因素设3个水平，并以多酚含量和感官评分为指标获得最佳发酵条件。正交试验因素与水平见表2。
表2 正交试验因素与水平
Table 2 Orthogonal test factors and levels
水平D发酵时间/d 1 25 0.6 0.6 8 2 30 0.8 0.8 9 3 35 1.0 1.0 10因素A板栗添加量/%B生姜汁添加量/%C小曲添加量/%
1.6 感官评价
对黄酒的每个指标分别进行评价，选10名感官评定人员对其各项指标进行打分，平均值作为感官评分。具体评分标准见表3。
表3 板栗生姜糯米黄酒的感官评分标准
Table 3 Sensory scoring standards of chestnut ginger glutinous rice wine
类别 一级 二级 三级滋味（40分）口感一般，酒味平淡，酒体中酸甜辣味较明显，有少许异味（＜24）香气（30分）味感柔和醇厚，酒体完整，甘甜可口，无异味（35～40）味感较柔和，酒体较完整，微酸微甜，无异味（24～34）酒香纯正浓郁，带有明显的栗子和生姜的香气，无异香（25～30）香气浓郁，板栗和姜香较明显，无异香（14～24）气味较淡，有异香（＜14）风格（10分）酒体成分不协调，风格偏差（＜4）澄清（10分）板栗生姜糯米黄酒具有独特的风格，色、香、味协调（8～10）板栗生姜糯米黄酒特有的风格，色、香、味较协调（4～7）不具备应有的特征（＜4）色泽（10分）澄清透明，无悬浮物（7～10）透明度较好，无明显悬浮物（4～6）橙黄或橙红，有色泽（8～10）橙黄或橙红，色泽略差（4～7）黄棕色（＜4）
1.7 理化指标测定
酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮含量分别参照GB/T 13662—2018《黄酒》中的蒸馏法、亚铁氰化钾滴定法、电位滴定法、甲醛滴定法进行测定[17]。
1.8 多酚含量的测定
1.8.1 没食子酸丙酯标准曲线绘制
准确称取250 mg没食子酸丙酯，定容至250 mL；准确取上述对照品溶液 0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600 mL于25 mL比色管中，再加1.25 mL福林酚试剂，摇匀后再加入3.75 mL 20%Na2CO3溶液，定容至刻度，于30℃反应2 h。同时用不加对照品溶液扣除空白。绘制标准曲线，回归方程为y=3.123 2x-0.037 2，R2=0.999 1在0.025 mg/mL～0.600 mg/mL范围内对照品没食子酸丙酯的量与吸光度呈良好的线性关系。
1.8.2 多酚含量的测定
准确量取板栗生姜糯米黄酒1 mL于25 mL比色管中，再加1.25 mL福林酚试剂，摇匀后再加入3.75 mL 20%Na2CO3溶液，于30℃反应2 h，配制相应空白试剂，在760 nm波长处测定吸光度，从标准曲线得出相当于板栗生姜糯米黄酒中多酚物质含量[18]。
1.9 数据处理
每个试验3次重复，用Origin2017软件和Excel对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 板栗添加量对板栗生姜糯米黄酒发酵的影响
不同板栗添加量对多酚含量和感官评分的影响见图1。
图1 不同板栗添加量对多酚含量和感官评分的影响
Fig.1 The effect of different additions of chestnut on polyphenol content and sensory score
由图1可知，板栗添加量在20%～40%时，随着板栗添加量的增加，板栗生姜糯米黄酒多酚含量不断增大，当板栗添加量为30%时，板栗生姜糯米黄酒的感官评分为87.43达到最大值，多酚含量为2.43 g/L，制得的黄酒口感饱满、醇香浓郁。当板栗添加量超过30%时，多酚含量增速变缓，感官评分呈明显下降趋势。可能是板栗自身有较多的酚类物质，板栗的添加虽会提高黄酒的多酚含量和风味，但超过一定范围时，不但会掩盖板栗本身的栗香，而且会影响黄酒的口感。因此，确定板栗最佳添加量为30%。
2.1.2 生姜汁添加量对板栗生姜糯米黄酒发酵的影响
不同生姜汁添加量对多酚含量和感官评分的影响见图2。
图2 不同生姜汁添加量对多酚含量和感官评分的影响
Fig.2 The effect of different ginger juice additions on the content of polyphenols and sensory scores
由图2可知，生姜汁添加量在0.2%～0.8%时，随着生姜汁添加量的增加，板栗生姜糯米黄酒多酚含量和感官评分均不断增加，生姜汁添加量在0.8%时，多酚含量为2.43 g/L，感官评分为88.33，均达到最大值，明显高于其他的生姜汁添加量。当生姜汁添加量超过0.8%时，多酚含量和感官评分随之下降。可能是由于生姜汁中含有的姜辣素会对风味产生负面影响，生姜汁添加量过高时，会影响酵母的生长和发酵，酒精度会降低。而且添加过多也会导致多酚含量偏高，带来苦味，影响感官评分。因此，确定生姜汁最佳添加量为0.8%。
2.1.3 小曲添加量对板栗生姜糯米黄酒发酵的影响
不同小曲添加量对多酚含量和感官评分的影响见图3。
图3 不同小曲添加量对多酚含量和感官评分的影响
Fig.3 The effect of different Xiaoqu addition amount on polyphenol content and sensory score
由图3可知，小曲添加量在0.2%～0.8%时，随着小曲添加量的增加，板栗生姜糯米黄酒多酚含量和感官评分均不断增加，当小曲添加量为0.8%时，板栗生姜糯米黄酒的多酚含量为2.98 g/L，感官评分为85.48，均达到最大值，明显高于其他的小曲添加量。当小曲添加量超过0.8%时，板栗生姜糯米黄酒多酚含量和感官评分随之降低。说明添加适量小曲有利于板栗生姜糯米黄酒风味的形成，曲是将原料中蛋白质和碳水化合物转化为发酵过程中微生物生长所需的肽、矿物质和糖的酶来源[19]。适量的曲能将醪液中大量可发酵性糖转化为酒精，多酚类化合物溶于乙醇，在一定范围内，发酵液中的多酚含量会随着乙醇含量的增加而增加。加入过量的曲，发酵过于迅速，糖化不完全，酒的异味会变重，影响口感。因此，确定小曲最佳添加量为0.8%。
2.1.4 红曲添加量对板栗生姜糯米黄酒发酵的影响
不同红曲添加量对多酚含量和感官评分的影响见图4。
图4 不同红曲添加量对多酚含量和感官评分的影响
Fig.4 The effect of different amounts of red yeast rice on the content of polyphenols and sensory scores
红曲具有丰富的酶系、独特的风味和产红曲色素能力，使其酒体色泽鲜艳，甜味浓郁[20]。在酿造过程中，由于微生物生命活动，原料中原有的不溶性多酚，经过酶的作用不断释放出来，增加了酒体中可溶性多酚的含量[21]。由图4可知，当红曲添加量为13%时，板栗生姜糯米黄酒的多酚含量为2.10 g/L，感官评分达到87.72，均达到最大值。当红曲添加量超过13%时，板栗生姜糯米黄酒的多酚含量和感官评分随之下降。红曲的添加量对于板栗生姜糯米黄酒的品质有着直接的影响。红曲添加过少，菌体生长慢，发酵速度慢，糖化不彻底，酒精生成少，多酚含量低。添加过量，发酵速度快，会抑制酵母的生长和发酵，酒体浑浊。不同红曲添加量对多酚含量和感官评分没有明显影响。因此，确定红曲最佳添加量为13%。
2.1.5 发酵时间对板栗生姜糯米黄酒发酵的影响
不同发酵时间对多酚含量和感官评分的影响见图5。
图5 不同发酵时间对多酚含量和感官评分的影响
Fig.5 The effect of different fermentation time on polyphenol content and sensory score
由图5可知，发酵时间在6 d～9 d时，随着发酵时间的延长，板栗生姜糯米黄酒多酚含量和感官评分均不断增加，发酵第9天时，板栗生姜糯米黄酒的多酚含量为2.04 g/L，感官评分达到86.56，均达到最大值，明显高于其他的发酵时间。当发酵时间超过9 d时，随着发酵时间的不断延长，板栗生姜糯米黄酒感官评分和多酚含量均随之降低。原因可能是酒中大部分物质都是在主酵期间形成的，主发酵进行的好坏是决定酿造酒质量的关键。发酵第9天时，原料中的多酚类物质被释放，发酵过程中酒精含量增加，使多酚类物质溶解量增加。随着发酵时间的延长，酵母在生长代谢过程中会产生一些次生代谢产物，导致总多酚发生氧化、聚合或沉淀等反应。也可能是酒利用总多酚发生褐变反应，导致总多酚含量下降[22-23]。因此，确定最佳发酵时间为9 d。
2.1.6 发酵温度对板栗生姜糯米黄酒发酵的影响
不同发酵温度对多酚含量和感官评分影响见图6。
图6 不同发酵温度对多酚含量和感官评分的影响
Fig.6 The effect of different fermentation temperatures on the content of polyphenols and sensory scores
由图6可知，发酵温度在22℃时，板栗生姜糯米黄酒的多酚含量为2.04 g/L，感官评分达到87.08，均达到最大值，而且在此温度下发酵效果最好，出酒率最高。当发酵温度超过22℃时，板栗生姜糯米黄酒的感官评分和多酚含量随着温度的升高而下降，原因可能是温度太高，酵母容易老化，发酵时间短，容易导致酒精含量低，多酚容易发生自身的氧化反应，影响板栗生姜糯米黄酒的口感。低温可以抑制一些酶（主要是多酚氧化酶和花青素脱色酶）的活性，减弱氧化作用，有效延缓多酚的氧化、聚合和降解，将多酚保留在酒中[24]，从而提高板栗生姜糯米黄酒的风味。在相同的试验条件下，发酵温度对板栗生姜糯米黄酒的感官评分和多酚含量无明显影响，因此，确定最佳发酵温度为22℃。
2.2 正交优化试验结果及分析
考察板栗添加量、生姜汁添加量、小曲添加量、发酵时间4个因素对感官评分和多酚含量的影响，试验结果见表4。
表4 L9（34）正交试验结果
Table 4L9（34）orthogonal experiment results
项目 试验序号感官评分1 1（25） 1（0.6） 1（0.6） 1（8） 2.1203 75.97 2 1 2（0.8） 2（0.8） 2（9） 2.5410 82.07 3 1 3（1.0） 3（1.0） 3（10） 1.7136 83.17 4 2（30） 1 2 3 2.4436 82.63 5 2 2 3 1 1.9409 84.57 6 2 3 1 2 2.4139 85.21 7 3（35） 1 3 2 1.8801 91.09 8 3 2 1 3 1.6144 86.13 9 3 3 2 1 1.8961 86.62多酚含量A板栗添加量/%B生姜汁添加量/%C小曲添加量/%D发酵时间/d多酚含量/（g/L）k1 2.12 2.15 2.05 1.99 k2 2.27 2.03 2.29 2.28 k3 1.80 2.01 1.84 1.92 R 0.47 0.14 0.45 0.35
续表4 L9（34）正交试验结果
Continue table 4L9（34）orthogonal experiment results
感官评分感官评分项目 试验序号A板栗添加量/%B生姜汁添加量/%C小曲添加量/%D发酵时间/d多酚含量/（g/L）k1 80.40 83.23 83.44 82.39 k2 84.14 84.26 83.77 86.12 k3 87.95 85.00 86.28 83.98 R 7.54 1.77 3.84 3.74
由表4可知，根据极差大小得出影响板栗生姜糯米黄酒多酚含量和感官评分的主次因素顺序为A＞C＞D＞B，即板栗添加量＞小曲添加量＞发酵时间＞生姜汁添加量。
由表4可知，以感官评分为指标，得出最佳组合为A3B3C3D2，此时得到的板栗生姜糯米黄酒多酚含量为2.44 g/L、感官评分为82.63；以多酚含量为目标，得出最佳组合为A2B1C2D2，此时得到的板栗生姜糯米黄酒多酚含量为3.37 g/L、感官评分为93.28。经对比，A2B1C2D2的多酚含量及感官评分均高于A3B3C3D2，因此得出最佳组合为A2B1C2D2，即板栗添加量30%，生姜汁添加量0.6%，小曲添加量0.8%，发酵时间9 d。
2.3 验证试验
在糯米添加量70%、板栗添加量30%、生姜汁添加量0.6%，红曲添加量13%，小曲添加量0.8%，发酵温度22℃，发酵时间9 d的工艺条件下，经过3次重复验证试验，结果见表5。
表5 验证试验结果
Table 5 Verification test results
试验序号 时间/d实测值 预测值 相对偏差/%1 0.6 30 0.8 9 94.22 95.88 1.76 2 0.6 30 0.8 9 95.14 95.88 0.78 3 0.6 30 0.8 9 94.40 95.88 1.56生姜汁添加量/%板栗添加量/%小曲添加量/%发酵
由表5可知，测得板栗生姜糯米黄酒的感官评分为94.58，明显优于初始工艺，与预测值相差不足5%，说明具有可靠性。其感官评分也高于胡美怡等[25]研究的板栗黄酒中感官评分92.53。所得板栗生姜糯米黄酒酒香浓郁、色泽呈橙红色、口感饱和、风味醇香、具有板栗独特风味。在此基础上，测定多酚含量为3.45 g/L。
2.4 理化指标测定结果
板栗生姜糯米黄酒的理化指标测定结果见表6。
表6 板栗生姜糯米黄酒的理化指标
Table 6 The physical and chemical indexes of chestnut ginger glutinous rice wine
组别酒精度/%vol总糖（以葡萄糖计）/（g/L）总酸（以乳酸计）/（g/L）氨基酸态氮/（g/L）pH值板栗生姜糯米黄酒 11.3 23.5 6.14 1.56 3.78国家标准（特型黄酒） ≥8.0 15.1～40.0 3.0～7.0 ≥0.35 3.5～4.6
由表6可知，根据板栗生姜糯米黄酒的最佳发酵条件酿造出的黄酒，各项理化指标均符合国家标准。
2.5 多酚含量测定
按照建立的板栗生姜糯米黄酒工艺以及正交试验结果，以优化工艺条件下板栗生姜糯米黄酒为样品，以糯米黄酒、板栗糯米黄酒和市售糯米黄酒为对照样，进行多酚含量测定，结果见图7。
图7 板栗生姜糯米黄酒中多酚含量对比结果
Fig.7 Comparison results of polyphenol content in chestnut ginger glutinous rice wine
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
不同风味黄酒的多酚含量存在差异，酚类物质对黄酒的品质和风味有重要影响。黄酒中的酚类物质一般来源于原料及微生物的转换，经过长时间发酵，使原料中多酚类物质溶于黄酒中[26]。除了发酵工艺和酒曲的影响，添加不同的辅料对黄酒的品质参数有显著影响。由图7可知，糯米黄酒和板栗糯米黄酒中分别含有1.05 g/L和2.99 g/L多酚，板栗糯米黄酒的多酚含量显著高于糯米黄酒（P＜0.05），这可能是板栗糯米黄酒中加入酿造辅料板栗所致，板栗中多酚物质含量远比糯米中高[27-28]。经过发酵，已全部吸收到酒液，大大提高了多酚含量。板栗生姜糯米黄酒多酚含量为3.45 g/L，远远高于其他3种黄酒含量，多酚含量是糯米黄酒的3倍，是市售糯米黄酒的2倍，是板栗糯米黄酒的1.15倍；这可能是由于添加复方辅料板栗和生姜所致。虽然生姜汁仅添加0.6%，但由于生姜中多酚含量[29]远远高于板栗和糯米中的多酚含量，仍显著增加了板栗生姜糯米黄酒的多酚含量。因此富含多酚类化合物发酵辅料搭配对黄酒中多酚含量具有重要调节作用。
3 结论
以糯米为主料，板栗、生姜为辅料，确立了板栗生姜糯米黄酒发酵工艺，并对其工艺参数进行优化，最佳的工艺条件：板栗添加量30%、生姜汁添加量0.6%、小曲添加量0.8%，红曲添加量13%、主发酵时间9 d、发酵温度22℃，在此条件下酿制得的黄酒多酚含量为3.45 g/L，感官评分94.58，其各项理化指标均符合国家标准。
优化条件下板栗生姜糯米黄酒不仅口感饱满、风味独特、营养丰富，而且其生理活性物质多酚含量显著高于板栗糯米黄酒、糯米黄酒、市售糯米黄酒，酿造辅料板栗和生姜是板栗生姜糯米黄酒中多酚的重要来源之一。板栗生姜糯米黄酒工艺简单、操作便利，为板栗深加工提供新的思路，同时开辟了将板栗、生姜等作为酿造辅料和多酚来源纳入黄酒配方的研究新方向。
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