蜂蜜含有丰富的营养物质，其糖类成分含量高，以葡萄糖、蔗糖和果糖为主，是天然的糖源，还含有各种酶类、蛋白质和维生素等活性成分，具有杀菌、促进伤口愈合、促进肠胃消化的作用[1]。目前蜂蜜产业趋势供大于求，一部分蜂蜜被酿造成蜂蜜酒，饮用蜂蜜酒能起到健脾通肠、养颜美容等保健功效，但是蜂蜜酒口味单一，不符合年轻人的市场需求，因而蜂蜜在创新性开发方面有待深入研究[2]。蓝莓果实富含花青素、氨基酸、维生素、矿物质等活性成分，具有延缓衰老和保护视力的功效，得到消费者青睐[3]。由于蓝莓上市时间比较集中，保鲜储存的成本较高，将其酿造成果酒可以极大改善浪费现象，并且蓝莓酒富含的多酚类、黄酮类物质能够清除人体自由基，达到抗氧化的效果[4]。
目前人们研究蓝莓酒的热潮持续高涨，张杨等[5]的试验表明蓝莓酒经过发酵之后仍存在许多花色苷物质；赵慧芳等[6]将黑莓和蓝莓进行复合发酵，提高花色苷的稳定性，改善褐变现象，有利于多酚物质的浸出；屈嫒等[7]通过响应面试验得到高酒精度蓝莓酒的最佳发酵工艺条件，延长了蓝莓酒的贮藏期。然而，尚未见有关不同糖源发酵蓝莓酒的相关报道。
本文制备3种不同糖源（蜂蜜、黄冰糖、不添加糖源）的发酵蓝莓酒，发酵过程中检测可溶性固形物、pH值、酒精度、总酸4个理化指标的变化趋势，通过测定抗氧化物质（总酚、总黄酮、花青素）含量比较不同蓝莓酒的抗氧化性能，将发酵果酒所测指标进行相关性分析和主成分分析，综合评价出最佳发酵工艺，为蜂蜜和蓝莓的深加工提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜂蜜、新鲜蓝莓、黄冰糖：市售；酿酒酵母RB2、焦亚硫酸钾（potassium metabisulfite，PMS）、果胶酶（3 280 U/g，以半乳糖醛酸计）、碳酸氢钾、酵母营养助剂（均为食品级）：法国Laffort公司；没食子酸标准品、芦丁标准品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）标准品、三吡啶基三嗪[1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine，TPTZ]标准品：上海晶纯生化科技股份有限公司；福林酚、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、浓盐酸、三氯化铝、无水乙醇、甲醇、氯化铁、硫酸亚铁、乙酸钠、无水碳酸钠、酚酞指示剂（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
801B型破碎机：中天炊事机械厂；HV-02型压榨机：川泰机械厂；PAL-1手持糖度计：日本ATAGO公司；DMATM 35便携式密度浓度计：奥地利安帕公司；雷磁PHS-3E型pH计、ZDJ-4B自动电位滴定仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；Agilent 7890B气相色谱仪：美国安捷伦公司；UV-2600紫外可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蓝莓酒发酵工艺流程
图1为蓝莓酒发酵工艺流程。
图1 蓝莓酒发酵工艺流程
Fig.1 The fermentation process of blueberry wine
具体流程：用稀释的100 mg/L PMS溶液清洗蓝莓果实，挑除有瑕疵的烂果，用破碎机将果实切片，放入充有二氧化碳的发酵桶，果胶酶按照0.03 g/L的用量、PMS按照100mg/L的用量添加，搅拌均匀后放入14℃～16℃环境下静置12 h，酿酒酵母RB2按照3 g/L的用量添加，加入2 mL蓝莓果汁进行水浴加热（30℃）活化30 min之后再接入发酵桶中，酵母营养助剂按照3 g/L的用量同时添加，之后在14℃～16℃环境下进行发酵。定期测定可溶性固形物、pH值、酒精度、总酸等变化直至主发酵结束，当残糖含量和酒精度变化平缓时表明主发酵结束。主发酵结束后，将不同的发酵蓝莓酒经压榨机和滤网过滤澄清，装入新的发酵罐中4℃低温陈酿1个月，陈酿结束后于60℃条件下巴氏杀菌30 min装瓶储存。
1.3.2 蓝莓酒理化指标的测定
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[8]中的方法测定样品可溶性固形物、pH值、总酸、挥发酸、SO2含量并进行感官评分；参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的方法测定酒精度[9]；参照GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》中的方法测定甲醇[10]。
1.3.3 蓝莓酒花青素含量的测定
采用pH示差法[11]测定波长519 nm和700 nm处吸光度。含量以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计，花青素含量计算公式如下。
花青素含量/（mg/L）=（A×449.2×n）×1 000/26 900
式中：A为不同pH值下吸光度差值，A=[（A519-A700）pH1.0-（A519-A700）pH4.5]；n 为稀释倍数；449.2 为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，g/mol；26 900为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，mol/cm。
1.3.4 蓝莓酒总多酚含量的测定
采用福林酚法测定样品中总多酚含量[12]，将没食子酸标准品配制成不同浓度（0.017、0.034、0.068、0.012、0.136、0.170 mg/mL），以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。每个样品需要平行测定3次，标准曲线方程为y=5.201 1x-0.015 7，R2=0.999 3。
1.3.5 蓝莓酒总黄酮含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法，测定样品中总黄酮含量[13]，将芦丁标准品配制成不同浓度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。每个样品需要平行测定3次，标准曲线方程为y=7.928 5x+0.026 2，R2=0.999 1。
1.3.6 蓝莓酒DPPH自由基清除率的测定
DPPH自由基清除率的测定根据Carmona-Jiménez等[14]和王纯等[15]的方法测定。采用分光光度计测定波长517 nm处吸光度Ai，对照组以甲醇溶液代替样品，测其吸光度A0。DPPH自由基清除率计算公式如下。
DPPH自由基清除率/%=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100
式中：A0为DPPH溶液与甲醇混合的吸光度；Ai为DPPH溶液与样品溶液混合的吸光度；Aj为样品溶液与甲醇混合的本底吸光度。
1.3.7 蓝莓酒铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）的测定
铁离子还原能力的测定参照文献[16]的方法，以硫酸亚铁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。每个样品需要平行测定3次，标准曲线方程为y=0.664 5x-0.037 5，R2=0.999 6。样品最终的总抗氧化能力以硫酸亚铁当量浓度（mmol/L）表示。
1.3.8 蓝莓酒色度的测定
以样品在波长420、520、620 nm处的吸光度之和[17]表示色度。
1.4 数据分析
采用软件Origin 2018作图，SPSS 23.0进行数据处理，结果用平均值±标准差表示。应用单因素方差分析（One-way ANOVA）、邓肯氏新复极差法和皮尔逊相关性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中可溶性固形物、酒精度、pH值和总酸的变化
图2为发酵过程中可溶性固形物、酒精度、pH值和总酸的变化曲线。
图2 不同发酵体系中可溶性固形物、酒精度、pH值、总酸的变化
Fig.2 Changes of soluble solids，alcohol，pH，total acid in different fermentation systems
A.可溶性固形物；B.酒精度；C.pH值；D.总酸。
由图2A可知，不同糖源发酵蓝莓酒中可溶性固形物含量随着发酵时间的延长均逐渐降低，其中，添加蜂蜜和黄冰糖蓝莓酒的可溶性固形物含量在发酵前10 d有着明显的下降趋势，之后逐渐趋于平稳，而未添加糖的蓝莓酒在发酵5 d后无明显变化。在发酵初期，蜂蜜蓝莓酒可溶性固形物含量较黄冰糖蓝莓酒下降明显，这是由于蜂蜜中所含的糖类为葡萄糖和果糖等单糖，能够直接被酵母利用转换成酒精[18]，而黄冰糖需要经过酵母中的转换酶将其分解为葡萄糖和果糖后，再继续转换为酒精，其发酵速度没有蜂蜜体系快。对比发酵后期的可溶性固形物含量，蜂蜜蓝莓酒高于黄冰糖蓝莓酒，其原因是蜂蜜除含有糖类这些主要物质外，还含有其他非糖类的可溶性成分，也使得酒体更加醇厚[19]。
酒精是酵母利用糖分转换而得，由图2B可知，不同蓝莓酒的酒精度随着发酵时间延长逐渐升高，酒精度的变化总体呈现上升的趋势且前期酒精度上升速度比后期快，这与图2A中可溶性固形物的含量变化一致，说明前期的酵母菌活力与后期相比发生了改变，前期酵母菌的活力高、代谢旺盛，而后期酵母菌的活力降低、代谢能力减弱[20]。随后，由于酸度的增加，发酵的环境变差，酵母发酵受到影响，导致发酵速度降低，酒精含量的增加幅度变得缓慢。在发酵前5 d，蜂蜜体系的酒精度明显高于黄冰糖体系，这是由于蜂蜜中的单糖直接被酵母利用，而黄冰糖中的单糖需要时间转换。在发酵5 d～10 d时，2个体系的酒精度趋于一致，这可能是由于黄冰糖中的单糖被酵母转换成酒精，蜂蜜体系中单糖的利用接近尾声。发酵后期，蜂蜜体系的酒精度依然高于黄冰糖体系，是因为酵母对蜂蜜中碳水化合物的利用率高于黄冰糖，最终得到的酒精度较高。不添加糖的蓝莓酒由于没有足够糖分，酵母所转换的酒精度只能维持在4%vol以内。
合适的pH值有利于酵母菌的生存[21]，因此在对比蜂蜜和黄冰糖体系的发酵性能时，均将其调整为3.4，由图2C可知，3个体系的pH值在发酵初期均呈现下降趋势，蜂蜜体系在第4天出现上升，而其他2个在第5天发生变化，这是因为发酵前期糖分可以为酵母提供生长繁殖的能源，发酵体系内部的微生物能够促进有机酸的生成，有机酸的含量逐渐变多，因此前期的pH值呈现出下降的趋势。发酵5 d后，pH值开始逐渐上升，这是因为前期生成的酒精和有机酸在发酵体系内部发生了酯化反应，生成了新的酯类物质，给蓝莓酒增添风味。在发酵后期pH值略有波动，这可能与发酵体系内部微生物的作用相关。在第15天蜂蜜蓝莓酒的pH值处于最低水平，这是因为有机酸含量高于其他2个体系。
由图2D可知，总酸在发酵过程中对酵母的生长和酒体的风味起着重要作用[22]，在发酵初期会产生乙酸、琥珀酸、苹果酸和丙酮酸等，导致蓝莓酒总酸升高。到发酵后期，部分乙酸被酵母还原成乙醇，苹果酸也可能在适温条件下被酵母降解，其中一部分酸进行乳酸发酵，多元酸转变成一元酸；同时部分酸与醇形成酯类物质，使得到的总酸含量降低[23]。3种蓝莓酒的产酸趋势相似，蜂蜜蓝莓酒总酸含量在第4天开始有下降的趋势，而黄冰糖蓝莓酒和不加糖蓝莓酒在第5天开始有下降的趋势，这与pH值的变化规律一致。发酵期间总酸含量有波动，这可能是因为发生苹果酸-乳酸反应。在第15天蜂蜜蓝莓酒的总酸含量处于最高水平，这与pH值结果相一致。
2.2 蓝莓酒考察指标测定结果
对3种发酵蓝莓酒第15天的各项参数进行整合，结果见表1。
表1 不同糖源蓝莓酒的考察指标
Table 1 Examine indicators for blueberry wine of different sugar source
注：同列不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。
类型 可溶性固形物/（g/L）酒精度/%vol pH值 甲醇/（mg/L）挥发酸/（g/L）总酸/（g/L）游离SO2/（mg/L）总SO2/（mg/L） 色度 感官评分蜂蜜蓝莓酒 6.17±0.06a11.60±0.26a3.12±0.03b147.09±1.66b0.58±0.02a6.29±0.13a11.73±0.92b51.73±0.92b 6.71±0.03a 88.33±1.02a黄冰糖蓝莓酒 5.27±0.06b10.17±0.35b3.21±0.03a153.10±1.98a0.38±0.01b5.35±0.13b10.67±0.92b50.13±0.92b5.02±0.04b82.63±1.06b不加糖蓝莓酒 3.33±0.06c 3.60±0.10c 3.25±0.02a129.22±0.74c0.22±0.01c4.84±0.08c14.93±0.92a53.87±0.92a 4.62±0.03c 72.23±0.55c
由表1可知，不同处理所得到的蓝莓酒可溶性固形物、酒精度、甲醇、pH值、挥发酸、总酸、游离SO2和总SO2等指标均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》以及GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》中的要求。
蜂蜜蓝莓酒的可溶性固形物含量较高，表明其酒体更加饱满醇厚；调整发酵液糖度一致，蜂蜜蓝莓酒的酒精度高于黄冰糖蓝莓酒，这是由于酵母充分利用蜂蜜中的糖源，得到较高的转换率，而不加糖蓝莓酒由于糖分稀缺只得到了4%vol以内的酒精度；3种蓝莓酒的甲醇含量均符合国标要求，其中蜂蜜蓝莓酒的含量低于黄冰糖蓝莓酒；蜂蜜蓝莓酒的pH值处于最低水平，这可能是因为蜂蜜中含有的有机酸向发酵液中转移，导致挥发酸、总酸均处于较高水平，增加了酒的醇厚感；酒中挥发酸的含量可以检测蓝莓酒的发酵过程是否得当[24]，3种蓝莓酒所测得的挥发酸含量均符合国标要求，表明发酵过程正常；游离SO2、总SO2指标在蜂蜜蓝莓酒与黄冰糖蓝莓酒中并无显著差异（P>0.05）。蜂蜜蓝莓酒色度值高于其他2个体系，这可能是因为蜂蜜中的类黄酮物质得到有效浸提，稳固蓝莓酒的色泽度，且蜂蜜蓝莓酒的感官评分处于最高水平，能够带来良好的风味体验。
2.3 不同糖源蓝莓酒抗氧化物质及抗氧化性测定结果比较
图3为不同糖源蓝莓酒抗氧化物质及抗氧化性对比结果。
图3 不同糖源蓝莓酒抗氧化物质及抗氧化性对比
Fig.3 Antioxidant substance and antioxidant comparison of different sugar source of blueberry wine
组间不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。A.不同糖源蓝莓酒抗氧化物质含量；B.不同糖源蓝莓酒抗氧化能力。
酚类化合物是影响蓝莓酒质量的重要因素，赋予了蓝莓酒独特的感官品质，其组成含量也与蓝莓酒品质密切相关。由图3A可知，蜂蜜蓝莓酒的总多酚、总黄酮、花青素含量最高，具有抗氧化作用，赋予果酒特殊的营养价值。蜂蜜蓝莓酒中的酒精含量高，有利于酚类物质的浸提[25]，因此蜂蜜蓝莓酒的总多酚含量最高；总黄酮与酒体的感官品质密切相关，能够与花青素中花色苷物质发生反应形成辐色效应[26]，蜂蜜蓝莓酒中的总黄酮含量最高，进而提高蓝莓酒色泽的稳定性；花青素主要存在于深色品种的蓝莓果皮中，是蓝莓酒呈色的主要化合物[27]，3种蓝莓酒中蜂蜜蓝莓酒的花青素含量最高。由图3B可知，蜂蜜蓝莓酒的抗氧化能力显著高于其他2组（P＜0.05），这与其抗氧化物质含量高有极大关联。
2.4 不同蓝莓酒指标的相关性分析
3种蓝莓酒考察指标的相关系数见表2。
表2 3种蓝莓酒考察指标的相关系数
Table 2 Three blueberry wine inspection index correlation coefficient
注：*表示显著相关（P＜0.05）；**表示极显著相关（P＜0.01）。
能力 色度 感官评分可溶性固形物项目 可溶性固形物酒精度 甲醇 pH值 挥发酸 总酸 游离SO2总SO2花青素 总多酚 总黄酮DPPH自由基清除率铁离子还原1酒精度 0.989* 1甲醇 0.847 0.916 1 pH值 -0.910-0.840-0.552 1挥发酸 0.961 0.910 0.668 -0.989* 1总酸 0.929 0.865 0.592 -0.999* 0.995* 1游离SO2-0.849-0.917-1.000**0.554 -0.670 -0.594 1总SO2 0.124-0.022-0.421-0.524 0.393 0.482 0.419 1花青素 0.786 0.687 0.337 -0.971 0.926 0.959 -0.340 0.711 1总多酚 0.886 0.808 0.504 -0.998* 0.979 0.995* -0.507 0.571 0.983 1总黄酮 0.904 0.832 0.539 -1.000** 0.987 0.998* -0.542 0.537 0.975 0.999* 1 DPPH自由基清除率0.992*0.963 0.774 -0.955 0.988* 0.968 -0.776 0.248 0.857 0.937 0.950 1铁离子还原能力0.946 0.888 0.630 -0.995* 0.999* 0.999* -0.632 0.439 0.944 0.988* 0.994* 0.979 1色度 0.852 0.766 0.444 -0.992* 0.963 0.985 -0.447 0.625 0.993*0.998* 0.994* 0.911 0.976 1感官评分 0.998*0.977 0.810 -0.936 0.978 0.952 -0.811 0.191 0.826 0.915 0.931 0.998* 0.966 0.886 1
由表2可知，蓝莓酒的可溶性固形物与酒精度、DPPH自由基清除率、感官评分呈显著正相关（P＜0.05）；甲醇与游离SO2呈极显著负相关（P＜0.01）；pH值与挥发酸、总酸、总多酚、铁离子还原能力、色度呈显著负相关（P＜0.05），与总黄酮呈极显著负相关（P＜0.05）；挥发酸与总酸、DPPH自由基清除率、铁离子还原能力呈显著正相关（P＜0.05）；总酸与总多酚、总黄酮、铁离子还原能力呈显著正相关（P＜0.05）；总多酚与总黄酮、铁离子还原能力、色度呈显著正相关（P＜0.05）；总黄酮与铁离子还原能力、色度呈显著正相关（P＜0.05）；DPPH自由基清除率与感官评分呈显著正相关（P＜0.05）。经过相关性分析，蓝莓酒各项考察指标之间存在独立性也有着密切的相关性[28]，不同信息之间有着一定程度的重叠，为了提高对蓝莓酒品质指标评价的准确性，有必要通过主成分分析将其相关性指标归类简化。
2.5 主成分分析
通过主成分分析对不同发酵工艺所测指标进行降维，以特征值λ＞1为依据进行因子抽提，主成分特征值及其贡献率见表3。图4为不同发酵体系考察指标主成分分析。
表3 主成分特征值及其贡献率
Table 3 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance
主成分 特征值 贡献率/% 累计贡献率/%1 12.378 82.523 82.523 2 2.147 14.317 96.840
图4 不同发酵体系考察指标主成分分析
Fig.4 Analysis of main components of different fermentation systems
A.载荷图；B.得分图。
由表3可知，得到最优的主成分数为2个，第一主成分的贡献率为82.523%，第二主成分的贡献率为14.317%，累计方差贡献率达到96.840%，能够有效地反映原数据的变异信息。
由图4A可知，花青素、总多酚、总黄酮、色度、DPPH自由基清除率、铁离子还原能力、总酸、挥发酸、可溶性固形物、酒精度与主成分 1（principal component 1，PC1）呈正相关，pH值与PC1呈负相关。游离SO2和总SO2与主成分 2（principal component 2，PC2）呈正相关。图4B的得分图可以发现其分布分散，说明这3种蓝莓酒的各指标有较大差异，且同种糖源在同区域[29-30]。结合图4A可知蜂蜜和蓝莓组合发酵与总多酚、总黄酮、花青素、色度、总酸、挥发酸有较大联系，表明该组合酚类物质多，含有丰富有机酸，抗氧化性能更好。
为了更直观地得出蓝莓酒的综合评价[31]，对两个主成分所表达的信息进行数据化处理，计算公式如下，根据下式得到表4。
表4 不同蓝莓酒成分得分及综合排名
Table 4 Scores and rankings of different blueberry wine
酒类 第一主成分得分第二主成分得分 综合得分 排名蜂蜜蓝莓酒1 4.23 0.80 3.60 1蜂蜜蓝莓酒2 3.77 1.15 3.27 3蜂蜜蓝莓酒3 3.88 1.17 3.37 2黄冰糖蓝莓酒1 0.27 -2.32 -0.11 5黄冰糖蓝莓酒2 0.08 -1.63 -0.16 6黄冰糖蓝莓酒3 0.22 -1.85 -0.09 4不加糖蓝莓酒1 -4.16 0.87 -3.30 8不加糖蓝莓酒2 -4.19 0.92 -3.32 9不加糖蓝莓酒3 -4.11 0.89 -3.26 7
式中：Z为综合得分；Y1、Y2为对应主成分得分；X1～X15为各指标原始变量的标准变量。
由表4可知，蜂蜜蓝莓酒3个样品得分高，排在前3名，再结合主成分分析图可知蜂蜜蓝莓酒的酚类物质及抗氧化性都很突出，整体呈色好，感官评分也最高，即品质最好。
3 结论
本试验以蓝莓为原料，通过添加蜂蜜、黄冰糖和不加糖的3种工艺进行发酵处理，考察其理化指标，对比抗氧化物质含量和抗氧化性能。研究结果发现：3种工艺中蜂蜜和蓝莓组合发酵方式最好，能够得到11.60%vol的酒精度且适当的可溶性固形物可以改善酒体单薄现象，使其更加醇厚；蜂蜜蓝莓酒的总酸、挥发酸含量最高且3种不同工艺之间表现出明显差异，其中有机酸成分能够为酒体带来酸甜可口的典型风味；蜂蜜蓝莓酒的色泽品质高于其他2种，是因为蜂蜜中的酚酸类物质能够增强颜色的稳定性；总多酚、总黄酮、花青素含量均高于其他2种，DPPH自由基清除率和铁离子还原能力测定的抗氧化性能均显著高于其他2种。通过相关性分析和主成分分析可知各个指标之间存在相关性，其中酚类物质和抗氧化性能参数密切相关，有效保证蜂蜜蓝莓酒的营养物质。综上，蜂蜜和蓝莓组合发酵能够提升蓝莓酒中酚类物质的含量，提高其抗氧化性能，改善酒体色泽，且感官评分处于较高水平。本研究为今后推广蜂蜜和蓝莓的深加工提供新思路，为后续进一步优化组合发酵工艺提供参考。
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