花生粕是花生制油后的主要副产品[1]，其蛋白质 含量高达40%～50%[2-4]，是一种丰富的蛋白质资源。目前我国市场上的花生粕主要为高温花生粕，压榨过程中温度可达100℃～150℃，高温高压使得蛋白质变性严重、溶解性差、回收率低，其营养价值和功能特性也受到影响。另外，在高温高压条件下发生的化学反应使花生粕呈色较深，多数高温花生粕被用作饲料，附加值较低。因此，对高温花生粕进行加工，提高回收率的同时制备功能性蛋白或肽，提高高温花生粕的附加值，具有重要意义。
酶水解是一种条件温和、不破坏食品中蛋白质营养价值、可以获得良好蛋白质功能性质并有效提高蛋白质回收率的方法。经过酶解后的水解产物易被人体消化吸收，更能促进人体健康，研究表明花生蛋白水解物具有乳化性、起泡性及保水性等功能特性[5]。王越等[6]发现采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶对花生蛋白进行水解可以明显提高花生蛋白的一氧化氮自由基清除能力，为花生免疫活性肽的开发提供了依据。赵谋明等[7]利用不同蛋白酶水解高温花生粕和低温花生粕，对比其功能性质和抗氧化活性，结果发现用生物酶解的方式能够有效利用高温花生粕中的蛋白质，但并未关注酶解物界面活性。
本文用不同蛋白酶水解高温花生粕，测定酶解物的功能性质和抗氧化活性，筛选出最合适的蛋白酶，以期得到具有良好界面活性和抗氧化活性的酶解物，为高温花生粕蛋白在食品行业中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高温花生粕：山东金胜粮油食品有限公司。
碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶：北京诺维信生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（2 000 L/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海华蓝化学科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
FE28 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS离心机：湘仪离心机仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；UV-5100B紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；T25高速分散机：德国IKA公司；800Y粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酶水解
预处理：将高温花生粕置于粉碎机中，粉碎后过80目筛除去大颗粒和杂质。采用盐酸溶液洗涤的方式对高温花生粕进行脱色，脱色条件为料液比为1∶5（g/mL）、pH3.0、50 ℃、120 min。
酶水解：取适量高温花生粕粉末，以1∶10（g/mL）料液比加入去离子水，并将其调节至酶的最适pH值和最适温度，随后向上述溶液中分别加入质量分数为1%（按底物计）的酶，酶解360 min。酶解结束后，将酶解混合物在100℃下加热10 min灭酶活，4 000 r/min下离心30 min，取上清液冷冻干燥，-20℃保存备用[7-8]。不同蛋白酶的最适温度和pH值见表1。
表1 不同蛋白酶的最适温度和最适pH值
Table 1 Optimum temperature and pH of proteases
蛋白酶种类 最适温度/℃ 最适pH值碱性蛋白酶 55 8.0复合蛋白酶 55 7.5木瓜蛋白酶 55 7.0中性蛋白酶 55 7.0风味蛋白酶 55 7.5
1.3.2 水解度的测定
水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定采用pH-stat法[9]，按公式（1）计算水解度。
式中：B为NaOH溶液的消耗体积，mL；c为NaOH浓度，mol/L；M为被水解蛋白质的质量，g；α为蛋白质水解时的氨基解离度；htot为每克蛋白质中肽键的毫摩尔数，7.13 mmol/g。
1.3.3 蛋白质提取率的测定
蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法进行，按照公式（2）计算蛋白质提取率。
1.3.4 分子量分布的测定
采用高效液相色谱（high performance liquid，chromatography，HPLC）测定水解物的分子量分布[10]，检测条件为色谱柱：TSKgel2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1（体积比）；流速：0.5 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：30℃；标准物质子质量分别为肌红蛋白（16951Da）、抑肽酶（6511Da）、血管紧张素（1 045 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）。
1.3.5 起泡性及泡沫稳定性的测定
起泡性（forming capacity，FC）和泡沫稳定性（forming stability，FS）的测定方法参考Jia等[11]的方法。按照下列公式计算FC和FS。
式中：V1为均质0 min后的泡沫体积，mL；V0为均质前的样品体积，mL。
式中：V1为均质0 min后的泡沫体积，mL；V2为均质30 min后的泡沫体积，mL。
1.3.6 乳化活性及乳化稳定性的测定
参考Zhang等[12]的方法并加以修改。用20 mmol/L pH7的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为0.2%的样品溶液12 mL，加入4 mL大豆油混匀，于10 000 r/min均质2min。均质后0min和10min分别从乳化层吸取100μL样品，与5 mL浓度为0.1%十二烷基硫酸钠溶液混合，在500 nm处测定吸光度。按照公式（5）和（6）计算乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）、乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）。
式中：A0为均质后稀释样品的吸光度；N为样品稀释的倍数；ρ为样品的质量浓度，g/mL；I为比色皿厚度，cm；φ为乳化液中油的体积分数，0.25。
式中：Δt为两次测量之间的间隔时间，min；A0为均质后稀释样品的吸光度；A10为均质10 min后的吸光度。
1.3.7 DPPH自由基清除率的测定
参考杨珊珊等[13]的方法测定DPPH自由基清除率。水解产物的浓度为0.2 mg/mL～2.0 mg/mL，其余操作与参考文献相同。按公式（7）计算DPPH自由基清除率。
式中：A1为对照组的吸光度；As为试验组的吸光度；A0为空白组的吸光度。
1.3.8 酶水解动力模型的构建过程
以经典的米氏方程为基础，用数学推导结合试验研究的方法，构建蛋白酶水解高温花生粕动力学模型。根据相关数据确定模型参数，并对试验模型进行验证。
E代表酶、S代表底物、ES代表两者结合物、P代表酶解产物，蛋白酶酶解蛋白质的反应过程为E+S↔ES→E+P[14]。
根据Wu等[15]和石宁蕙等[16]的方法，蛋白酶有限水解动力学模型用公式（8）表示。
式中：a、b为动力学参数。
1.4 数据分析
所有试验平行测定3次，采用IBM SPSS Statistics 25.0、Origin 2016和Excel软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 水解度测定结果
酶解法是制备多肽常用的方法，不同种类的蛋白酶有不同的酶切位点，从而导致蛋白酶水解物具有不同的理化特性和功能特性[17]。不同蛋白酶水解高温花生粕的水解曲线如图1所示。
图1 不同蛋白酶水解高温花生粕的水解曲线
Fig.1 Hydrolysis curves of hot-pressed peanut meal with different proteases
由图1可知，所有蛋白酶水解高温花生粕的水解曲线随着水解时间的延长呈先快速上升后趋于平稳的趋势。水解30 min后，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的水解进程开始变慢，逐渐达到稳定状态，而复合蛋白酶、碱性蛋白酶的DH一直保持上升趋势。水解360 min后，高温花生粕经复合蛋白酶水解的DH为11.70%，经碱性蛋白酶水解的DH为24.87%。木瓜蛋白酶的水解度在120 min时达到最大值，达到最大水解度时间最短，因此水解效率最大。
2.2 蛋白质提取率测定结果
高温花生粕经不同蛋白酶水解后的蛋白质提取率结果见图2。
图2 不同蛋白酶水解后的蛋白质提取率
Fig.2 Protein extraction rates after hydrolysis with different proteases
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，碱性蛋白酶水解产物的蛋白质提取率最高，为82.53%，其次为复合蛋白酶（75.62%），木瓜蛋白酶酶解产物的蛋白质提取率为63.77%。碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶的蛋白质提取率均高于用蒸汽爆破辅助碱溶酸沉法[18]提取高温花生粕中的蛋白质提取率（52.6%），高于赵谋明等[7]酶解提取高温花生粕中的蛋白质提取率（60.61%～67.86%）。由此可见，酶水解的方式可以有效地将高温花生粕中的不溶性蛋白[19]转变为可溶性的肽，从而将蛋白提取出来。
2.3 分子量分布
分子量大小是影响肽段功能性质和生物活性的重要因素。根据分子量的大小，将色谱峰分为I～V 5个区段，分别对应分子量＞10 kDa、3 kDa～10 kDa、1 kDa～3 kDa、500 Da～1 kDa及＜500 Da。酶解产物的分子量分布如表2所示。
表2 不同蛋白酶水解物的分子量区段百分比
Table 2 Percentages of protease hydrolysates in different molecular weight ranges
酶种类 ＞10 kDa 3 kDa～10 kDa 1 kDa～3 kDa 500 Da～1 kDa ＜500 Da碱性蛋白酶 2.90 14.95 21.30 60.86复合蛋白酶 1.25 13.61 24.12 21.95 39.07木瓜蛋白酶 3.60 21.83 25.82 20.23 28.52中性蛋白酶 8.10 32.35 25.77 12.67 21.12风味蛋白酶 10.54 48.86 13.88 21.40 5.31
由表2可知，碱性蛋白酶水解物中小分子量组分（＜500 Da及500 Da～1 kDa）含量最多，大分子量组分（＞10 kDa及3 kDa～10 kDa）含量最少，而风味蛋白酶水解物中小分子组分含量最少，大分子量组分最多，说明小分子组分含量与DH呈正相关，大分子组分含量与DH呈负相关。木瓜蛋白酶水解物中＞1 kDa组分含量和＜1 kDa组分含量相当。
2.4 起泡性和泡沫稳定性测定结果
不同蛋白酶水解产物的起泡特性如图3所示。
图3 不同蛋白酶水解物的起泡性和泡沫稳定性
Fig.3 Foaming ability and foam stability of protease hydrolysates
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，中性蛋白酶水解产物的起泡性最高，优于复合蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶水解产物。木瓜蛋白酶水解产物起泡性与中性蛋白酶水解产物无显著差异。木瓜蛋白酶水解产物有较高的起泡性，可能是因为蛋白质在木瓜蛋白酶的水解作用下肽键断裂、水解成大量肽段、蛋白质分子的总面积变大、溶解性增强，使肽在空气-水界面形成膜的能力增强。这与木瓜蛋白酶改性蛋清蛋白，提高了蛋清蛋白的起泡性和泡沫稳定性的结果一致[20]。为了测定高温花生粕水解物的泡沫稳定性，对搅拌后的泡沫进行30 min的观察。由图3可知，木瓜蛋白酶水解物的泡沫稳定性最高，可达67.19%。碱性、复合蛋白酶水解物的泡沫稳定性较低，原因可能是水解过程中产生很多小分子的肽，吸附到界面上后界面膜强度不足以支撑泡沫的稳定[21]。
2.5 乳化活性和乳化稳定性测定结果
乳化性用于反映蛋白质在油水界面处的吸附能力与稳定能力，分别用乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）来表示。不同蛋白酶水解物的EAI和ESI见图 4。
图4 不同蛋白酶水解物的乳化活性和乳化稳定性
Fig.4 Emulsifying activity and stability of protease hydrolysates
由图4可知，不同蛋白酶水解物的乳化性不同，木瓜蛋白酶酶解物的乳化活性指数最强，其次是中性蛋白酶水解物，碱性蛋白酶水解物的乳化活性最差。木瓜蛋白酶水解物的乳化活性指数最强，原因可能是蛋白酶的水解作用把花生蛋白的疏水基团暴露出来，从而使油水界面的张力变小，经水解作用产生的肽更易作用于油水界面并有序排列，这些变化使木瓜蛋白酶水解物有较高的乳化活性指数[22]。在用不同蛋白酶酶解枣仁蛋白时，木瓜蛋白酶水解物的乳化活性指数较高[23]。复合蛋白酶水解产物的乳化稳定性指数最大，中性蛋白酶水解物的乳化稳定性指数最小。木瓜蛋白酶水解物的乳化稳定性较差可能是因为水解过度导致油水界面分布的短肽减少、流动性减弱、蛋白质的聚集能力减弱，使乳化稳定性降低[23]。
2.6 DPPH自由基清除率测定结果
不同蛋白酶的水解物均具有一定的DPPH自由基清除活性，且在一定浓度范围内DPPH自由基清除率与样品浓度呈正相关。用IC50代表DPPH自由基清除率为50%时的样品浓度，IC50越小，DPPH自由基清除能力越强。各酶解产物DPPH自由基的IC50见表3。
表3 不同蛋白酶水解物DPPH自由基的IC50
Table 3 IC50of DPPH radicals of proteases hydrolysates
酶种类IC50/（mg/mL）碱性蛋白酶 0.84复合蛋白酶 0.81木瓜蛋白酶 0.72风味蛋白酶 0.89中性蛋白酶 1.03
由表3可知，由木瓜蛋白酶水解得到的水解物DPPH自由基清除能力最强（IC50=0.72 mg/mL），其次分别为复合蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶水解物，中性蛋白酶水解物DPPH自由基清除能力最差，说明木瓜蛋白酶释放高温花生粕中抗氧化肽段的能力最强。这与草菇蛋白木瓜蛋白酶水解物清除DPPH自由基的结果一致[24]。
2.7 酶解动力学模型构建的结果
2.7.1 模型的拟合
鉴于木瓜蛋白酶水解效率最高，蛋白质提取率较高，起泡性、乳化活性和DPPH自由基清除活性最高，因此木瓜蛋白酶为最适用酶。采用方程DH=[ln（1+abt）]/b 对不同酶浓度（E0）、不同底物浓度（S0）下水解度与水解时间进行回归分析，求出参数a、b，构建酶水解动力模型，结果见图5和表4。
表4 不同E0/S0条件下木瓜酶解花生蛋白动力学特征参数
Table 4 Kinetic characteristics of enzyme hydrolysis of peanut protein by papain under different E0/S0conditions
注：E0为初始酶浓度；S0为初始底物浓度。
E0/（g/L）S0/（g/L）E0/S0a/min-1bab 0.6 6 0.100 92.419 1.039 96.087 0.6 8 0.075 39.181 1.074 42.096 0.6 10 0.060 14.766 0.995 14.706 0.6 12 0.050 10.018 1.039 10.418 0.6 14 0.043 7.141 1.701 12.151 0.4 10 0.040 7.109 1.699 12.081 0.6 10 0.060 14.786 1.003 16.843 0.8 10 0.080 53.774 1.119 60.208 1.0 10 0.100 95.858 1.055 101.143
图5 不同酶浓度、不同底物浓度与水解度关系的非线性拟合
Fig.5 Nonlinear fitting of the relationship between enzyme concentrations，substrate concentrations，and degree of hydrolysis
A.酶浓度；B.底物浓度。
由图5可知，DH=[ln（1+abt）]/b数据的拟合度较高，说明该方程可以用来描述酶水解过程。
由表4可知，b值在不同水解过程中变化不大，趋向于定值1.192。参数a与E0/S0存在一定线性关系，对a和E0/S0进行线性关系拟合，结果如图6所示。
图6 a值随着不同的E0/S0值的变化趋势
Fig.6 Variation trend of a with E0/S0values
由图6可知，a和E0/S0的线性关系可表示为a=1 532.6E0/S0-66.084。
把上述试验中所得动力学参数a值和b值分别代入方程，得到木瓜蛋白酶可控酶解高温花生粕的动力学模型，即 DH=0.839ln[1+（1 826.859E0/S0-78.772）t]。从该方程可以看出水解度随着初始酶浓度的增大而增大，随初始底物浓度的增大而减小，随着水解时间的延长，水解的反应速率逐渐降低，这与前面的试验结果一致，说明该动力模型具有一定的可靠性。
2.7.2 模型的验证
为了验证动力学模型的可靠性，把水解动力学模型的计算结果与实际测定值进行比较。在水解温度为55℃、pH7.0、初始底物浓度100 g/L、酶浓度0.6 g/L条件下，得到相应水解条件下的理论酶解曲线，结果如图7所示。
图7 实际水解度与模型预测水解度
Fig.7 Actual degree of hydrolysis and model-predicted degree of hydrolysis
由图7可知，水解度的理论值与实际值相比，相对平均误差值为7.6%，小于10%，证明所建动力学模型能较好地模拟酶解过程，具有一定的实际应用价值，可以用来描述水解条件与水解度之间的关系。
3 结论
本文研究了蛋白酶种类对高温花生粕酶解过程和酶解物性质的影响，筛选制备兼具功能性和抗氧化性肽的最适用酶，并对其酶解过程进行动力学分析。结果表明，酶水解是提取高温花生粕蛋白的有效手段，最适用酶为木瓜蛋白酶，其水解120 min时，水解度达最大值，为4.87%，蛋白质提取率为63.77%，起泡性为216.24%，泡沫稳定性为 67.19%，EAI为 39.70 m2/g，ESI为14.88 min，木瓜蛋白酶水解高温花生粕的动力学模型为 DH=0.839ln[1+（1 826.859 E0/S0-78.772）t]。本研究为高温花生粕的高值化利用提供了方向。但是木瓜蛋白酶水解物的蛋白质回收率与碱性蛋白酶水解物的回收率还有一定差距，需要对木瓜蛋白酶的水解过程进一步优化以提高蛋白质回收率。
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